Dieses Protokoll ermöglicht eine zuverlässige Messung der mechanischen Eigenschaften der Membran von synthetischen und realen Polymerlipidvesikel mit einer Micropipette-Aspirationstechnik. Dies ist die einzige Technik, mit der Membranflexibilität und Instabilität in Einzelversuchen gemessen werden können. Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von Verfahren von der Vesikelvorbereitung bis zur mechanischen Bewertung.
Es ist sehr wichtig, geduldig zu sein und alle technischen Probleme zu lösen, wenn sie auftreten. Die Visualisierung dieser Techniken ist entscheidend für das Verständnis, wie die Kapillaroberfläche richtig behandelt und wie der obligatorische Vorspannungsschritt durchgeführt werden kann. Zeigen Sie das Vesikel ohne Defekte.
Demonstrierend wird Martin Fauquignon sein, ein Doktorand des Labors, der an der Entwicklung von Hybrid-Polymer-Lipid-Vesikeln arbeitet. Vor Beginn des Verfahrens legen Sie Kaltglas-Mikropipette-Kapillaren vertikal in die Halter. Und senken Sie die Halter, bis die Spitzen über Nacht in frisch zubereitete Glukose-Rinder-Serum-Albumin-Lösung eingetaucht sind.
Bis zum nächsten Morgen sollte die Lösung durch Kapillarwirkung etwa einen Zentimeter in die Spitzen gestiegen sein. Mit einer 500-Mikroliter-Glasspritze, ausgestattet mit einer flexiblen Geschmolzenen Kieselsäurekapillare, füllen Sie jede Pipette mit der Glukoselösung. Dann die Lösung aus jeder Pipette absaugen, bevor Sie die Pipetten mehrmals mit frischer Glukoselösung nachfüllen, bis das gesamte Serum entfernt ist.
Um eine Elektroformationskammer vorzubereiten, reinigen Sie zunächst ITO-Glysen mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel und identifizieren Sie die leitfähige Oberfläche mit einem Ohmeter. Befestigen Sie elektrische Drähte mit Klebeband an der leitfähigen Seite jedes Dias. Tauchen Sie eine Kapillare in eine ampiviale Lösung, bis etwa 5 Mikroliter der Lösung durch Kapillarwirkung gesammelt wurden.
Setzen Sie die geladene Kapillare in Kontakt mit der Mitte einer Glas-ITO-Platte und verteilen Sie die Lösung vorsichtig über die Rutsche. Wenn das Lösungsmittel vollständig verdampft ist, wenden Sie die Lösung noch zwei Mal an, wie gerade gezeigt. bevor sie eine Schicht aus siliziumfreiem Fett auf beiden Seiten des geöffneten O-Ring-Abstandsraums um den Abscheidungsbereich legen.
Als nächstes legen Sie die leitfähige Fläche einer zweiten ITO-Glasplatte auf die Oberseite des Abstandsraums und legen Sie die Elektroformationskammer 3 Stunden lang unter Vakuum, um Spuren von organischem Lösungsmittel zu entfernen. Für die Elektroformation von Riesen-Unilamellar-Vesikeln, Stecken Sie die elektrischen Drähte in den Generator. Stellen Sie die Generatorfrequenz auf 10 Hertz und die Amplitude auf 2 Volt, Spitze bis Spitze.
Wenn die Spannung eingestellt ist, verwenden Sie eine Spritze mit einer Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,8 Millimetern, um einen Milliliter 0,1 Molar-Saccharose-Lösung in die Kammer zu injizieren, und lassen Sie die Kammer unter der angelegten Spannung und Frequenz für 75 Minuten. Schalten Sie am Ende der Elektroformation den Generator aus. Und verwenden Sie die Ein-Milliliter-Spritze, um ein kleines Volumen der Lösung zu aspirieren, bis eine Luftblase in der Kammer produziert wird.
Neigen Sie die Kammer leicht, um die Blase in die Kammer zu bewegen, und um zu helfen, die Vesikel von der Gleitfläche zu lösen. Und das gesamte Lösungsvolumen in die Spritze absaugen. Dann übertragen Sie die Vesikellösung in ein Ein-Milliliter-Kunststoffrohr.
Um die Materialien für die Mikromanipulation einzurichten, aspirieren Sie, um einen Wasserfluss, einen Tank mit reinem Wasser, zu einem Halter zu schaffen. Und leicht tippen, während der Tank zu erhöhen, um alle Luftblasen zu beseitigen, und um positiven Druck zu erzeugen. Füllen Sie eine serumbeschichtete Kapillare mit frischer Glukoselösung, bis sich an der Spitze ein Tropfen bildet.
Entfernen Sie die Spritzenschläuche aus dem Metallhalter, um einen leichten Wasserfluss am Ende des Halters zu erzeugen, und drehen Sie die Kapillare auf den Kopf, um den Glukoseabfall mit dem Wasserfluss zu verbinden. Dann schrauben Sie die Kapillare und den Halter zusammen. Um die Pipette zu positionieren, kleben Sie zwei Glasschlitten von einer maßgeschneiderten Aluminiumbühne zusammen mit Vakuumfett.
Und installieren Sie die Dias auf einer Mikroskopbühne. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette, bilden Sie einen Meniskus zwischen den beiden Dias mit 0,1 Molglukose. Legen Sie die Pipette und ihren Halter auf die Motoreinheit des Mikromanipulators.
Ziehen Sie den Klemmknopf fest und verwenden Sie den Bedienfeld-Joystick im groben Modus. Senken Sie die Mikropipette in der Nähe des Glukosemeniskus. Verwenden Sie den feinformatigen Modus, um die Position der Spitze in die Mitte des Meniskus einzustellen.
Tauchen Sie die Spitze in die Glukose ein, um ihre äußeren und inneren Oberflächen zu reinigen. Nach einigen Minuten die Kapillare aus dem Meniskus ziehen und die Glukose durch einen frischen Meniskus ersetzen. Zwei Mikroliter Riesen-Unilamellar-Vesikel in 0,1 Molarensaccharose in eine 20-Milliliter-Mikropipette-Spitze aspirieren.
Führen Sie die Vesikel in den Meniskus ein. Verwenden Sie das Mikroskop, um die Vesikel an der Unterseite der Gleitkammer zu beobachten. Wenn die Vesikel leicht entleert sind, setzen Sie die Saugpipette wieder ein und konzentrieren Sie sich auf die Spitze der Pipette.
Stellen Sie dann die Grundhöhe des Wassertanks auf den Druck ein, bei dem die Bewegung der Partikel gestoppt wird. Umgeben Sie den Meniskus mit Mineralöl, um Verdunstung zu verhindern. Um ein Micropipette-Aspirationsexperiment durchzuführen, senken Sie die Pipettespitze in den Meniskus.
Erstellen Sie eine kleine Menge an Saugdruck, um ein Vesikel zu aspirieren. Die Membran des ausgewählten Vesikels sollte leicht schwanken und keine sichtbaren Defekte aufweisen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Pipette auf ein höheres Niveau zu heben, um das angesaugte Vesikel von anderen Vesikeln zu isolieren.
Senken Sie den Wassertank auf ca. 10 Zentimeter, um das Vesikel vorzutragen, bevor Sie den Tank anheben, um den Druck auf den Anfangswert zurückzuführen. Ab einer Höhe von 0,5 Zentimetern den Saugdruck langsam verringern, bis ein Druck erreicht wird, bei dem die Membran schwankt. Dann erhöhen Sie den Druck, eine Zunge in der Spitze, die Projektionslänge von ein paar Mikrometern, klar zu visualisieren.
Um den Biegemodul zu bestimmen, erhöhen Sie den Saugdruck, jeweils ein Mikrometer nach dem anderen. Bis 0,5 bis 0,8 MilliNewtons pro Meter erreicht ist. Warten Sie fünf Sekunden, und machen Sie nach jedem Schritt einen Schnappschuss der Zunge.
Um den Flächenkompressibilitätsmodul zu bestimmen, erhöhen Lysespannung und Dehnung den Saugdruck von 0,5 MilliNewtons pro Meter bis zur Erdbruchspannung weiter. In diesem repräsentativen Experiment waren die Flächenkompressibilitätsmodul und Lyse-Sorte für POPC in perfekter Übereinstimmung mit dem, was von der Literatur erwartet wurde. In dieser Tabelle können typische Werte für die erhaltenen Polymersomen beobachtet werden.
Beachten Sie, dass die Zähigkeit der Membran, die aus Diblock-Copolymeren gewonnen wird, weit größer ist als die aus Triblock-Copolymer. Interessanterweise ist es mit dem Diblock-Copolymer möglich, eine Giant Hybrid Unilamilar Lipid Polymer Vesicles zu erhalten, die eine robustere Zähigkeit als die für Liposomen gemessen zeigen. Dieses Protokoll kann hilfreich sein, um Vesikel mit einer Pipette zu messen, zum Beispiel, um die Durchlässigkeit der Membran durch asmatische Schocks zu messen.
Achten Sie darauf, jeden Schritt mit Strenge und Präzision abzuschließen, vor allem beim Einrichten der Tribünenverbindung. Diese Technik wurde genutzt, um den physikalischen Ursprung der Membranspaltung durch die Messung der Linienspannung an den Hauptgrenzen in modifizierten Vesikeln zu verstehen.
