Es ist erwiesen, dass die Strukturen vieler Proteine in kovalenten Disulfidverbindungen stabilisiert sind. In neueren Arbeiten wurde diese Anleihe als post-translationale Änderung klassifiziert. Daher ist es wichtig, cysteinstabilisierte Multimerkomplexe in lebenden Zellen mit einer Methode zu identifizieren, die schnell und einfach ist.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Ergebnisse schnell, einfach und mit minimalen Kosten erzielt und interpretiert werden können. Zu Beginn, wachsen U-2 OS-Zellen in einem sechs Quadratzentimeter Schale in Minimum Essential Medium High Glucose, ergänzt mit 10%FBS und 1%Natriumpyruvat bei 37 Grad Celsius in 5%Kohlendioxid. Machen Sie einen frischen Vorrat von 10 Millimolar Iodoacetamid kurz vor der Verwendung.
Nachdem die Zellen 50 bis 60 % Konfluenz erreichen, fügen Sie 0,1 Millimolar Endkonzentration Iodoacetamid direkt in die Zellkulturmedien. Schaukeln Sie das Gericht bei Raumtemperatur zwei Minuten lang sanft. Als nächstes die Medien aus den Zellen ansaugen und die Zellen dreimal mit fünf Millilitern kalter PBS waschen.
Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie einen Milliliter kalten PBS hinzu. Scrape die Zellen von der Unterseite der Schale mit einem Zellschaber. Mit einer Ein-Milliliter-Pipette die PBS- und Zellsuspension aufstellen und die gesamte Flüssigkeit in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr geben.
Drehen Sie die Zellen bei 7, 500 mal g in vier Grad Celsius für drei Minuten. Aspirieren Sie die PBS und lassen Sie das Zellpellet zurück. Das Zellpellet kann bis zur Verarbeitung bei minus 80 Grad Celsius gelagert werden.
Um das Protein zu extrahieren, bereiten Sie 100 Mikroliter eines 1X Lysepuffers zu, der in doppelt destilliertem Wasser verdünnt ist. FÜGEN Sie PMSF unmittelbar vor der Verwendung zu einer einmillimolaren Endkonzentration hinzu. Dann 50 Mikroliter des 1X Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben und wieder aufhängen.
Den Extrakt fünf Minuten lang auf Eis brüten. Beschallen Sie für acht Sekunden mit dem konstanten Pulsmodus bei 40%, um den Extrakt auf Eis zu halten. Drehen Sie den Extrakt bei vier Grad Celsius und 16.000 mal g für fünf Minuten.
Führen Sie eine Bradford-Analyse durch, um die Proteinkonzentration zu bestimmen, falls gewünscht. Zur Zubereitung der Probe nehmen Sie 10 Mikroliter des löslichen Proteinextrakts und fügen Sie 10 Mikroliter eines 1X Laemmli SDS Probenpuffers hinzu. Halten Sie die Proben auf Eis.
Erhitzen Sie die Probe bei 85 Grad Celsius für fünf Minuten, bevor Sie das Gel laufen. Um mit der Formaldehyd-Vernetzung zu beginnen, wachsen U-2-OS-Zellen in einem 175-Quadratzentimeter-Kolben zu 70 bis 80 % Konfluenz. In einer Dunstabzugshaube das Formaldehydfixativ direkt auf das Medium auf eine Endkonzentration von 1% geben und bei Raumtemperatur mit sanfter Rührung 15 Minuten bebrüten.
Um die Reaktion zu löschen, fügen Sie 1,25 Molglycin zu einer Endkonzentration von 0,125 Molaren hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit sanfter Erregung auf einer Wippe für fünf Minuten. Waschen Sie die Zellen mit fünf Milliliterkaltem PBS dreimal. Aspirieren Sie die endgültige PBS-Waschlösung und fügen Sie 10 Milliliter PBS hinzu.
Scrape die Zellen von der Unterseite des Kolbens mit einem Zellschaber. Mit einer 10-Milliliter-Pipette die PBS- und Zellsuspension aufstellen und die gesamte Flüssigkeit in ein 15-Milliliter-Konzentrigerohr geben. Drehen Sie die Zellen bei 500 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten.
Aspirieren Sie die PBS und lassen Sie das Zellpellet zurück. Bereiten Sie 10 Milliliter des Homogenisierungspuffers vor, indem Sie 0,25 Molsaccharose, eine Millimolar-EDTA, 10 Millimolar-HEPES und 0,5%BSA bei pH 7,4 hinzufügen. Unmittelbar vor der Anwendung PMSF zu einer 1 Millimolaren Endkonzentration und drei Millilitern des Kernsuspensionspuffers hinzufügen.
Fünf Milliliter des Homogenisierungspuffers direkt in das Zellpellet geben und vollständig wieder aufsetzen. Zentrifugieren Sie die Federung bei 500 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen und das Pellet in fünf Millilitern des Homogenisierungspuffers wieder aufhängen.
Dann mit einem eng anliegenden Glas Teflon Homogenisator dounce homogenisieren die Zellen bei 10 Strichen pro 500 U/min und zentrifugieren die Suspension bei 1, 500 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Das Pellet in einem Milliliter des Kernsuspensionspuffers aufsetzen und 10 Minuten auf Eis brüten.
Nach der Inkubation zentrifugieren Sie bei 600 mal g für 10 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen, das Pellet in einem Milliliter des Kernsuspensionspuffers und der Zentrifuge wieder aufhängen. Das letzte Pellet werden die isolierten Kerne sein.
Extrahieren Sie die Proteine wie beschrieben, bevor Sie 25 Mikroliter des 1X Lysepuffers direkt in das Zellpellet geben. Dann bereiten Sie zwei Proben für SDS PAGE, indem Sie 10 Mikroliter jeder der löslichen Protein-Extrakt und fügen Sie 10 Mikroliter von 2X Laemmli SDS Probenpuffer und ein Mikroliter BME. Erhitzen Sie eine Probe bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten und die zweite Probe bei 98 Grad Celsius für 15 Minuten, um die Formaldehyd-Verbindung umzukehren.
Bereiten Sie einen Liter 1X Tris-Glycin-Laufpuffer vor, indem Sie 25 Millimolar Tris, 192 MillimolarGlycin und 0,1% Gewicht pro Volumen SD mischen. Richten Sie dann das SDS PAGE-Laufgerät ein. Öffnen Sie das TGX SDS-PAGE-Paket mit 16 % Vorguss gemäß dem Herstellerprotokoll und entfernen Sie die Kassette. Entfernen Sie den Kamm, der die Bohrungen und das Band ausdert, von der Unterseite der Kassette und legen Sie das Gel in das laufbereite Gerät.
Füllen Sie die Kammer mit dem 1X Laufpuffer, bis die Brunnen in Flüssigkeit getaucht sind. Mit einer Kunststoffpipette spülen Sie die Brunnen mit Laufpuffer aus. Laden Sie die Proben zusammen mit 10 Mikrolitern des vorgefärbten Standardmarkers auf das Gel.
Schließlich laufen Sie das Gel bei 200 Volt, bis die Farbfront etwa einen Zentimeter von der Unterseite des Gels entfernt ist. Eine Western-Blot-Analyse von Gesamtzellextrakten in Abwesenheit von BME-Reduktionsmittel zeigte eine multimere komplexe Bildung in verschiedenen menschlichen Zellpopulationen. Der Komplex verschwand mit der Zugabe von BME in allen vier untersuchten Zelllinien, was auf das Vorhandensein einer Disulfidverknüpfung hindeutet.
Die monomere Bestätigung von dUTPase in menschlichen Zellen zum Zeitpunkt der Ernte ist eine Kombination von mindestens drei der Isoformen von dUTPase: der mitochondrialen Isoform, der kerntechnischen Isoform und einer abgeschnittenen Version, die bei M24 notiert ist. Die als Kontrolle verwendete mitochondriale Isoform bildete keine Disulfidverknüpfung und wanderte auf das vorhergesagte Molekulargewicht für das monomere Protein um. Die Formaldehyd-Vernetzung von kernkraft-dUTPase zeigte eine multimere komplexe Bildung.
Als die Verbindung durch die Inkubation der Probe bei 95 Grad Celsius für 15 Minuten umgekehrt wurde, wurde der Komplex destabilisiert und konnte in seinem monomeren Zustand visualisiert werden. Die Zugabe von Iodoacetamid ist ein wichtiger Schritt in diesem Verfahren, um die freien Cysteinrückstände zu blockieren und sicherzustellen, dass die Disulfidverbindungen keine Folge des Extraktionsverfahrens sind. Es ist wichtig, daran zu denken, keine Reduzieren-Agenten wie BME oder DDT zu Ihren SDS-PAGE-Beispielen hinzuzufügen, da diese alle Disulfidverknüpfungen in Ihrer Probe reduzieren.
