LarvaSPA ist die erste Methode, die eine kontinuierliche Live-Bildgebung intakter Drosophila-Larven für mehr als 10 Stunden mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Diese Methode wird verwendet, um dynamische zelluläre Prozesse von Larven periphere sensorische Neuronen zu enthüllen und für die Untersuchung vieler anderer zellulärer Prozesse, die in der Nähe der Larvenkörperwand geschehen. Diese Methode ist einfach zu bedienen und hat weniger Begrenzung auf Larvengröße.
Sechs bis neun Larven können gleichzeitig in der Bildkammer montiert werden, was das Experiment ermöglicht. Die Bildgebungskammer der PDMS-Quader kann kostengünstig hergestellt werden und ist wiederverwendbar. Diese Methode ist besonders nützlich für die Untersuchung von Mechanismen der Dendritenentwicklung und Dendritendegeneration mit drosophila larva dendritischen Autorisierung neuronen.
Die Möglichkeit, das gleiche Neuron stundenlang abzubilden, kann zeigen, wie langfristige globale Veränderungen dendritischer Muster aus kurzfristigen Verhaltensweisen auf der Ebene der einzelnen Zweigstellen entstehen. Die Verwendung von PDMS-Quadern, die den Larvengrößen entsprechen, erhöht die Erfolgsrate bei immobilisierenden Larven. Weitere nützliche Bänder finden Sie in unserem Abschnitt zur Fehlerbehebung.
Nachdem Sie einen Aluminiumblock aus einer Maschinenhalle gebaut haben, versiegeln Sie den Boden des Metallrahmens mit einem langen Deckelschlupf mit UV-Kleber. Härten Sie den UV-Hinweis 30 Sekunden lang mit einer Hand-UV-Lampe aus. Befestigen Sie Schichten von Verpackungsband an der Innenfläche einer rechteckigen Petrischale oder runden Zellkulturplatte.
Verwenden Sie eine Schicht für zweite In-Stern-Larven, zwei Schichten für frühe dritte In-Stern-Larven oder drei Schichten für spätdritte In-Stern-Larven. Schneiden Sie das Band in Fahrten von spezifischer Breite mit einer Rasierklinge, 1,5 Millimeter für das einlagige Band und zwei Millimeter für das zwei- oder dreilagige Band. Lassen Sie mindestens einen Abstand von fünf Millimetern zwischen den beiden Streifen.
Entfernen Sie die Bandschichten, die den Raum abdecken. Entfernen Sie Staub von der Innenfläche der Platte mit Klebeband. Danach ist die Form einsatzbereit.
Um die PDMS-Mischung vorzubereiten, mischen Sie sieben Gramm PDMS-Basis in 0,7 Gramm Aushärtungsmittel gründlich in einem kleinen Behälter. Legen Sie den Behälter mindestens 15 Minuten in einen Vakuumaustrocknungsor, um Luft aus dem Gemisch zu entfernen. Gießen Sie langsam etwa 5,5 Gramm PDMS-Mischung auf die Form, um eine Ein- bis Zwei-Millimeter-Dicke zu erreichen.
Legen Sie das PDMS-Gemisch für mindestens 15 Minuten wieder in den Vakuumaustrocknungser, um die verbleibenden Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Brechen Sie die letzten Blasen mit einer Pipettenspitze. Das PDMS auf einer ebenen Oberfläche in einem Wärmebrutschrank bei 65 Grad Celsius zwei Stunden lang aushärten.
Als nächstes verwenden Sie eine Rasierklinge, um das ausgehärtete PDMS entlang der Kante der Form zu lösen und es von der Form zu lösen. Bewahren Sie das PDMS zwischen zwei Stücken großem Klebeband bei Raumtemperatur auf. Für frühe und späte dritte In-Star-Larven, schneiden Sie das PDMS in acht mal zwei mal einen Millimeter Quader, indem Sie die Nut durch den Bandstreifen in der Mitte der langen Seite des Quaders erstellt.
Für die zweite In-Star-Larven den Quader um einen Millimeter auf acht schneiden. Um den oberen Deckelschlupf für die Montage vorzubereiten, wählen Sie sechs PDMS-Quader mit Nuten, die den Größen der Larven entsprechen. Entfernen Sie Staub von der Oberfläche des PDMS mit Klebeband.
Befestigen Sie vier Doppelbandstücke in der Größe 12 mal fünf Millimeter an einem langen Decksbeleg von 22 mal 50 Millimetern, um PDMS-Quader später zu fixieren. Passen Sie die Leerzeichen zwischen den beiden Stücken doppelseitigem Band auf die gleiche Breite wie die Breite der PDMS-Nut an. Tragen Sie einen kleinen Tropfen UV-Kleber in die Nut jedes PDMS-Quaders auf und fügen Sie sechs kleine Tropfen UV-Kleber in den Raum zwischen den doppelseitigen Bändern auf dem Deckelschlupf ein.
Um die Larven für die Montage vorzubereiten, mit einem Paar Zange, reinigen Sie die Larven in Wasser, um Nahrung von der Körperoberfläche zu entfernen. Legen Sie die sauberen Larven auf ein kleines Stück befeuchtetes Tissuepapier in eine kleine Petrischale ohne Deckel und legen Sie die kleine Petrischale in eine große Petrischale, die ein Stück trockenes Gewebepapier enthält. Verwenden Sie in einer chemischen Haube eine Kunststoff-Transferpipette, um 160 bis 240 Mikroliter Isofluran auf das Trockenepapier aufzutragen und den Deckel der großen Petrischale zu schließen.
Warten Sie zwei bis drei Minuten, während Sie die Larven überwachen. Sobald ihre Mundhaken aufhören sich zu bewegen, nehmen Sie die Larven aus der großen Petrischale heraus. Legen Sie die immobilisierten Larven auf den UV-Kleber zwischen den doppelseitigen Bändern auf den Deckelschlupf mit der dorsalen Nagelhaut, die dem Deckelschlupf zugewandt ist.
Bedecken Sie jede Larve mit einem PDMS-Block und passen Sie den Stamm der Larve in die Nut des PDMS. Lassen Sie den Kopf und den Schwanz der Larve außerhalb der PDMS-Nut. Vermeiden Sie es, die Spappel der Larve durch den Kleber zu blockieren.
Drücken Sie auf die Enden des PDMS-Blocks auf das doppelseitige Band, ohne Kraft auf die Nut anzuwenden. Ziehen Sie vorsichtig am Schwanz der Larve, um die Nagelhaut unter dem PDMS abzuflachen. Tragen Sie eine Schutzbrille und verwenden Sie eine handgeführte UV-Lampe, um den UV-Kleber vier Minuten lang auf der hohen Einstellung auszuhärten.
Drehen Sie den Deckelschlupf auf den Kopf und verwenden Sie die UV-Lampe, um den UV-Kleber für weitere vier Minuten auszuhärten. Legen Sie ein kleines Stück Linsenpapier mit der Größe von 15 mal 30 Millimetern an der Unterseite der Bildkammer. Befeuchten Sie das Papier mit 20 bis 30 Mikroliter Wasser.
Legen Sie den Deckelschlupf auf die Kammer, so dass die Larven nach innen in die Kammer blicken. Verwenden Sie den UV-Kleber, um beide Enden der Abdeckung auf die Metalloberfläche zu befestigen. Die Dorsalseite der Larven ist unter einem konfokalen Mikroskop zur Bildgebung bereit.
Entfernen Sie nach der Bildgebung das Öl auf der oberen Abdeckung mit Linsenpapier. Lösen Sie den oberen Deckelvom Metallrahmen, indem Sie mit einer Rasierklinge in den Raum zwischen dem Deckelschlupf und dem Metallrahmen schneiden. Die Bildgebungskammer ist wiederverwendreif.
Lösen Sie die PDMS-Quader mit Zangen vom oberen Deckelschlupf. Rollen Sie die PDMS-Quader auf Klebeband, um Klebstoffrückstände und Staub zu entfernen. Die PDMS-Quader sind wiederverwendreif.
In diesem Protokoll wurden Drosophila-Larven länger als 10 Stunden für die kontinuierliche Bildgebung immobilisiert. Diese Abbildung zeigt sechs späte dritte In-Stern-Larven, die in der Kammer montiert sind. Die Stämme der Larven wurden fixiert, während ihre Köpfe und Schwänze frei waren, sich zu bewegen.
Hier zeigen wir die Anwendung von LarvaSPA bei der Untersuchung der neuronalen Dendritendynamik und Dendritendegeneration anhand von DA-Neuronen der Klasse 4 als Modell. Um Larven mit dieser Methode erfolgreich immobilisieren zu können, ist es wichtig, die Larven nicht mehr Isofluran zu bedecken, sobald sich die Mundhaken nicht mehr bewegen und den UV-Kleber aushärten, bevor die Larven vollständig aufwachen. Um die Degeneration und Regeneration von Dendriten zu untersuchen, kann eine Laserverletzung durchgeführt werden, wenn Larven in der Bildkammer immobilisiert werden.
LarvaSPA hat uns geholfen zu verstehen, wie dynamisch wachsende Dendriten epidermale Zellen wie in Leberzellproteoglykanen nicht in ninvalieren und wie Phosphatidylserin nach Laserverletzungen degenerierenden Dendriten ausgesetzt ist. Schützen Sie die Augen mit einer Schutzbrille, während Sie die UV-Lampe verwenden. Das Ausstoßen von Larven mit Isofluran sollte in einer Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
