Dieses Mikroinjektionssystem ist für die Arzneimittelinfusion, Elektrophysiologie sowie die Abgabe und das Abrufen von experimentellen Sonden wie Mikroelektroden und Nanosensoren konzipiert. Es ist für den wiederholten Einsatz bei wach verhaltenden Tieren mit geringfügigen Penetrationsschäden an umgebenden Geweben optimiert. Das Microinjectrode-System kann für mehrere Zwecke konfiguriert werden.
Die erste ist eine einfache Anordnung der Kanüle für die Platzierung einer experimentellen Sonde, die sonst zu zerbrechlich wäre, um in die Dura mater einzudringen. Die zweite ist eine mikrofluidische Infusion eines Arzneimittels entweder unabhängig oder gekoppelt mit einer Kanüle, die eine experimentelle Sonde enthält. Die mikrofluidischen Komponenten des Systems ermöglichen die Abgabe von Volumen im Nanoliter-Skala.
Messen Sie die Länge der Kanüle und der Nanosensorsonde oder Mikroelektrode. Die Sonde muss um die Länge, die aus der Kanülenspitze herausragen soll, um etwa einen Zentimeter länger als die Kanüle sein. Laden Sie die Sonde unter einer Lupe durch den Rücken in die Kanüle, um die Spitze der Sonde zu schützen.
Setzen Sie die Kanüle, die die Sonde enthält, von der unteren Ferrule in die T-Kreuzung ein. Platzieren Sie die obere flache Seite der Kanüle in der Mitte der T-Kreuzung. Vermeiden Sie es, die Kreuzung über die Kanüle zu blockieren, indem Sie sie wieder in die Kreuzung einziehen und dann anziehen.
Befestigen Sie einen Schlauch an der Oberseite der Mikroelektrode. Laden Sie die Mikroelektrode durch die Kapillarschläuche, t-Kreuzung, Kanüle und entsprechende Ferrules zurück. Schneiden Sie die Mikroelektrode in der gewünschten Länge und kratzen Sie das Ende ab.
Stellen Sie sicher, dass das hintere Ende der Elektrode weniger als einen Zentimeter von der Rückseite des Kapillarschlauchs ragt und die Spitze der Elektrode aus der Kanüle im gewünschten Abstand auf der Unterseite ragt. Legen Sie die Mikroelektrodenklemme in den Goldstift und löten Sie den Goldstift an die Mikroelektrodenklemme. Fügen Sie Epoxidkleber zwischen dem Goldstift und der oberen Ferrule hinzu, um die Mikroelektrode an der Ferrule zu befestigen.
Nachdem das Epoxid ausgehärtet ist, vorzugsweise für mehr als 24 Stunden, schrauben Sie die obere Ferrule ab, um sicherzustellen, dass sich die Mikroelektrode vollständig in der Kanüle zurückzieht. Um die mikrofluidische Schaltung zu konstruieren, legen Sie eine breite Platine auf eine stabile Oberfläche. Platzieren Sie die beiden Dreiwegeventile parallel zu den längsten Seiten des breiten Brettes etwa 12 Zentimeter voneinander entfernt, wobei ein Port einander gegenüberliegt.
Verwenden Sie Schrauben, um die Ventile an der breiten Platte zu befestigen und schneiden Sie weitere 10 Zentimeter Kapillarrohre für die Lineallinie und legen Sie sie dazwischen. Verwenden Sie Standard-Ferrules, um die Schläuche an den verkleidungen Anschlüssen der Ventile zu straffen. Schneiden Sie 10 bis 20 Zentimeter des Kapillarschlauchs und verwenden Sie die Standard-Ferrules und die Luer-Verriegelungsverbinder, um den Schlauch an der Spritze an einen der Anschlüsse am Eingangsventil anzuschließen.
Schneiden Sie ein kleines Stück Kapillare und schließen Sie es an das Ausgangsventil als Spüllinie an. Schneiden Sie zwei längere Kapillarrohre um 100 Zentimeter, um das Ausgangsventil mit der Mikroinjektionsrode zu verbinden. Schließen Sie die Medikamentenpumpe und die Markerpumpe an das Eingangsventil an.
Stellen Sie zunächst sicher, dass die Mikroelektroden-Experimentalsonde in der Kanüle eingefahren wird. Um einen maßgeschneiderten Adapter mit Schrauben an der Mikroinjektionzulage zu befestigen, laden Sie die Mikroinjektion durch das Führungsrohr und befestigen Sie sie mit einem Schraubenpaar am kundenspezifischen Mikroantriebsadapter. Messen Sie die Tiefe der Mikroantriebsposition, bei der die Mikroinjektion aus dem Führungsrohr ragt, und ziehen Sie sie dann einen Zentimeter zurück, um sich auf das Einführen vorzubereiten.
Bei Mikroinfusionsexperimenten verbinden Sie die Hirnlinie mit der ungenutzten T-Kreuzungsöffnung der Mikroinjektion. Verwenden Sie eine Standard-Ferrule und ziehen Sie mit dem Ferrule-Schraubenschlüssel. Stellen Sie sicher, dass auch die obere Ferrule angezogen wird.
Positionieren Sie dann den Mikroantrieb über einem Becher. Chlorhexidin mit 20 Gramm pro Liter in die ein Milliliter gasdichte Spritze geben und in die Medikamentenpumpe geben. Drehen Sie die Durchflussrichtung der Ventile und stellen Sie eine niedrige Durchflussrate von 50 bis 200 Mikroliter pro Minute ein, so dass die Flüssigkeit von der Medikamentenpumpe über das Eingangsventil zum Ausgangsventil und aus der Hirnleitung geht.
Spülen Sie den Kreislauf mit Chlorhexidin für mindestens 10 Minuten. Wiederholen Sie die Spülung mit steriler Saline und dann mit Luft. Tragen Sie an den Kreuzungen vorsichtig fusselfreie Tücher auf, um Flüssigkeitslecks durch die Ferrules zu enthüllen.
Der wichtigste Schritt ist die Überprüfung, ob die Montage von Injectrode und mikrofluidischem Kreislauf und ichfrei ist. Laden Sie das Medikament in die 500 Mikroliter gasdichte Spritze, komprimieren Sie die Luft und legen Sie es dann in die Medikamentenpumpe. Stellen Sie den Durchfluss auf 50 Mikroliter pro Minute ein und lassen Sie die Flüssigkeit so lange verfahren, bis ein paar Tropfen in der Mikroinjektion sausen.
Dann tränken Sie das Führungsrohr in Chlorhexidin in der Konzentration von 20 Gramm pro Liter für 15 Minuten. Drehen Sie die Richtung des Ausgangsventils in Richtung der Spüllinie, um den Marker zu verdrängen, während die Markerpumpe vorgeschoben wird, bis eine klare Kante von Farbe und Öl auf der Lineallinie beobachtet wird. Stellen Sie sicher, dass es immer Öl zwischen dem Medikament und der Farbe gibt, um die beiden wasserlöslichen Materialien nicht zu mischen und die scharfe Kante zwischen ihnen zu verlieren.
Markieren Sie die Ausgangsposition dieser Ölfarbstofflinie. Nach dem notwendigen Versuchsaufbau ziehen Sie die Mikroelektrode in die Kanüle ein, indem Sie die obere Ferrule lockern. Befestigen Sie den Mikroantrieb an der Aufnahmekammer und senken Sie das Führungsrohr, um die Dura zu durchdringen.
Als nächstes senken Sie die Mikroinjektion rode auf etwa zwei Millimeter über der Aufnahmestelle im Gehirn. Ziehen Sie die obere Ferrule fest und schließen Sie die Goldstifte an das Aufnahmesystem an. Weiter bringen Sie die Mikroinjektion rode zum Zielort vor.
Wechseln Sie dann das Ausgangsventil auf die Hirnleitung. Für Infusionsexperimente verwenden Sie die manuelle Mikrospritzenpumpe, um die Ölsäule pro Minute um 0,5 Zentimeter zu bewegen. Sobald das gewünschte Volumen infundiert ist, schalten Sie das Ausgangsventil in Richtung der Spülleitung.
In dieser Studie wurde die Injektion eines GABA A-Agonisten durch den rechten Hemisphäre-FEF-Bereich zur reversiblen Inaktivierung des frontalen Augenfeldes durchgeführt, während das Tier eine gedächtnisgesteuerte Saccade-Aufgabe erledigte. Polardiagramm zeigt die Leistung der Exzentrizität für verschiedene Positionen relativ zum Fixierungspunkt. Die Leistung im linken Gesichtshemifield zwei Stunden nach der Injektion deutlich abgenommen.
Saccade-Spuren für acht periphere Speicherstandorte vor und nach der Muscimol-Injektion in die FEF werden hier gezeigt. Die Saccade-Genauigkeit im linken Visuellen Halbfeld verringerte sich nach der Muscimol-Injektion. Sobald die Einrichtung abgeschlossen ist, ist die Methode sehr zuverlässig und robust.
Aufgrund der Ausfällung kleiner Moleküle innerhalb der Röhre und der Ports ist jedoch vor jedem Einsatz und nach jedem Experiment eine gründliche Spülung erforderlich, um das Mikrofluid frei von Hindernissen und Leckagen zu halten. Obwohl die Methode im frontalen Augenfeld bei einem nichtmenschlichen Primaten nachgewiesen wurde, kann das Prinzip auf jede andere Hirnregion angewendet werden, in der eine Kombination aus elektrischer Stimulation, Aufzeichnung und Medikamenteninjektion bei Nagetierarten oder größer gewünscht wird. Unser System hat die Flexibilität, für die Aufnahme entweder unabhängig oder in Kombination mit Medikamenteninjektion verwendet werden und hat die Fähigkeit, jede fragile experimentelle Sonde präzise vor Schäden durch die Dura mater und Neuronalgewebe mit minimalen Gewebeschäden aufgrund seiner kleinen Kanülendurchmesser geschützt zu platzieren.
