Mit dieser Methode können wir die Auswirkungen der intrinsischen Aktivität auf die Reifung kortikaler Interneuron-Vorläufer untersuchen. Diese Technik bietet eine effiziente Möglichkeit, die zellulären Eigenschaften kortikaler interneuroner Vorläufer zu zielen und zu manipulieren, die für die Mehrheit der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich ist. Dieses Protokoll beinhaltet den sorgfältigen Umgang mit Proben und Geräten, und es kann am besten durch visuelle Demonstration geschätzt werden.
Zeichnen Sie mit einem wasserdichten Stift eine gerade Linie über die Mitte des unteren Teils der unteren Oberfläche von sechs 35-Millimeter-Petri-Schalen. Fügen Sie 10 Milliliter flüssige 4%low gelierende Agarose in PBS in zwei der 35-Millimeter-Petri-Schalen ein und betten Sie drei bis vier sezierte Gehirne in die Agarose ein, wobei die olfaktorischen Glühbirnen pro Schale über die gerade Linie nach unten zeigen und drei bis fünf Millimeter Abstand zwischen jeder Probe zurückbleiben. Wenn alle Gehirne eingebettet sind, legen Sie die Gerichte bei vier Grad Celsius, damit die Agarose die drei Gehirne verfestigen und zu einem einzigen Block Agarose zerstückt, so dass etwa drei Millimeter Gel an den Rändern der Proben zurückbleiben.
Kleben Sie den Block auf die Oberfläche einer Mikrotom-Basis und verwenden Sie eine chirurgische Klinge, um den ganzen Boden des Blocks zwischen jeder Gewebeprobe zu schneiden, um drei unabhängige Blöcke zu erhalten. Als nächstes verwenden Sie ein vibrierendes Klingenmikrotom, um die Blöcke in eiskalter Krebs-Lösung in 250 Mikrometer dicke Scheiben zu schneiden, indem Sie eine gebogene flache Mikrospatula verwenden, um nur die Scheiben zu sammeln, die die medialen oder kaudalen ganglionischen Eminenzen enthalten. Dann legen Sie jeden Abschnitt auf einzelne 13-Mikrometer-Durchmesser, acht Mikrometer Porengröße Filtermembranen schweben auf minimalen essentiellen Medium in einzelnen Polystyrol Zentrum gut Organ Kultur Gerichte.
Wenn alle Abschnitte erhalten sind, legen Sie die Gerichte in einem Kohlendioxid-Gewebe-Kultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Legen Sie vor der fokalen DNA-Injektion 10 Millimeter lange Agarosesäulen mit einer 225 Millimeter langen, zwei Milliliter großen Glaspipette in eine eiskalte Krebs-Lösung. Schneiden Sie mit einer chirurgischen Klinge ein kleineres Stück Agarose, um auf die Oberfläche der Elektroporationselektrode zu passen, und ein größeres Stück, das als Basis für die fokalen DNA-Injektionen verwendet werden soll.
Dann die Agaroseblöcke in eiskalte Krebslösung geben. Mischen Sie für die Injektion die Expression s- und Kontrollvektor-DNA in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Mikroliter für jeden Vektor und fügen Sie eine schnelle grüne Lagerlösung bei einer Verdünnung von eins bis zehn hinzu. Füllen Sie eine gezogene 0,5-Millimeter-Innendurchmesser, ein Milliliter Außendurchmesser Glasmikropipette mit 10 Mikroliter der DNA-Mischung und laden Sie die Mikropipette in einen pneumatischen PicoPump-Injektor.
Legen Sie den größeren Block von Agarose unter ein Stereomikroskop und legen Sie die Scheibe, die in das Stück Agarose injiziert werden soll. Dann injizieren Sie 25 bis 50-Nanoliter-Volumen in den ausgewählten medialen ganglionischen oder kaudalen ganglionischen Eminenzbereich der Scheibe. Unmittelbar nach der Injektion den kleinen Agaroseblock auf die Petrischalenelektrode legen und mit einer flachen Mikrospatula die Agarosesäule an der mobilen Abdeckungselektrode befestigen.
Übertragen Sie die injizierte Scheibe mit ihrer unterstützenden Membran auf den Agaroseblock und legen Sie die obere Elektrode mit der Agarosesäule auf den ausgewählten Bereich der Scheibe. Dann elektroporate die Region mit zwei Fünf-Millisekunden-Impulse von 125 Volt, 500 Millisekunden auseinander. Nach der Elektroporation die Scheibe mit ihrer unterstützenden Membran wieder in ihre Halteschale geben und die Schale in den Inkubator der Gewebekultur zurückgeben.
Ersetzen Sie nach einer Stunde das minimale wesentliche Medium durch ein grundlegendes Medium, das für primäre neuronale Kulturen geeignet ist, und bringen Sie die Scheiben über Nacht in den Inkubator zurück. In diesen Elektroporationsexperimenten exprimierten etwa 50% der GFP-positiven Neuronen das rFP-positive injizierte Protein und somit die GFP-positive RFP-negative Population als interne Kontrolle für die Wirkung der injizierten DNA-Liganden. Clozapin und Oxid-Verabreichung erhöht selektiv die Aktivität von transfizierten RFP-positiven Zellen, wie die Expression des aktivitätsabhängigen Proteins c-Fos in diesen neugeborenen koronalen Gewebeabschnitten zeigt.
Die Clozapin- und Oxidbehandlung führt auch zu einem Anstieg des Anteils der GFP-positiven RFP-positiven Zellen im Vergleich zur Anzahl der GFP-positiven RFP-negativen Zellen im Vergleich zu den vom Fahrzeug verabreichten Littermate. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um die Auswirkungen von aktivitätsmodulierten transplantierten Interneuronen auf die Zirkulatorische Plastizität und Gehirnfunktion des Wirts zu untersuchen.
