Das Protokoll ermöglicht eine schnelle isolierte Funktion kleiner Subpopulationen von Zellen innerhalb der Pankreasinseln von Langerhans. Zu den Vorteilen dieser Technik gehören die Echtzeit-Natur und die hohe statistische Leistung und damit die hohe Reproduzierbarkeit der erfassten Daten. Um die Inseln für die Bildgebung immobilisieren zu können, montieren Sie eine Bildkammer für ein invertiertes Mikroskop und legen Sie einen Glasdeckel in die Kammer.
Stellen Sie sicher, dass die Glaskammerschnittstelle wasserdicht ist und bestätigen Sie, dass sich der Abdeckschlupfer in Reichweite des Mikroskopobjektivs befindet. Als nächstes schneiden Sie 20 mal 20 Millimeter Quadrate aus feinem und grobem Mesh und verwenden Sie 45 bis 50 Mikrometer Stücke dicken Klebebandes, um zwei Abstandswände auf einem Stück feinem Netz zu erstellen. Tauchen Sie das grobe Netz und ein Gewicht in eine 35-Millimeter-Petrischale der Bildgebungslösung ein und legen Sie das feine Netz unter ein Sezierendes Mikroskop.
Drehen Sie das feine Netz mit den Abstandswänden auf den Kopf und den Abstandshaltern nach oben. Und verwenden Sie eine p20 Pipette, um mehrere Inselchen zwischen den beiden Abstandshaltern zu übertragen. Platzieren Sie das Netz mit Hilfe von Uhrmacherzangen kopfüber in der Bildkammer des invertierten Mikroskops, sodass die Abstandshalter nach unten zeigen, um direkt auf dem Kammerdeckelschlupf zu sitzen und die Inselchen zwischen den Abstandshaltern und dem Netz in der Mitte des Deckschlupfers einzufangen.
Achten Sie darauf, dass das Netz gut hydratisiert ist, ohne übermäßige Lösungsvolumina zu enthalten, die die seitliche Bewegung der Probe provozieren würden. Legen Sie dann das grobe Netz und das Gewicht auf das feine Netz in der Kammer, und fügen Sie der Kammer eine Bildlösung hinzu. Sobald die Inselchen immobilisiert sind, wählen Sie den Bildgebungsmodus und das Objektiv auf dem invertierten Mikroskop aus und platzieren Sie die Kammer mit den Inseln auf der temperaturgeregelten Stufe des Mikroskops.
Positionieren Sie nach dem Einstellen der Perfusion den Zufluss niedriger als der Abfluss innerhalb der Kammer, und stellen Sie den Abflussfluss so fest, dass er größer als der Zuflussfluss ist. Stellen Sie sicher, dass der Abfluss nur minimalen Kontakt mit der Lösung hat, sodass die Lösung in mehreren sequenziellen kleinen Tröpfchen entfernt wird, wodurch lange Intervalle der kontinuierlichen Lösungsentfernung vermieden werden. Als Nächstes initiieren Sie die Perfusion mit einer bildgebenden Lösung, die drei Millimolarglukose enthält, und wählen Sie den Lichtpfad und die Filter für die Abbildung grüner Fluorophore aus.
Führen Sie dann live Bildgebung aus, um die Bildparameter einzurichten und die Ansicht anzupassen, um die interessierten Inselchen zu erfassen. Um das Signal-Rausch-Verhältnis des Bildes zu optimieren, passen Sie die Anregungslichtintensität, die Belichtungszeit und das Binning an, um sicherzustellen, dass die Einstellungen eine unterschiedliche Visualisierung jeder Zelle innerhalb der Inselchen bei minimaler Lichtintensität und Belichtung ermöglichen. Dann bilden Sie die Inselchen bei 0,1 bis fünf Hertz ab und überprüfen Sie die Qualität der erfassten Daten, während sie erfasst werden.
Wenn die Alpha-Zell-Aktivität nachweisbar ist, verwenden Sie ein Online-Diagramm der Signaldynamik innerhalb der Erfassungssoftware als möglich und fügen Sie der Badlösung zwei bis fünf Minuten Adrenalin oder Glutamat hinzu. Ein schneller Anstieg des Kalziums, gefolgt von einer Verlangsamung oder Abbruch der Alphazellschwingungen, wird beobachtet. Als nächstes fügen Sie Ghrelin hinzu, das kürzlich berichtet wurde, um Deltazellen selektiv zu aktivieren.
Ein schneller reversibler Anstieg von Kalzium wird in einer kleinen Subpopulation von Isletzellen beobachtet. Dann 10 Millimolar Glukose hinzufügen. Eine koordinierte Oszillationsreaktion in der Beta-Zell-Subpopulation wird beobachtet.
Beachten Sie auch die Reaktionen von Zellen, die zuvor durch Adrenalin oder Glutamat und Ghrelin aktiviert wurden. Importieren Sie die Daten nach dem Speichern der Bilder in ein entsprechendes Datenanalyse-Softwareprogramm und normalisieren Die Rohfluoreszenzintensitätsdaten auf den Anfangswert der Fluoreszenz. Wenn der Datensatz für die Fluoreszenzintensität szendierartig von Zellen zu Zelle immer noch erheblich ist, definieren Sie einen Regelbereich für den Zeitraum, in dem die Steuerungslösung angewendet wurde.
Wenn der Kontrollbereich über ein klares nicht oszillatores Signal verfügt, gehen Sie davon aus, dass die Fluoreszenzintensität nach jeder Anwendung der Steuerungslösung wieder an die Basislinie angestiegen ist. Um die Zeitrafferdaten für jede Zelle zu korrigieren, teilen Sie die Daten in Segmente auf, die durch die Punkte getrennt sind, an denen die Steuerungslösung hinzugefügt wurde, und wenden Sie die lineare Korrektur auf jedes Segment an. Wenn der Regelbereich klare Schwingungen enthält oder zusätzliche Faktoren vorhanden sind, verwenden Sie einen Spike-Erkennungsalgorithmus.
Um die Häufigkeit von Kalziumspitzen und die Reaktion auf die Zugabe von Agonisten und Antagonisten zu messen, teilen Sie die Aufzeichnung in gleiche Zeitintervalle auf, zählen Sie die Spitzen innerhalb des Intervalls und normalisieren Sie sich auf die Intervalldauer, um den Zeitverlauf der Teilfrequenz zu berechnen. Alternativ können Sie den Schwellenwert festlegen und den Plateauanteil für jedes Intervall berechnen. Der Anteil gibt den Prozentsatz der Zeit innerhalb des Intervalls an, das die Zelle im angeregten Zustand verbracht hat.
Oder berechnen Sie die Teilfläche unter der Kurve für jedes Intervall. Wenn die Lipidzusammensetzung der Membran nicht beeinflusst wurde, laden Sichchen ziemlich gut mit tropischen Farbstoffen. Der menschliche Adenovirus Typ 5 Vektor zielt auch erfolgreich auf Islet-Zellen.
Calcium-Spiking in Alpha-Zellen kann leicht bei niedrigen Glukosespiegel nachgewiesen werden, und es gibt eine hohe Zell-für-Zell-Korrelation zwischen der Aktivität bei niedriger Glukose und der Reaktion auf Adrenalin und Glutamat. Ghrelin aktiviert einige adrenalinempfindliche Zellen bei niedriger Glukose, hat aber keinen Einfluss auf die Kalziumdynamik in den meisten Zellen, die durch niedrige Glukose aktiviert werden. Bei der Analyse in Bezug auf partielle Frequenz, Adrenalin oder Ghrelin-stimulierte Zellen zeigen eine erhebliche Zunahme unter den Alles-oder-Nichts-Bedingungen, obwohl die Gesamtänderungen zwischen Basal-Spiking und dem Adrenalin-Effekt subtil sind.
Im Gegensatz dazu ist der Teilbereich unter der Kurve empfindlich gegenüber den Veränderungen, die durch Adrenalin in allen Zellen eingeführt werden, selbst wenn die Basalaktivität hoch ist. Stellen Sie sicher, dass alle Netze mit einer bildgebenden Lösung in Kontakt sind, und achten Sie darauf, das Gewebe einigermaßen dicht zu positionieren, um Luftblasen zu vermeiden. Die Methode kann um die künstliche Intelligenz erweitert werden, um zwischen den Zelltypen zu unterscheiden.
Die pharmakologischen Marker können durch die Mustererkennungstechnologie ersetzt werden, wodurch die Aufnahmezeit reduziert wird.
