Name: vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus
Uploaded: 2020-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus at JoVE.com

Wir danken den Mitarbeitern des World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton und Divya Mirchandani, für ihre unermüdliche Arbeit bei der Kuratierung und Bereitstellung vieler der Virusstämme, die für die Vektorkompetenzexperimente unserer und anderer Gruppen verwendet werden. Die vorgestellten Arbeiten wurden durch den McLaughlin Fellowship Fund (SRA) und die NIH-Zuschüsse AI120942 und AI121452 finanziert.

Alle in diesen Protokollen durchgeführten Verfahren wurden in voller Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Biosafety Committee und dem Institutional Animal Care and Use Committee der University of Texas Medical Branch in Galveston genehmigt wurden.
1. ZIKV in Vero-Zellen verstärken
<ol><li>Züchten Sie Vero-Zellen (CCL-81 oder VeroE6) in Dulbeccos Modifikation von Eagles minimal essentiellem Medium (DMEM), ergänzt mit 10% v/v hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS) und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin (100 U/ml bzw. 100 μg/ml) in einem befeuchteten 37 °C-Inkubator mit 5%CO2 bis 80−90% Konfluenz in einem 150 cm2 Gewebekulturkolben.</li>
	<li>Entfernen Sie in einer Biosicherheitswerkbank (BSC) das Medium und entsorgen Sie es entweder in 10% Bleichmittel oder einer Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium (Materialtabelle). Impfen Sie die Monoschicht sofort mit 1 ml Virusbestand, mit dem Ziel, 0,1−1 infektiöse Viruspartikel pro Zelle zu erhalten. Den Kolben sofort so rühren, dass das Inokulum die Monoschicht in seiner Gesamtheit berührt.</li>
	<li>Füllen Sie das Medium auf ein Volumen von 5 ml mit DMEM auf, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Dann den Kolben für 60 min in den befeuchteten 37 °C Inkubator mit5% CO2 geben.</li>
	<li>Nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator und bringen Sie ihn in ein BSC. Fügen Sie zusätzliches Medium zu einem Gesamtvolumen von 15 ml hinzu, indem Sie DMEM verwenden, das mit 2% v / v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v / v) Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Den Kolben in einen befeuchteten 37 °C Inkubator mit 5 %CO2 stellen.</li>
	<li>Untersuchen Sie den Kolben täglich unter Phasenkontrastmikroskopie auf Hinweise auf zytopathische Wirkungen (CPE). Fahren Sie mit der Virusernte (Schritt 1.7) fort, wenn nur etwa 40-50% der Zellen in der Monoschicht verbleiben, in der Regel 3-5 Tage nach der Infektion, abhängig vom verwendeten ZIKV-Stamm.</li>
	<li>Den Überstand ansaugen und in eine konische Durchstechflasche mit 50 ml geben. Klären Sie den Überstand von Zelltrümmern durch Zentrifugation (3.500 x g für 20 min). HINWEIS: Wenn mehrere Kolben identisch infiziert waren, können Überstände aus mehreren Kolben zu konischen 50-ml-Röhrchen kombiniert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand aus dem konischen 50-ml-Rohr zu einem frischen und achten Sie darauf, das Pellet nicht zu stören. Ergänzen Sie den Überstand mit wärmeinaktiviertem FBS bis zu einer Endkonzentration von 30% (v/v). Aliquotieren Sie diese Mischung in einzelne Schraubverschlussrohre und frieren Sie bei -80 °C bis zum Gebrauch ein.</li>
</ol>2. Herstellung von künstlichen Blutmehlen
<ol><li>An dem Tag, an dem Moskitos infektiösen Blutmehlen ausgesetzt werden sollen, schalten Sie die Stromquelle ( Table of Materials ) in einer Arthropoden-Eindämmungseinrichtung so ein, dass die Fütterungseinheiten (Table of Materials) vorgewärmt sind, wenn die Moskitos für die Exposition vorbereitet sind.</li>
	<li>Bereiten Sie künstliche Blutmehle mit einer der unten beschriebenen Methoden vor.<ol>
<li>Methode 1: Frisch geerntetes (innerhalb einer Woche) zitriertes oder heparinisiertes menschliches Blut, das im Handel gekauft wurde, 1:1 v/v mit Virusmaterial (hergestellt wie in Abschnitt 1 beschrieben) kombinieren. HINWEIS: Diese Methode ist davon abhängig, dass im Blut keine Antikörper gegen das Virus/die Virusfamilie vorhanden sind.</li>
		<li>Wenn das Fehlen von Antikörpern nicht bestätigt werden kann oder bekannt ist, dass die Blutquelle zuvor flavivirusexpositioniert ist, waschen und verpacken Sie die Erythrozyten manuell.<ol>
<li>In einem BSC 30 ml menschliches Vollblut in ein 50 mL konisches Rohr geben und bis zu 50 ml mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auffüllen.</li>
			<li>Zentrifuge bei 3.500 x g für 20 min.</li>
			<li>Aspirieren Sie den Überstand entweder durch vorsichtiges Gießen in eine Schalenpfanne, die entweder 10% Bleichmittel enthält, oder durch Arbeitsverdünnung von dualem quartärem Ammonium, wobei darauf zu achten ist, dass das Erythrozytenpellet nicht verworfen wird.</li>
			<li>Fügen Sie 10 ml PBS hinzu und klopfen Sie vorsichtig auf den Boden des konischen Röhrchens gegen den Boden des BSC, so dass das Erythrozytenpellet rekonstituiert wurde. Bringen Sie das Volumen der Suspension mit PBS auf bis zu 50 ml. Durch sanfte Inversion mischen.</li>
			<li>Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2.1−2.2.2.4 insgesamt 4−6x. Bestätigen Sie, dass der Überstand klar oder nur leicht rosa und nicht mehr undurchsichtig ist. Entfernen Sie den gesamten Überstand mit einer serologischen Pipette. Resuspendieren Sie das Erythrozytenpellet in 1−2 ml PBS.</li>
			<li>Setzen Sie das Blutmehl zusammen: 350 μL gepackte Erythrozyten, 100 μL 10% Saccharose, 200 μL hitzeinaktiviertes FBS, 900 μM rekombinantes ATP und 2 ml entsprechend verdünntes Virusmaterial unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v hitzeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überlagern Sie eine Standard-3-ml-Reservoireinheit(Materialtabelle)mit der Haut einer nicht infizierten Maus (andere Optionen umfassen Paraffinfilm, kollagene Membranen oder Wursthülle).</li>
	<li>Legen Sie den überdachten Behälter auf weiße Papiertücher. Fügen Sie ~ 2 ml infektiöses Blutmehl zu dem Reservoir 1 ml auf einmal hinzu. Untersuchen Sie das Handtuch unter dem Feeder auf Anzeichen von Leckagen. Wenn Leckagen vorhanden sind, holen Sie das Blutmehl aus den Feedern zurück und entsorgen Sie die Abdeckungen. Verschließen Sie die Feeder mit Stopfen. Bestätigen Sie erneut, dass keine Lecks vorhanden sind.</li>
</ol>3. Backtitration von Blutmehl/Plaque-Assay
<ol><li>Unter Verwendung des verbleibenden Volumens des vorbereiteten Blutmehls wird eine 10-fache serielle Verdünnungsreihe (d. h. 6 Verdünnungen, die von 10x bis 1.000.000x verdünnt sind) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 2% v/v wärmeinaktiviertem FBS und 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin, durchgeführt.</li>
	<li>Aliquot 100 μL der Verdünnungen in die Vertiefungen von 24 oder 12 Well Platten von den am meisten verdünnten bis zu den konzentriertesten.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 1 h in einem 37 °C, 5% CO2 Inkubator.</li>
	<li>Am Ende der 1-stündigen Inkubationszeit werden die Platten wieder in das BSC gebracht und 1 ml oder 2 ml Methylcellulose-Overlay entsprechend in die 24 Well- oder 12 Well-Platten gegeben.</li>
	<li>Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie für 3-7 Tage (virusstammabhängig).</li>
	<li>Nach der Inkubation die Platten aus dem Inkubator entfernen und in den BSC bringen. Entsorgen Sie das Methylcellulose-Overlay in eine Schalenpfanne, die 10% Bleichmittel oder duales quartäres Ammoniumdesinfektionsmittel enthält.</li>
	<li>Waschen Sie jede Vertiefung 2x mit PBS und entsorgen Sie die Wäsche in eine Schalenpfanne mit 10% Bleichmittel oder dualem quartärem Ammonium.</li>
	<li>Fügen Sie ~ 1 ml Methanol: Aceton (1: 1 v: v) hinzu und lassen Sie die Zellen mindestens 30 minuten lang im BSC bei Raumtemperatur (RT) auf der Platte fixieren. Entsorgung von Methanol:Aceton gemäß der institutionellen Politik für organische Abfälle.</li>
	<li>Visualisieren Sie ZIKV mit einer von zwei unten beschriebenen Methoden.<ol>
<li>Nach der Entfernung von Methanol:Aceton sofort mit einer kristallvioletten Lösung (0,25% w/v in 30% Methanol) für 5 min einfärben. 2x in Leitungswasser abspülen und trocknen lassen, dann direkt mit dem Auge sichtbar machen, um Hinweise auf Plaques oder Zerstörung der Monoschicht zu erhalten.</li>
		<li>Alternativ können Sie einen Fokusformungsassay durchführen.<ol>
<li>Lassen Sie die Platten an der Luft trocknen, bis kein organisches Fixiermittel mehr übrig ist. HINWEIS: Dies sollte ~ 2−3 h außerhalb des BSC dauern, kann aber durch Lufttrocknung in einem BSC oder chemischen Abzug beschleunigt werden.</li>
			<li>Jede Vertiefung 3x für jeweils 15 min in nichtsterilem PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen. Entfernen Sie PBS und geben Sie 1 ml Blockierungslösung (PBS + 3% FBS) zu jeder Vertiefung und gestein für 15 min bei RT.</li>
			<li>100 μL pro Vertiefung α-ZIKV- oder α-Flavivirus-Primärantikörper (z. B. Flavivirus-Gruppenhybrioma D1-4G2-4-15 [4G2]) in einer Verdünnung von 1:2.000 in Blocklösung zugeben. Inkubieren mit Schaukeln für mindestens 4 h (vorzugsweise über Nacht, nicht mehr als 18 h) bei RT.</li>
			<li>Den primären Antikörper entfernen und 3x für jeweils 15 min mit PBS(Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.</li>
			<li>Fügen Sie 100 μL pro Vertiefung des sekundären Antikörpers (Ziegen- α Maus-HRP-markiert) hinzu, der 1:2.000 in blocking buffer verdünnt ist. Inkubieren Sie mit Schaukeln für 1 h bei RT.</li>
			<li>3x für je 15 min mit PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) auf einer Orbitalplattenwippe waschen.</li>
			<li>Aliquot 100 μL Substratentwicklungsreagenz (Materialtabelle) pro Vertiefung. Gesteinsplatten bei RT für 15 min.</li>
			<li>Stoppen Sie die Reaktion bei der Entwicklung von Herden / Plaques, indem Sie das Substrat entfernen und die Platten 2x mit Leitungswasser spülen. Gießen Sie Leitungswasser ab und lassen Sie die Platten vor der Quantifizierung an der Luft trocknen.</li>
			<li>Zählen Sie virale Herde, um die Anzahl der in der gegebenen Probe vorhandenen FFU zu bestimmen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Verabreichung von Blutmehl
<ol><li>Verwenden Sie Ae. aegypti Moskitos 2-4 Tage nach der Eklosion. Sortieren Sie weibliche Moskitos in 0,5-Liter-Kartons mit abgeschirmten Deckeln und entziehen Sie ihnen Zucker (im Allgemeinen 36-48 h vor dem infektiösen Blutmehl). Geben Sie ad libitum Wasser über wassergesättigte Wattebällchen.</li>
	<li>Entfernen Sie die wassergesättigten Wattebällchen an dem Morgen, an dem die Moskitos dem infektiösen Blutmehl ausgesetzt sind.</li>
	<li>Befestigen Sie Behälter mit künstlichen Blutmehlen an den Leitungen der Fütterungseinheit in einem durchsichtigen Kunststoffhandschuhfach.</li>
	<li>Legen Sie im Handschuhfach einen 0,5-Liter-Karton mit einem abgeschirmten Deckel mit 50−100 ausgehungerten Ae. aegypti-Mücken unter die am Reservoir befestigte Futtereinheit. HINWEIS: Entsprechend ausgehungerte Moskitos fressen in der Regel innerhalb von 20 Minuten. Die Fütterung kann bei Bedarf verlängert werden, um die Stichprobengröße in langsameren Populationen zu erhöhen, obwohl dies nicht über 60 minuten hinausgehen sollte, da der (ZIKV) Virustiter nach ~ 60 minuten im Feeder abnehmen kann.</li>
	<li>Nach Abschluss der Fütterung entfernen Sie das Reservoir und tauchen Sie es in frisch hergestelltes 10% Bleichmittel ein.</li>
	<li>Kaltanästhesieren Sie Moskitos durch Inkubation für 30 s bei -20 ° C oder für 5 minuten im Kühlschrank.</li>
	<li>Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Zählen und sortieren Sie die geschwollenen Weibchen von ungeschmiedeten Moskitos. Entsorgen Sie die ungefederten Moskitos durch Eintauchen in ein 50 ml langes konisches Röhrchen, das mit 70% Ethanol gefüllt ist. Während die Moskitos noch betäubt sind, gießen Sie sie zurück in den 0,5 L Karton und decken Sie sie schnell mit dem Bildschirm und dem Deckel ab. Schneiden Sie überschüssiges Siebnetz vom Karton ab und sichern Sie das Netz mit Klebeband.</li>
	<li>Fügen Sie einen Wattebausch hinzu, der mit steriler gefilterter 10% wässriger Saccharose gesättigt ist, zum Sieb jedes Kartons. Legen Sie alle Mückenkartons in einen großen Sekundärbehälter aus Kunststoff mit einem feuchten Schwamm, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten.</li>
	<li>Stellen Sie einen sekundären Behälter mit Kartons mit Moskitos in einen Inkubator mit einer Temperatur von 27 ± 1 ° C (oder je nach Bedarf zur Simulation von Bedingungen in der Region von Interesse) mit 80% ± 10% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 16: 8 Hell: Dunkel-Zyklus). Halten Sie die Moskitos mit Ad-libitum-Zugang zu 10% Saccharose bis zum Abschluss der Experimente aufrecht.</li>
</ol>5. Probenentnahme und -verarbeitung
<ol><li>An bestimmten Tagen nach der Fütterung saugen Sie eine vorbestimmte Anzahl von Moskitos aus den entsprechenden Kartons mit einem mechanischen Aspirator in einem Handschuhfach ab. Schließen Sie das Auffangrohr mit einer Baumwollrunde ab, nachdem die erforderliche Anzahl von Moskitos erworben wurde.</li>
	<li>Kaltanästhesie von Moskitos durch Inkubation für 30 Sekunden bei -20 ° C oder für 5 Minuten bei 4 ° C.</li>
	<li>Gießen Sie die Moskitos im Handschuhfach in eine Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit zwei Pinzettenpaaren alle sechs Beine jeder Mücke und legen Sie sie in ein voretikettiertes 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Edelstahlkugellager (7/32 ") und 500 μL Mückensammelmedium (MCM), bestehend aus DMEM, 2% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin und 2,5 μg / ml Amphotericin.</li>
	<li>Legen Sie die Mücke vorsichtig auf einen Tropfen Mineralöl, um sie zurückzuhalten, und achten Sie darauf, dass kein Kontakt zwischen dem Öl und dem Kopf und dem Rüssel der Mücke zulässt.</li>
	<li>Führen Sie den Mückenboss in eine 10 μL Pipettenspitze ein, die mit 10 μL wärmeinaktiviertem FBS gefüllt ist. HINWEIS: Alternativ kann die Pipette mit Saccharose, Blut oder Mineralöl gefüllt werden. Das Öl ermöglicht die direkte Visualisierung von Speichelblasen mittels Lichtmikroskopie.</li>
	<li>Lassen Sie die Mücke 30 Minuten lang speicheln. Werfen Sie die Mikropipettenspitze, die FBS + Speichel enthält, in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL MCM aus und legen Sie dann den Korpus in ein separates 2 ml rundes Mikrozentrifugenrohr mit einem sterilisierten Stahlkugellager und 500 μL MCM. Stellen Sie sicher, dass die für Körper, Beine und Speichel verwendeten Röhrchen so gekennzeichnet sind, dass klar ist, dass alle drei Proben von derselben Mücke stammen.</li>
	<li>Während die Mücken speicheln, führen Sie die Schritte 5,3-5,5 bei den verbleibenden Moskitos durch.</li>
	<li>Transportieren Sie die Röhrchen, die die Körper und Beine enthalten, zu einer Homogenisierungsvorrichtung für das Perlenmahlgewebe, die in einem BSC enthalten ist. Alle Körper- und Beinproben bei 26 Hz für 5 min verdrieren, um virale Partikel in den Überstand freizusetzen. Klären Sie alle Proben durch Zentrifugation bei 200 x g für 5 min, um Zelltrümmer zu pelletieren. HINWEIS: Zu diesem Zeitpunkt können die Proben bei -80 °C eingefroren oder sofort untersucht werden.</li>
</ol>6. Nachweis von ZIKV durch Infektiologie-Assay
<ol><li>Bereiten Sie in einem BSC 24 h vor Beginn des infektiösen Assays 24 Well-Gewebekulturplatten mit Vero-Zellen (105 Zellen pro Well) vor. Beschriften Sie jede Vertiefung mit der Identität einer einzelnen Mücke / Probe.</li>
	<li>Wenn die Proben bei -80 °C eingefroren wurden, lassen Sie sie auftauen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium vor der Impfung mit Proben eine Platte nach der anderen von den Vero-Zellplatten.</li>
	<li>Bei Proben, die Körper oder Beine enthalten, vorsichtig 100 μL geklärten Überstand in jede Vertiefung aliquotieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Mückenzellablagerungen aus dem Pellet nicht gestört werden. HINWEIS: Speichelproben können vor der Impfung auf Zellen 1:1 (v/v) mit MCM verdünnt werden, um die Proben für eine spätere Titration zu konservieren, falls erforderlich.</li>
	<li>Die Platten in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator geben und 1 h inkubieren.</li>
	<li>Bringen Sie die Platten zum BSC zurück und fügen Sie ~ 1 ml Methylcellulose-Overlay zu jeder Vertiefung hinzu. Legen Sie die überlagerten Platten wieder in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator und inkubieren Sie sie für 3−7 Tage (virus-/stammabhängig).</li>
	<li>Führen Sie die Fixierung und Visualisierung wie in den Schritten 3.6 bis 3.9 beschrieben durch.</li>
	<li>Quantifizieren Sie in Bezug auf das Scoring über einen Fokusformungsassay die positiven Vertiefungen durch Untersuchung unter einem Lichtmikroskop. Der Nachweis einer intrazytoplasmatischen Färbung von Zellen in einem Brunnen weist auf das Vorhandensein eines Virus hin. Stichproben werden ausschließlich als Fokus-positiv oder -negativ bewertet.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Azar, S. R., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vector+Competence:+What+Has+Zika+Virus+Taught+Us.">Vector Competence: What Has Zika Virus Taught Us.</a> Viruses. 11 (9), 867 (2019).</li><li>Souza-Neto, J. A., Powell, J. R., Bonizzoni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+aegypti+vector+competence+studies:+A+review.">Aedes aegypti vector competence studies: A review.</a> Infection, Genetics and Evolution. 67, 191-209 (2019).</li><li>Smith, D. R., Adams, A. P., Kenney, J. L., Wang, E., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+in+the+Mosquito+Vector+Aedes+taeniorhynchus:+Infection+Initiated+by+a+Small+Number+of+Susceptible+Epithelial+Cells+and+a+Population+Bottleneck.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mosquito Vector Aedes taeniorhynchus: Infection Initiated by a Small Number of Susceptible Epithelial Cells and a Population Bottleneck.</a> Virology. 372 (1), 176-186 (2008).</li><li>Forrester, N. L., Coffey, L. L., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arboviral+bottlenecks+and+challenges+to+maintaining+diversity+and+fitness+during+mosquito+transmission.">Arboviral bottlenecks and challenges to maintaining diversity and fitness during mosquito transmission.</a> Viruses. 6 (10), 3991-4004 (2014).</li><li>Kramer, L. D., Ciota, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+vectorial+capacity+for+mosquito-borne+viruses.">Dissecting vectorial capacity for mosquito-borne viruses.</a> Current Opinion in Virology. 15, 112-118 (2015).</li><li>Kramer, L. D., Hardy, J. L., Presser, S. B., Houk, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+Barriers+for+Western+Equine+Encephalomyelitis+Virus+in+Culex+tarsalis+infected+after+Ingestion+of+Low+Viral+Doses.">Dissemination Barriers for Western Equine Encephalomyelitis Virus in Culex tarsalis infected after Ingestion of Low Viral Doses.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 30 (1), 190-197 (1981).</li><li>Lounibos, L. P., Kramer, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasiveness+of+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus+and+Vectorial+Capacity+for+Chikungunya+Virus.">Invasiveness of Aedes aegypti and Aedes albopictus and Vectorial Capacity for Chikungunya Virus.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214, 453-458 (2016).</li><li>Heitmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+Salivation+as+a+Method+to+Analyze+Vector+Competence+of+Mosquitoes.">Forced Salivation as a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57980 (2018).</li><li>Beerntsen, B. T., James, A. A., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Mosquito+Vector+Competence.">Genetics of Mosquito Vector Competence.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 115-137 (2000).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+quinquefasciatus:+a+potential+vector+to+transmit+Zika+virus.">Culex pipiens quinquefasciatus: a potential vector to transmit Zika virus.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 5 (9), 102 (2016).</li><li>Secundino, N. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+transmission+to+mouse+ear+by+mosquito+bite:+a+laboratory+model+that+replicates+the+natural+transmission+process.">Zika virus transmission to mouse ear by mosquito bite: a laboratory model that replicates the natural transmission process.</a> Parasites &amp; Vectors. 10 (1), 346 (2017).</li><li>Smith, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Venezuelan+Equine+Encephalitis+Virus+Transmission+and+Effect+on+Pathogenesis.">Venezuelan Equine Encephalitis Virus Transmission and Effect on Pathogenesis.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (8), 1190-1196 (2006).</li><li>Lazear, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+of+Zika+Virus+Pathogenesis.">A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis.</a> Cell Host Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).</li><li>Morrison, T. E., Diamond, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Zika+Virus+Infection,+Pathogenesis,+and+Immunity.">Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity.</a> Journal of Virology. 91 (8), 9-17 (2017).</li><li>Reynolds, E. S., Hart, C. E., Hermance, M. E., Brining, D. L., Thangamani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+Animal+Models+for+Arthropod-Borne+Viruses.">An Overview of Animal Models for Arthropod-Borne Viruses.</a> Comparative Medicine. 67 (3), 232-241 (2017).</li><li>Rossi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Novel+Murine+Model+to+Study+Zika+Virus.">Characterization of a Novel Murine Model to Study Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (6), 1362-1369 (2016).</li><li>Styer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquitoes+inoculate+high+doses+of+West+Nile+virus+as+they+probe+and+feed+on+live+hosts.">Mosquitoes inoculate high doses of West Nile virus as they probe and feed on live hosts.</a> PLoS Pathogens. 3 (9), 1262-1270 (2007).</li><li>Azar, S. R., Diaz-Gonzalez, E. E., Danis-Lonzano, R., Fernandez-Salas, I., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naturally+infected+Aedes+aegypti+collected+during+a+Zika+virus+outbreak+have+viral+titres+consistent+with+transmission.">Naturally infected Aedes aegypti collected during a Zika virus outbreak have viral titres consistent with transmission.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 8 (1), 242-244 (2019).</li><li>Dzul-Manzanilla, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+vertical+transmission+and+co-circulation+of+chikungunya+and+dengue+viruses+in+field+populations+of+Aedes+aegypti+(L.)+from+Guerrero,+Mexico.">Evidence of vertical transmission and co-circulation of chikungunya and dengue viruses in field populations of Aedes aegypti (L.) from Guerrero, Mexico.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 110 (2), 141-144 (2016).</li><li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+Gabon+(Central+Africa)+&#8211;+2007:+a+new+threat+from+Aedes+albopictus.">Zika virus in Gabon (Central Africa) &#8211; 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681 (2014).</li><li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+epidemiology+reveals+multiple+introductions+of+Zika+virus+into+the+United+States.">Genomic epidemiology reveals multiple introductions of Zika virus into the United States.</a> Nature. 546 (7658), 401-405 (2017).</li><li>Guerbois, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbreak+of+Zika+Virus+Infection,+Chiapas+State,+Mexico,+2015,+and+First+Confirmed+Transmission+by+Aedes+aegyti+Mosquitoes+in+the+America.">Outbreak of Zika Virus Infection, Chiapas State, Mexico, 2015, and First Confirmed Transmission by Aedes aegyti Mosquitoes in the America.</a> The Journal of Infectious Diseases. 214 (9), 1349-1356 (2016).</li><li>Lundstrom, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sindbis+virus+polyarthritis+outbreak+signalled+by+virus+prevalence+in+the+mosquito+vectors.">Sindbis virus polyarthritis outbreak signalled by virus prevalence in the mosquito vectors.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 13 (8), 0007702 (2019).</li><li>Miller, B. R., Monath, T. P., Tabachnik, W. J., Ezike, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemic+yellow+fever+caused+by+an+incompetent+mosquito+vector.">Epidemic yellow fever caused by an incompetent mosquito vector.</a> Tropical Medicine and Parasitology. 40 (4), 396-399 (1989).</li><li>Brown, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+Mosquito+Traps+in+Measuring+Species+Abundance+and+Composition.">Effectiveness of Mosquito Traps in Measuring Species Abundance and Composition.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (3), 517-521 (2008).</li><li>Gorsich, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+assessment+of+adult+mosquito+trapping+methods+to+estimate+spatial+patterns+of+abundance+and+community+composition+in+southern+Africa.">A comparative assessment of adult mosquito trapping methods to estimate spatial patterns of abundance and community composition in southern Africa.</a> Parasites &amp; Vectors. 12 (1), 462 (2019).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZIKV+Demonstrates+Minimal+Pathologic+Effects+and+Mosquito+Infectivity+in+Viremic+Cynomolgus+Macaques.">ZIKV Demonstrates Minimal Pathologic Effects and Mosquito Infectivity in Viremic Cynomolgus Macaques.</a> Viruses. 10 (11), 661 (2018).</li><li>Azar, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Vector+Competency+of+Aedes+albopictus+Populations+from+the+Americas+for+Zika+Virus.">Differential Vector Competency of Aedes albopictus Populations from the Americas for Zika Virus.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (2), 330-339 (2017).</li><li>Hanley, K. A., Azar, S. R., Campos, R. K., Vasilakis, N., Rossi, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Support+for+the+Transmission-Clearance+Trade-Off+Hypothesis+from+a+Study+of+Zika+Virus+Delivered+by+Mosquito+Bite+to+Mice.">Support for the Transmission-Clearance Trade-Off Hypothesis from a Study of Zika Virus Delivered by Mosquito Bite to Mice.</a> Viruses. 11 (11), 1072 (2019).</li><li>Hart, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+Virus+Vector+Competency+of+Mosquitoes,+Gulf+Coast,+United+States.">Zika Virus Vector Competency of Mosquitoes, Gulf Coast, United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (3), 559-560 (2017).</li><li>Karna, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colonized+Sabethes+cyaneus,+a+Sylvatic+New+World+Mosquito+Species,+Shows+a+Low+Vector+Competence+for+Zika+Virus+Relative+to+Aedes+aegypti.">Colonized Sabethes cyaneus, a Sylvatic New World Mosquito Species, Shows a Low Vector Competence for Zika Virus Relative to Aedes aegypti.</a> Viruses. 10 (8), 434 (2018).</li><li>Roundy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+Aedes+aegypti+Mosquito+Competence+for+Zika+Virus+Transmission.">Variation in Aedes aegypti Mosquito Competence for Zika Virus Transmission.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (4), 625-632 (2017).</li><li>Wilson, A. J., Harrup, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+and+relevance+in+insect-arbovirus+infection+studies.">Reproducibility and relevance in insect-arbovirus infection studies.</a> Current Opinion in Insect Science. 28, 105-112 (2018).</li><li>Hagan, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dehydration+prompts+increased+activity+and+blood+feeding+by+mosquitoes.">Dehydration prompts increased activity and blood feeding by mosquitoes.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6804 (2018).</li><li>Guo, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Feeding+Patterns+of+Mosquitoes+in+a+Rural+Malaria-Endemic+Region+in+Hainan+Island,+China.">Host Feeding Patterns of Mosquitoes in a Rural Malaria-Endemic Region in Hainan Island, China.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 30 (4), 309-311 (2014).</li><li>Kuno, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+history+of+laboratory+breeding+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+focusing+on+the+origins+and+use+of+selected+strains.">Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains.</a> Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).</li><li>Mayilsamy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+Long+Viability+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae)+Eggs+Stored+Under+Normal+Room+Condition.">Extremely Long Viability of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) Eggs Stored Under Normal Room Condition.</a> Journal of Medical Entomology. 56 (3), 878-880 (2019).</li><li>Althouse, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+Zika+Virus+to+Establish+a+Sylvatic+Transmission+Cycle+in+the+Americas.">Potential for Zika Virus to Establish a Sylvatic Transmission Cycle in the Americas.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (12), 0002055 (2016).</li><li>Vasilakis, N., Cardosa, J., Hanley, K. A., Holmes, E. C., Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fever+from+the+forest:+prospects+for+the+continued+emergence+of+sylvatic+dengue+virus+and+its+impact+on+public+health.">Fever from the forest: prospects for the continued emergence of sylvatic dengue virus and its impact on public health.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (7), 532-541 (2011).</li><li>Vasilakis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+ancestral+sylvatic+dengue-2+viruses+to+re-emerge.">Potential of ancestral sylvatic dengue-2 viruses to re-emerge.</a> Virology. 358 (2), 402-412 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die hier beschriebenen Methoden bieten einen verallgemeinerten Workflow zur Durchführung von Vektorkompetenzanalysen. Als allgemeiner Rahmen sind viele dieser Methoden in der Literatur erhalten. Es gibt jedoch erheblichen Spielraum für Änderungen (überprüft in Azar und Weaver1). Virus (z. B. virale Abstammung, Speicherung des Challenge-Virus, virale Passage-Geschichte), Entomologie (z. B. Laborbesiedlung von Mückenpopulationen, angeborene Immunität, das Mückenmikrobiom / -virom) und experimentelle Variablen (z. B. Blutmehlzusammensetzung, sequentielle Blutfütterung und Inkubationstemperatur) sind alle dafür bekannt, die Vektorkompetenz zu beeinflussen. Die methodische Variabilität in Kompetenzstudien hat sich im Kontext des ZIKV-Ausbruchs als problematisch erwiesen, da sie formale Metaanalysen ausgeschlossen hat1,33.
Innerhalb dieser allgemeinen Methodik kann die Bedeutung des angemessenen Hungers von Moskitos und Blutmehl-Make-up nicht genug betont werden. Es ist bekannt, dass Dehydration das Blutfütterungsverhalten von Moskitos in Laborparadigmen34antreibt, was den Wert von Zucker- und Wassermangel unterstreicht, bevor ein infektiöses Blutmehl angeboten wird. Während der Entzug von Zucker für 36-48 h und Wasser für 2-4 h vor der Exposition gegenüber dem Blutmehl von Ae. aegyptigut vertragen wird, ist es erwähnenswert, dass diese Moskitos unter Laborbedingungen notorisch leicht zu verarbeiten sind2. Solche aggressiven Hungerregime werden von anderen Mückenarten möglicherweise nicht annähernd so gut vertragen, was ein gewisses Maß an interner Optimierung erfordert. Ebenso kann der Blutmehlgehalt durch die Präferenz des Wirts informiert werden. Zum Beispiel ist die Verwendung von menschlichem Blut zur Herstellung eines Blutmehls für anthropophile Moskitos wie Ae. aegypti durchaus angemessen, aber menschliche Blutmehle, die für ornithophile Arten wie Culex quinquefasciatus hergestellt werden, können sich als weniger wirksamerweisen 35. Darüber hinaus ist in Bezug auf die Blutmehlmontage die Verwendung von relativ frischen Blutprodukten sehr ratsam, um die Hämolyse von Erythrozyten zu minimieren.
Eine der größten Einschränkungen der Vektorkompetenzbewertung als Ganzes und der hier beschriebenen Verfahren besteht darin, dass diese Studien weitgehend auf die Untersuchung von Viren mit Moskitos beschränkt sind, die unter Laborbedingungen aufrechterhalten werden können. Ae. aegypti, obwohl ein hochrelevanter Vektor für eine Vielzahl von Krankheitserregern von klinischer Bedeutung, ist auch eine der am einfachsten zu züchtenden und zu pflegenden Moskitos in Laborkolonien1,31,36,37. Es überrascht nicht, dass die Kompetenz von Ae. aegypti-Populationen daher oft die am besten charakterisierte unter den gewöhnlichen Vektormückenist 2. Dies ist besonders problematisch im Zusammenhang mit Arboviren, die sowohl enzootische als auch städtische Übertragungszyklenaufrechterhalten 38,39,40, da die Vektorkompetenz in der Regel nur im Kontext der besser beherrschbaren städtischen Mücken durchgeführt wird.

Vektorkompetenz ist definiert als die Fähigkeit auf der Ebene der Art, der Population und sogar eines Individuums eines bestimmten Arthropoden wie einer Mücke, Zecke oder Phlebotin-Sandfliege, einen Wirkstoff biologisch mit Replikation oder Entwicklung im Arthropoden zu erwerben und zu übertragen1,2. In Bezug auf Moskitos und durch Arthropoden übertragene Viren (dh Arboviren) wird das Mittel von einem virämischen Wirt von einer weiblichen Mücke aufgenommen. Nach der Einnahme muss das Virus produktiv eine aus einer kleinen Population von Mitteldarmepithelzellen infizieren3und verschiedene physiologische Hindernisse wie den proteolytischen Abbau durch Verdauungsenzyme, das Vorhandensein der Mikrobiota (Mitteldarminfektionsbarriere oder MIB) und die sezernierte peritrophe Matrix überwinden. Auf die Infektion des Mitteldarmepithels muss eine Replikation des Virus und ein eventueller Austritt aus dem Mitteldarm in das offene Kreislaufsystem der Mücke oder Hämolymphe folgen, was den Beginn einer disseminierten Infektion darstellt, die die Mitteldarmfluchtbarriere (MEB) überwindet. Zu diesem Zeitpunkt kann das Virus Infektionen von sekundärem Gewebe (z. B. Nerven, Muskeln und Fettkörper) aufbauen und sich weiter replizieren, obwohl eine solche sekundäre Replikation möglicherweise nicht unbedingt notwendig ist, damit das Virus die Azinuszellen der Speicheldrüsen infizieren kann (Überwindung der Speicheldrüseninfektionsbarriere). Der Austritt aus den Acinarzellen der Speicheldrüse in ihre apikalen Hohlräume und die anschließende Bewegung in den Speichelgang ermöglicht die Impfung des Virus in nachfolgende Wirte beim Beißen und schließt den Übertragungszyklus1,2,4,5,6,7ab .
Angesichts dieses gut charakterisierten und allgemein erhaltenen Ausbreitungsmechanismus innerhalb eines Mückenvektors sind Laborvektor-Kompetenzbewertungen oft methodisch ähnlich, obwohl Unterschiede in den Protokollen bestehen1,2. Im Allgemeinen werden Moskitos nach oraler Virusexposition so seziert, dass einzelne Gewebe wie Mitteldarm, Beine, Eierstöcke oder Speicheldrüsen auf Virusinfektion, disseminierte Infektion, disseminierte Infektion / potenzielle transovariale Übertragung bzw. disseminierte Infektion / potenzielle Übertragungskompetenz untersucht werden können8. Das bloße Vorhandensein eines Virus in den Speicheldrüsen ist jedoch kein endgültiger Beweis für die Übertragungsfähigkeit, da hinweise auf eine Speicheldrüsen-Flucht-/Austrittsbarriere (SGEB) in einigen Vektor/Virus-Kombinationen1,2,4,5,7,9. Die Standardmethode zum Nachweis der Übertragungskompetenz bleibt die Mückenübertragung auf ein anfälliges Tier10,11,12. Da dies jedoch für viele Arboviren die Verwendung von immungeschwächten murinen Modellen13,14,15,16erfordert , ist diese Methode oft unerschwinglich. Eine häufig verwendete Alternative ist die Sammlung des Mückenspeichels, der durch reverse Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder einen infektiösen Assay analysiert werden kann, um das Vorhandensein des viralen Genoms bzw. infektiöser Partikel nachzuweisen. Es ist erwähnenswert, dass solche In-vitro-Speichelentnahmemethoden12 oder 17 der während der In-vivo-Fütterung abgelagerten Virusmenge überschätzen oder unterschätzen können, was darauf hindeutet, dass solche Daten mit Vorsicht interpretiert werden müssen. Nichtsdestotrotz ist die In-vitro-Methode sehr wertvoll, wenn sie aus der Perspektive des bloßen Vorhandenseins von Viren im Speichel analysiert wird, was auf ein Übertragungspotenzial hinweist.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Rolle von Mückenvektoren bei arboviralen Krankheitsausbrüchen zu bestimmen. Die erste Methode beinhaltet die Feldüberwachung, bei der Moskitos im Rahmen der aktiven Übertragung18,19, 20,21,22,23,24gesammelt werden . Angesichts der Tatsache, dass die Infektionsraten jedoch in der Regel recht niedrig sind (z. B. die geschätzte Infektionsrate von Moskitos von 0,061% in Gebieten mit aktiver Zirkulation des Zika-Virus (ZIKV) in den Vereinigten Staaten21),kann die Belastung potenzieller Vektorarten durch die Fangmethodik25,26 und den Zufall (z. B. Probenahme einer infizierten Person von 1.600 nicht infizierten Personen) stark verzerrt sein21 . Unter Berücksichtigung dieser Tatsache kann eine bestimmte Studie nicht genügend Moskitos sowohl in der Rohzahl als auch in der Artenvielfalt erfassen, um Mücken, die an der Übertragung beteiligt sind, genau zu beproben. Im Gegensatz dazu werden Vektorkompetenzanalysen in einem Labor durchgeführt, was eine strenge Kontrolle von Parametern wie der oralen Dosis ermöglicht. Obwohl diese Laborbewertungen nicht vollständig in der Lage sind, die wahre Komplexität der Mückeninfektion und -übertragungsfähigkeit in einer Feldumgebung darzustellen, bleiben diese Laborbewertungen leistungsstarke Werkzeuge auf dem Gebiet der Arbovirologie.
Basierend auf verschiedenen Vektorkompetenzanalysen mit ZIKV in mehreren Mückenarten, Populationen und Methoden27,28,29,30,31,32, sowie einer aktuellen Überprüfung von Vektorkompetenzbewertungen 1 beschreiben wir hier einige der Protokolle, die miteinemtypischen Vektorkompetenz-Workflow verbunden sind. In diesen Experimenten wurden drei Ae. aegypti-Populationen aus Amerika (der Stadt Salvador, Brasilien; der Dominikanischen Republik; und dem unteren Rio Grande Valley, TX, USA) einem einzigen Stamm von ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) bei 4, 5 oder 6 log10 focus-forming units (FFU) / ml Dosen durch künstliche Blutmehle ausgesetzt. Anschließend wurden sie nach verschiedenen Zeiten extrinsischer Inkubation (2, 4, 7, 10 und 14 Tage) mittels Dissektion und einem zellkulturbasierten Infektionstest auf Hinweise auf Infektion, disseminierte Infektion und Übertragungskompetenz analysiert. Obwohl die derzeitigen Arbeitsabläufe/Protokolle für ZIKV optimiert sind, sind viele Elemente in den Arthropoden-Eindämmungs- und Biosicherheitsstufen 2 und 3 (ACL/BSL2 oder ACL/BSL3) direkt auf andere durch Mücken übertragene Arboviren übertragbar.

<table><tbody><tr><td>3mL Standard Reservoir</td><td>R37P30</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>7/32&quot; Stainless Steel 440 Grade C Balls</td><td>4RJH9</td><td>Grainger</td><td>Grinding Media</td></tr><tr><td>Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A16-P4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Adenosine 5&#039;-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>A6419-1G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15</td><td>MAB10216</td><td>MilliporeSigma</td><td>Primary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle</td><td>5450-0011</td><td>KPL/Seracare</td><td>Secondary Antibody for focus forming assay</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>NC0427256</td><td>FisherScientific</td><td>Decontamination</td></tr><tr><td>Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50</td><td>10-126-34</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-740</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning</td><td>07-200-91</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture consumable</td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>C0775-100G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Stain</td></tr><tr><td>Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case</td><td>05-402-7</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-70C</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes</td><td>14-959-49A</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-20</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case</td><td>13-675-15B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-30</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case</td><td>13-675-22</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td><td>08-772B</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL</td><td>S11150</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides</td><td>12-550-A3</td><td>FisherScientific</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>FU1 Feeder</td><td>FU1-0</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; feeding units</td></tr><tr><td>Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles</td><td>140-040-182</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250&amp;mu;g/mL, 50mL/Bottle</td><td>15-290-026</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case</td><td>15-140-163</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles</td><td>25-200-114</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles</td><td>11-965-118</td><td>FisherScientific</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit</td><td>7203706</td><td>Lampire</td><td>Bloodmeal preparation</td></tr><tr><td>InsectaVac Aspirator</td><td>2809B</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case</td><td>A412-4</td><td>FisherScientific</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 &amp;deg;C), 250g/Bottle</td><td>M0512-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Cell culture reagent</td></tr><tr><td>Micro-chem Plus Disinfectant Detergent</td><td>C849T34</td><td>Thomas Scientific</td><td>Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium</td></tr><tr><td>Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology</td><td>M5904-5X5ML</td><td>MilliporeSigma</td><td>Immobilization of Mosquitos</td></tr><tr><td>O-rings</td><td>OR37-25</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Plastic Plugs</td><td>PP5-250</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>PS6 Power Unit (110-120V)</td><td>PS6120</td><td>Hemotek Ltd</td><td>Insectary Equipment; power source</td></tr><tr><td>Rubis Forceps, Offset blades, superfine points</td><td>4525</td><td>Bioquip</td><td>Insectary Equipment</td></tr><tr><td>Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case</td><td>50-809-242</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>Sucrose, BioUltra, for molecular biology</td><td>84097-250G</td><td>MilliporeSigma</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000&amp;mu;L Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case</td><td>21-402-487</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-486</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-484</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10&amp;mu;L Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case</td><td>21-402-482</td><td>FisherScientific</td><td>Plastic consumable</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>85300</td><td>QIAGEN</td><td>Homogenization</td></tr><tr><td>TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL</td><td>5510-0030</td><td>Seracare</td><td>Developing solution for focus forming assay</td></tr><tr><td>Vero</td><td>CCL-81</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr><tr><td>Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6]</td><td>CRL-1586</td><td>American Type Culture Collection</td><td>Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay</td></tr></tbody></table>

vector competence analyses on aedes aegypti mosquitoes using zika virus

Die vorgestellten Verfahren beschreiben eine verallgemeinerte Methodik zur Infektion von Aedes aegypti-Mücken mit dem Zika-Virus unter Laborbedingungen, um die Infektionsrate, die disseminierte Infektion und die mögliche Übertragung des Virus in der betreffenden Mückenpopulation zu bestimmen. Diese Verfahren werden weltweit mit verschiedenen Modifikationen in der Vektorkompetenzbewertung eingesetzt. Sie sind wichtig für die Bestimmung der potenziellen Rolle, die eine bestimmte Mücke (dh Art, Population, Individuum) bei der Übertragung eines bestimmten Erregers spielen kann.

Drei Populationen von Ae. aegypti aus Amerika (Salvador, Brasilien; die Dominikanische Republik; und das Rio Grande Valley, TX, USA) wurden einem Ausbruchsstamm von ZIKV aus Amerika (ZIKV Mex 1-7, Chiapas State, Mexiko, 2015) über eine Reihe von Blutmehltitern (4, 5 und 6 log10 FFU / ml) ausgesetzt, die in einem gewaschenen künstlichen Blutmehl auf der Basis von menschlichen Erythrozyten präsentiert wurden. An den Tagen 2, 4, 7, 10 und 14 nach der Infektion wurden Untergruppen von Moskitos verarbeitet, um Infektion, Verbreitung und mögliche Übertragungsraten zu bestimmen.
Bei einem Blutmehltiter von 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1−7 wurden Ae. aegypti aus Salvador, Brasilien, nach 4 bzw. 14 Tagen extrinsischer Inkubation mit Raten von 12,5 % bzw. 11,1 % infiziert, wobei keine Anzeichen einer disseminierten Infektion in den untersuchten Beinen beobachtet wurden und kein Virus im Speichel nachgewiesen wurde (Abbildung 1a). Die Erhöhung des Titers auf 5 log10 FFU/ml führte zu einer geringfügigen Erhöhung der Infektiosität mit Raten von 22,2%, 33,3% bzw. 22,2% an den Tagen 4, 10 und 14 nach der Infektion. Ähnlich wie in der Kohorte, die mit 4 log10 FFU/ml exponiert wurde, wurde zu keinem Zeitpunkt eine disseminierte Infektion oder Übertragungskompetenz beobachtet (Abbildung 1b). Beim höchsten untersuchten Titer (6 log10 FFU/ml) wurden nach 2 Tagen Inkubation keine Infektionen festgestellt, aber zu allen anderen Zeitpunkten wurden Infektionen beobachtet, die bei 88,9% nach 10 Tagen extrinsischer Inkubation ihren Höhepunkt erreichten. ZIKV wurde in den Beinen von Moskitos nachgewiesen, die 10 und 14 Tage nach der Infektion untersucht wurden (22,2% bzw. 66,7%), was darauf hindeutet, dass ziKV in den Hämocoel gelangt war, obwohl zu diesem Zeitpunkt ein infektiöser ZIKV im Speichel beobachtet wurde (Abbildung 1c).
Die Ae. aegypti-Population aus der Dominikanischen Republik erwies sich als die anfälligste für ZIKV-Infektionen und war nach Exposition gegenüber allen getesteten Blutmehltitern übertragungskompetent. Bei allen drei getesteten Dosen wurde zu allen Zeitpunkten ein gewisses Maß an Infektion beobachtet, wobei die niedrigste Rate 2 Tage nach der Infektion bei 4 log10 FFU/ml (25%) beobachtet wurde(Abbildung 1d). Mit Blutmehltitern von 5 log10 und 6 log10 FFU / ml Bedingungen erreichte die Infektionsrate einen Höchststand von 100%, wobei eine 100% ige Infektion bereits 4 Tage nach der Infektion in der Population von Moskitos beobachtet wurde, die 6 log10 FFU / ml ZIKV ausgesetzt waren (Abbildung 1e,f). Moskitos, die alle drei Dosen mit allen drei Dosen fütterten, zeigten eine Verbreitung von 7 Tagen nach der Infektion mit einem Höchststand von44,4% (4 log 10 FFU / ml, 14 Tage nach der Infektion), 88,9%(5 log 10 FFU / ml, 1 und 14 Tage nach der Infektion) und 100% (6 log10 FFU / ml, 10 Tage nach der Infektion). Die Transmissionskompetenz wurde nach allen drei Dosen (11,1%, 22,2% und 22,2% bei 4, 5 bzw. 6 log10 FFU/ml) beobachtet, jedoch erst nach einer 14-tägigen extrinsischen Inkubationszeit (EIP) (Abbildung 1d−f).
Die Ae. aegypti-Population aus dem Rio Grande Valley, TX, erwies sich als relativ resistent gegen eine Infektion mit ZIKV. Moskitos, die Blutmehltitern von 4 log10 FFU / ml ausgesetzt waren, wurden bereits 4 Tage nach der Infektion infiziert, mit Infektionsraten zwischen 22,2% und 44,4%. Unter diesen Expositionsbedingungen wurden 14 Tage nach der Infektion disseminierte Infektionen mit einer Rate von 11,1% beobachtet, und es wurde keine Übertragungskompetenz beobachtet (Abbildung 1g). Ein zehnfacher Anstieg des Blutmehltiters führte zu einem weitgehend ähnlichen Ergebnis, wobei Infektionen 4 Tage nach der Exposition beobachtet wurden (33,3% und 44,4%), während disseminierte Infektionen nach 14 Tagen extrinsischer Inkubation mit einer Rate von 22,2% gefunden wurden (Abbildung 1h). Schließlich wurde in der Kohorte, die einem 6 log10 FFU / ml Blutmehl ausgesetzt war, eine Infektion ab dem 2-tägigen Zeitpunkt nach der Infektion (22,2%) beobachtet und erreichte Spitzenwerte 4, 10 und 14 Tage nach der Infektion (66,7%). Disseminierte Infektionen in diesem Zustand wurden 7 Tage nach der Infektion (11,1%) beobachtet und erreichten 14 Tage nach der Infektion einen Höhepunkt von 44,4%. Nur eine einzige Mücke (11,1%) wurde 10 Tage nach der Infektion als übertragungsfähig beobachtet (Abbildung 1i).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61112/61112fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Vektorkompetenzdaten verschiedener Ae. aegypti Populationen für ZIKV Mex 1−7. (a−c) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus Salvador, Brasilien (F2). (d−f) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus der Dominikanischen Republik (F6). (g−i) Vektorkompetenz von Ae. aegypti aus dem Rio Grande Valley, TX (F4). (a,d,g) Ae. aegypti ausgesetzt bei 4 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (b,e,h) Ae. aegypti ausgesetzt bei 5 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. (c,f,i) Ae. aegypti ausgesetzt bei 6 log10 FFU/ml ZIKV Mex 1-7. Zu jedem Zeitpunkt (2, 4, 7, 10 und 14 Tage nach der Infektion) wurde eine Untergruppe von Moskitos gesammelt und beprobt. Infektions-, Verbreitungs- und Übertragungsraten werden als die Anzahl der positiven Kadaver- / Bein- / Speichelproben über die Anzahl der zu diesem Zeitpunkt untersuchten Moskitos dargestellt. Die Infektion wird in Blau dargestellt, die disseminierten Infektionen in Grün und die Übertragungsrate in Rot. Die Daten in dieser Abbildung wurden von Roundy und Azar et al.32 modifiziert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61112/61112fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Vektorkompetenzanalysen an Aedes aegypti Mücken mit Zika-Virus

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

2.9K Aufrufe.  University of Texas Medical Branch. Das vorgestellte Protokoll kann die Vektorkompetenz von Aedes aegypti-Mückenpopulationen für ein bestimmtes Virus, wie Zika, in einer Containment-Umgebung bestimmen.

Serie: Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Forschung

Genetik

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Genome Editing bei der Gelbfiebermücke Aedes aegypti mittels CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV is an RNA virus of the Flaviviridae family. ZIKV is mainly transmitted by mosquitoes, but can also be spread by maternal to fetal vertical transmission as well as sexual contact. To date, there are no reliable treatment or vaccine options available to protect those infected by the virus. The development of a reproducible, effective Zika virus infectious cell culture system is critical for studying the molecular mechanisms of ZIKV replication as well as drug and vaccine development. In this regard, a protocol describing a mammalian cell-based in vitro Zika virus culture system for viral production and growth analysis is reported here. Details on the formation of plaques by Zika virus on a cell monolayer and plaque assay for measuring viral titer are presented. Viral genome replication kinetics and double-stranded RNA genome replicatory intermediates are determined. This culture platform was utilized to screen against a library of a small set of cytokines resulting in the identification of interferon-&#945; (IFN-&#945;), IFN-&#946; and IFN-&#947; as potent inhibitors of Zika viral growth. In summary, an in vitro infectious Zika viral culture system and various virological assays are demonstrated in this study, which has the potential to greatly benefit the research community in elucidating further the mechanisms of viral pathogenesis and the evolution of viral virulence. Antiviral IFN-alpha can further be evaluated as a prophylactic, post-exposure prophylactic, and treatment option for Zika virus infections in high-risk populations, including infected pregnant women.

Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Zika Virus Infectious Zellkultursystem und die<em&gt; In Vitro</em&gt; Prophylaktische Wirkung von Interferonen

Zika Virus (ZIKV) is an emerging pathogen that is linked to fetal developmental abnormalities such as microcephaly, eye defects, and impaired growth. ZIKV ...

Immunologie und Infektion

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

Rettung und Charakterisierung des rekombinanten Virus aus einer neuen Welt Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

Quantifizierung der Antikörper-abhängige Verstärkung der Zika-Virus in primären humanen Zellen

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, chikungunya and Zika. Wolbachia-infected mosquitoes can be released into the field to either reduce population sizes through incompatible matings or to transform populations with mosquitoes that are refractory to virus transmission. For these strategies to succeed, the mosquitoes released into the field from the laboratory must be competitive with native mosquitoes. However, maintaining mosquitoes in the laboratory can result in inbreeding, genetic drift and laboratory adaptation which can reduce their fitness in the field and may confound the results of experiments. To test the suitability of different Wolbachia infections for deployment in the field, it is necessary to maintain mosquitoes in a controlled laboratory environment across multiple generations. We describe a simple protocol for maintaining Ae. aegypti mosquitoes in the laboratory, which is suitable for both Wolbachia-infected and wild-type mosquitoes. The methods minimize laboratory adaptation and implement outcrossing to increase the relevance of experiments to field mosquitoes. Additionally, colonies are maintained under optimal conditions to maximize their fitness for open field releases.

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Aedes aegypti mosquitoes infected with Wolbachia are being released into natural populations to suppress the transmission of arboviruses. We describe methods to rear Ae. aegypti with Wolbachia infections in the laboratory for experiments and field release, taking precautions to minimize laboratory adaptation and selection.

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

Biologie

Forced Salivation As a Method to Analyze Vector Competence of Mosquitoes

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus particles are transmitted during a blood meal via the saliva of an infected mosquito. Forced salivation assays allow determining the vector potential on the basis of single mosquitoes, avoiding the use of animal experiments. The method is suitable to analyze a large number of mosquitoes in one experiment within a short period of time. Forced salivation assays were used to analyze 856 individual mosquitoes trapped in Germany, including two different Culex pipiens pipiens biotypes, Culex torrentium as well as Aedes albopictus, which were experimentally infected with Zika virus (ZIKV) and incubated at 18 &#176;C or 27 &#176;C for two and three weeks. The results indicated the lack of vector competence of the different Culex taxa for ZIKV. In contrast, Aedes albopictus was susceptible to ZIKV, but only at 27 &#176;C, with transmission rates similar to an Aedes aegypti laboratory colony tested in parallel.

For efficient control of mosquito borne virus transmission, the knowledge of the vector potential of respective mosquitoes is of particular interest. We describe forced salivation as a method to analyze vector competence of Aedes albopictus and three different Culex taxa for the transmission of Zika virus.

Gezwungen Speichelfluss als Methode zur Vektorkompetenz von Stechmücken Analyse

Vector competence is defined as the potential of a mosquito species to transmit a mosquito-borne virus (mobovirus) to a vertebrate host. Viable virus ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs Rhodamin B zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit bei männlichen Aedes aegypti-Moskitos

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two main categories of these new mosquito-associated viruses are &#34;mosquito-borne viruses (MBVs)&#34; and &#34;mosquito-specific viruses (MSVs)&#34;. These novel viruses might be pathogenic to both vertebrates and mosquitoes, or they could just be symbiotic with mosquitoes. Entity viruses are essential to confirm the biological characters of these viruses. Thus, a detailed protocol has been described here for virus isolation and amplification from field-collected mosquitoes. First, the mosquito samples were prepared as supernatants of mosquito homogenates. After centrifugation twice, the supernatants were then inoculated into either mosquito cell line C6/36 or vertebrate cell line BHK-21 for virus amplification. After 7 days, the supernatants were collected as the P1 supernatants and stored at -80 &#176;C. Next, P1 supernatants were passaged twice more in C6/36 or BHK-21 cells while the cell status was being checked daily. When cytopathogenic effect (CPE) on the cells was discovered, these supernatants were collected and used to identify viruses. This protocol serves as the foundation for future research on mosquito-associated viruses, including MBVs and MSVs.

Numerous novel virus-like sequences have been found in mosquitoes due to the extensive use of sequencing technologies. We provide an effective procedure for isolating and amplifying viruses using vertebrate and mosquito cell lines, which might serve as the basis for future studies on mosquito-associated viruses, including mosquito-borne and mosquito-specific viruses.

Mückenassoziierte Virusisolierung aus im Feld gesammelten Stechmücken

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...