Dieses physiologisch relevante chimäre Modell spontaner autoreaktiver Keimzentren ermöglicht die Verknüpfung der zellulären Lokalisation in vivo mit nachgeschalteten molekularen Analysen. Der Hauptvorteil des gemischten chimären Modells autoreaktiver Keimzentren ist seine vielseitige und marginale Natur, die das Verhören praktisch jeder gewünschten zellulären Teilmenge oder eines molekularen Pfades ermöglicht. Die physiologische Relevanz dieses Modells der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen ermöglicht neue Erkenntnisse, die die Weiterentwicklung neuer Therapien unterstützen können.
Dieses Knochenmarkchimäre Modell kann in der Immunologie, Immunonkologie und Stammzellforschung verwendet werden. Die Photoaktivierungskomponente hat eine breite Nutzung, da sie die Gewebelokalisierung mit der nachgelagerten Zellanalyse verknüpft. Die Knochenmarkpräparation und Rekonstitution sowie in vivo Etikettierung und Gewebeexplantation spropessen sich technisch komplexe Verfahren, die sich gut für visuelle Demonstrationen eignen.
Um den Spender 564Igi Maus Femur und Tibia zu extrahieren, entfernen Sie die Haut von einem Hinterglied, und pop aus dem Knie und KnöchelGelenke durch kräftiges Ziehen am Fuß. Fahren Sie fort, das Sprunggelenk zu brechen. Ziehen Sie dann den Fuß zum Körper, während Sie an der Tibia festhalten und dabei die Sehnen und Muskeln von der Tibia entfernen.
Brechen Sie das Kniegelenk, um die Tibia zu lösen, und ziehen Sie den Knochen in Richtung des Körpers, während Sie am Oberschenkelknochen festhalten, um die Sehnen und Muskeln vom Oberschenkelknochen zu entfernen. Dann machen Sie einen Schnitt am Hüftgelenk, und schneiden Sie die Sehnen, bevor Sie den Oberschenkelknochen aus der Hüfthöhle ziehen. Nach dem Entfernen der kontralateralen Hinterbeine in ähnlicher Weise, reiben Sie die Knochen vorsichtig mit einem groben Papiertuch, um alle verbleibenden Muskeln und Bindegewebe zu entfernen, und spülen Sie die abgestreiften Knochen in eiskalten Knochenmarkpuffer.
Verwenden Sie dann Dumont Nummer sieben Zangen, um die Knochen in einen Behälter mit frischem Knochenmarkpuffer auf Eis zu übertragen. Um die Knochenmarkzellen zu extrahieren, spülen Sie einen Mörtel in eiskalten Knochenmarkpuffer und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Serologische Pipette, um den Waschpuffer durch 10 Milliliter frischen, eiskalten Knochenmarkpuffer zu ersetzen. Verwenden Sie die Zange, um die Knochen auf den Mörtel zu übertragen, und verwenden Sie einen Stößel, um die Knochen zu zerkleinern und zu mahlen, um das Knochenmark freizusetzen.
Verwenden Sie die 10-Milliliter-Pipette, um den Knochenmarkextrakt zu sammeln, bevor Sie die Knochenmarklösung durch ein 70-Mikrometer-Zellsieb in eine 50-Milliliter-Konustube auf Eis übergeben. Dann spülen Sie den Mörtel mit zusätzlichen 10 Millilitern frischen, eiskalten Knochenmarkpuffer, um eine vollständige Wiederherstellung der Zellen zu gewährleisten. Um die Spendersuspensionen vorzubereiten, mischen Sie die entsprechenden Mengen an photoaktivierbarem GFP und 564Igi Spendermark in einem 50-Milliliter-Konikonröhrchen und pellet die Zellen durch Zentrifugation.
Setzen Sie das Gemischte Zellpellet mit einer Konzentration von einem mal 10 bis zu den acht Zellen pro Milliliter eiskalten Knochenmarkpuffer aus und übertragen Sie die Zellen in ein vorgekühltes, 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenrohr auf Eis. Als nächstes bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen in der anästhesierten CD45.1-Empfängermaus, und streichen Sie die Röhre der Spenderknochenmarkzellen, um eine angemessene Resuspension zu gewährleisten. 200 Mikroliter Knochenmark in eine 0,3-Milliliter-Insulinspritze mit 30-Spur-Mischung laden und mit dem Empfänger an der Seite die Haut sanft über und unter dem Auge dehnen, um das Auge leicht herauszuschlagen.
Setzen Sie die Spitze der Spritze vorsichtig in einem Winkel von ca. 30 Grad in die Vorderseite der Augenhöhle ein, wobei Sie darauf achten, das Auge und das umgebende Gewebe zu vermeiden. Wenn die Spitze der Nadel den Knochen berührt, der die Augenhöhle unterstreicht, ziehen Sie die Nadel etwa 0,5 Millimeter zurück, bevor Sie mit stetigem Druck das Spenderknochenmark langsam injizieren. Dann kehren Sie die Maus in ihren Käfig mit ad libitum Antibiotikum Wasser, mit Überwachung bis zur vollständigen Genesung.
Um den poplitealen Lymphknoten zu kennzeichnen, verdünnen Sie zwei Mikroliter mit Phycoerythrin-beschriftetem Ratten-Anti-Maus-CD169-Antikörper in 18 Mikroliter PBS und fügen Sie zwei 10-Mikroliter-Tröpfchen des Antikörpers auf ein Stück Paraffinfolie aus Kunststoff ein. Jedes Tröpfchen mit einer 30-Spur-Nadel in eine einzelne 0,3-Milliliter-Insulinspritze geben und 10 Mikroliter Antikörper in das Fußpolster des anästhesierten Empfängertiers injizieren. Vor der Ernte des Lymphknotens einen quadratischen Deckelschlupf auf eine flache Oberfläche legen und mit einer vakuumfettbelasteten Fünf-Milliliter-Spritze die Ränder des Deckels mit Fett von etwa ein bis zwei Millimetern von jeder Kante aus verfolgen.
Übertragen Sie die Kammer auf eine kalte, flache Oberfläche und füllen Sie die Vakuumfettkammer mit eiskaltem Knochenmarkpuffer. Um auf die poplitealen Lymphknoten zuzugreifen, verwenden Sie gerade, feine Scheren, um einen Schnitt in der Haut direkt unter der Kniegrube des eingeschläferten Empfängertiers zu machen, und verlängern Sie den Schnitt entlang der Hamstring-Linie fast bis zum Hüftgelenk nach oben. Mit Dumont Nummer fünf oder Zahl sieben Zangen, ziehen Sie jede der exponierten Klappen der Haut nach außen, um das Gewebe in der poplitealen Fossa zu belichten, und verwenden Sie die Zange, um vorsichtig in die Fossa nur medial in die popliteale Vene zu gelangen.
Öffnen und schließen Sie die Zangen entlang der Achse des Beins, um den darunter liegenden poplitealen Lymphknoten freizulegen, bevor Sie den Daumen und zeigefinger verwenden, um den Quadrizepsmuskel von der Vorderseite proximal bis zum Knie zu kneifen, um den Lymphknoten aus der Fossa zu knallen. Schieben Sie die Zange unter den Lymphknoten, um den Knoten aus dem umgebenden Gewebe zu befreien, und legen Sie ihn in die Vakuumfettkammer. Nachdem der zweite Lymphknoten gesammelt wurde, legen Sie einen zweiten Deckelrutsch auf die Vakuumfettfelge, und drücken Sie vorsichtig nach unten, um die Kammer zu schließen, wobei darauf zu achten ist, dass alle Luftblasen extrudiert werden.
Um die Keimzentren in geernteten Milzgewebeproben zu identifizieren, legen Sie die Bildkammer auf die Bühne eines zweiphotonen fluoreszierenden Mikroskops und verwenden Sie eine 3,5-Milliliter-Kunststoff-Transferpipette, um einen Tropfen destilliertes Wasser auf den oberen Deckelschlupf zu legen. Senken Sie das Ziel bis zur Kontaktstelle, und verwenden Sie das übertragene Licht, um sich auf die Oberseite des Gewebes zu konzentrieren. Wechseln Sie in den dunklen Modus und die Zwei-Photonen-Erregung, und stimmen Sie den Laser auf 940 Nanometer ab.
Suchen Sie die einzelnen Weißzellstoffbereiche, die von der CD169-Färbung in der Nähe der Oberfläche des Gewebes umrandet sind, und identifizieren Sie die periarteriolar lymphoide Hülle durch die zweite Harmonische Generation, die mit der zentralen Arteriole verbunden ist. Identifizieren Sie in der Zone zwischen der periarteriolaren Lymphhülle und der Randzone das Vorhandensein von stark autofluoreszierenden, aktivierten Tingible-Body-Makrophagen und zeichnen mit diesen Landmarken eine Interessensregion um einen einzigen Keimzentrumsbereich. Richten Sie dann einen Z-Stack von etwa 100 bis 150 Mikrometern Tiefe ein, beginnend von der Oberfläche des Gewebes und mit einer Schrittgröße von etwa drei Mikrometern, bevor Sie auf eine 830-Nanometer-Erregungswellenlänge wechseln.
Schalten Sie alle Kanäle aus oder verziehen Sie sie, um Photoschäden an den Detektoren zu verhindern, und richten Sie den Stapel ab. Wechseln Sie dann zurück zur 940-Nanometer-Erregungswellenlänge, und öffnen Sie die Kanäle erneut, indem Sie den Stapel scannen, um eine effiziente Photoaktivierung und das Fehlen von Photoschäden im gesamten Bildstapel zu bestätigen. Die Serotypisierung der gemischten Knochenmarkchimären zeigt normalisierte B-Zellzahlen nach sechs Wochen nach der Rekonstitution, wobei eine niedrige Frequenz von 9D11-positiven zirkulierenden B-Zellen aus dem 564Igi-Fach abgeleitet ist.
Innerhalb des gesamten Lymphozyten-Gatter-Tors gab es eine niedrige Häufigkeit von Rest-Empfänger-abgeleiteten Zellen, von denen etwa 6% CD45.1-abgeleitet sind, was auf einen Gesamtgrad der Chimäre von etwa 94% hindeutet. Es gab einen nahezu vollständigen Chimärenismus im B-Zellkompartiment und eine Dominanz photoaktivierbarer GFP-Knochenmark-abgeleiteter B-Zellen, eine Folge der schweren negativen Selektion von 564Igi-abgeleiteten Zellen. Wie bereits beobachtet, ermöglicht die In-vivo-Kennzeichnung mit CD169 eine robuste Visualisierung der Grenzzone. Das zweite harmonische Signal zeigt sich in kollagenhaltigen Strukturelementen und wichtigen Gefäßen, einschließlich der zentralen Arteriole der periarteriolaren Lymphhülle und hochautofluoreszierenden, aktivierten Tingible-Body-Makrophagen, die mit der keimnahen Zentrumsaktivität verbunden sind.
Zusammengenommen ermöglichen diese Daten die Identifizierung einer Interessenregion, die wahrscheinlich ein einziges, photoaktivierbares Keimzentrum enthält. Die zytometrische Auswertung des Downstream-Flusses bestätigt ferner das Vorhandensein normalisierter B-Zellkompartimentzahlen, einer spontanen keimzentrierten Population und einer Teilmenge photoaktivierter Keimzentrums-B-Zellen. Es ist wichtig, die Gesamtdurchlaufzeit von Explanting-, Photoaktivierungs- und Gewebeverarbeitungsschritten auf vier bis sechs Stunden zu beschränken, um eine ausreichende Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.
Die photoaktivierten Zellen können durchflusssortsortiert und einer einzelzelligen Sequenzierung unterzogen werden, um beispielsweise das B-Zell-Rezeptor-Repertoire eines einzelnen Keimzentrums zu charakterisieren. Das gemischte Chimärenmodell hat die Erforschung der autoreaktiven Keimzentrumsbiologie in einer neuen Tiefe ermöglicht, zum Beispiel einen Einblick in die Entwicklung des Prozesses der Epitopausbreitung. Beachten Sie, dass die Lichtquelle für die Zwei-Photonen-Mikroskopie sehr leistungsfähige gepulste Klasse-4-Laser sind, die die Augen stark schädigen können.
