Die Röntgenkristallographie ist die vorherrschende Technik zur Bestimmung von 3D-Strukturinformationen aus Proteinen. Synchrotronstrahlleitungen werden benötigt, um Daten aus den kleinen, schwach diffrierenden Kristallen zu erhalten, die die Proteine produzieren. Massive ist eine einzigartige Strahllinie, weil sie den Prozess der Datenerfassung aus biologischen Makromolekülen vollständig automatisiert.
Von der Probenmontage, dem Speicherort und der endgültigen Datenerfassung. Eine vollständige Automatisierung dieser Art ist sehr wichtig, da sie es Forschern ermöglicht, ihre Zeit im Labor zu verbringen, anstatt Daten auf der Strahllinie zu sammeln. Die Strahllinie ist auch intelligent und kann im Durchschnitt bessere Daten sammeln, als wenn die Strahlleitung von Menschen betrieben wird.
Um dieses Protokoll zu beginnen, führen Sie die Kristallmontage durch und fordern Sie die Balkenzeit auf Massive one an, wie im Textprotokoll beschrieben. Navigieren Sie zum Informationssystem für Proteinkristallographiestrahllinien oder zur ISPyB-Website. Wählen Sie MX-Experimente, melden Sie sich mit der Experimentnummer und dem Passwort an.
Klicken Sie auf Die Auslieferung, fügen Sie neue hinzu und geben Sie die erforderlichen Informationen an. Klicken Sie dann auf Speichern. Klicken Sie auf Flurstück hinzufügen, und geben Sie die angeforderten Informationen ein.
Klicken Sie auf Speichern, und klicken Sie dann auf Container hinzufügen. Geben Sie den Puck Barcode als Namen, und wählen Sie Wirbelsäule Puck, wieder klicken Sie auf speichern. Klicken Sie auf das Containersymbol und bearbeiten Sie, und füllen Sie die notwendigen Informationen über die Proben wie Proteinname, bevorzugten Arbeitsablauf und Kristallposition, in der Puck.
Wählen Sie das Protein aus, das von der ESRF-Sicherheitsgruppe zugelassen wurde. Geben Sie einen eindeutigen Beispielnamen ein, um jedes einzelne Beispiel zu identifizieren. Optional scannen Sie den Pin-Barcode.
Der Rest der einzuschließenden Informationen ist ebenfalls optional. Geben Sie für jede einzelne Stichprobe den Versuchstyp ein. Dadurch wird festgelegt, welcher automatische Workflow für die Verarbeitung jedes Kristalls verwendet wird.
Da die GCSH-Kristallen Nadeln sind, wählen Sie MX-Taste P.Next, geben Sie eine Raumgruppe ein. Wenn vorhanden, wird dies für Datenerfassungsstrategieberechnungen und für die verfügbaren automatischen Datenverarbeitungsleitungen verwendet. Geben Sie die gewünschte Auflösung ein.
Dadurch wird der Kristall-Zu-Detektor-Abstand von den anfänglichen Netzscans, der Charakterisierung und der Standarddatensammlung definiert. Legen Sie nun die gewünschte Schwellenwertauflösung fest, um das Sammeln vollständiger Datensätze von Kristallen zu verhindern, die nicht auf diese Grenze reagieren. Dadurch können Datenspeicherspeicher gespart und Zeit analysiert werden.
Legen Sie die erforderliche Vollständigkeit fest. Legen Sie dann die erforderliche Multiplizität fest. Wenn mehr als ein Kristall auf der Probenstütze enthalten ist, legen Sie die maximale Anzahl der zu analysierenden Kristalle fest.
Der Standardwert ist ein oder fünf für MX-Presse P. Die entsprechende Strahlgröße kann ebenfalls ausgewählt werden. Legen Sie die Raumgruppe, falls bekannt, in die Spalte "Kraftraumgruppe" ein. Stellen Sie dann die Strahlenempfindlichkeit der Kristalle ein.
Legen Sie bei Bedarf den Gesamtdrehwinkel fest, der für die vollständige Datensatzsammlung erfasst werden soll. Sobald alle Informationen in das System eingegeben wurden, speichern Sie die Werte. Klicken Sie auf, kehren Sie zu den Sendungen zurück und drücken Sie den Versand an ESRF.
Drucken Sie das Versandetikett aus und senden Sie die Muster. Benutzer sollten eine Abholung mit einem Kurier über die ESRF-Kontodaten arrangieren. Am Tag des Experiments werden die Proben auf den Massiven Tau-er mit hoher Kapazität übertragen.
Strahllinien-Wissenschaftler starten dann die Datensammlung, die von Benutzern aus der Ferne verfolgt werden kann. Für jeden einzelnen Beispieltyp erhalten Benutzer eine E-Mail, in der sie darüber informiert werden, dass die Datensammlung gestartet wurde. Die Ausführung aller Schritte in allen Workflows kann online und in Echtzeit verfolgt werden.
Dies ist für den Benutzer durch die Anmeldung bei ISPyB zugänglich. Die Ergebnisse können auch eingesehen und heruntergeladen werden. Untersuchen Sie für jedes analysierte Beispiel die Ergebnisse des automatischen Experiments auf ISPyB.
Klicken Sie auf die gewünschte experimentelle Sitzung unter ID30A1. Wählen Sie die bevorzugte automatische Verarbeitungspipeline aus. Laden Sie die in der richtigen Raumgruppe geschriebenen Daten mit höchster Vollständigkeit und höchster Auflösung herunter.
Durch Anklicken der letzten Sammeln Von Ergebnissen und anschließendes Herunterladen. Der MX-Press-P-Workflow wurde von der ESRF-Strahllinie Massive one verwendet, um vollautomatisch zu montieren, im Röntgenstrahl zu zentrieren, zu charakterisieren und vollständige Beugungsdatensätze aus einer Reihe von Kristallen menschlicher GCSH zu sammeln. Die Proben wurden montiert und die Schleife für einen zu scannenden Bereich analysiert.
Nach den Beugungsanalysen wurden vier Punkte innerhalb des Kristalls für die Datenerhebung ausgewählt. Die manuelle Strukturbestimmung durch molekularen Ersatz ergab eine hochwertige Elektronendichtekarte nach einem einzigen automatisierten Verfeinerungszyklus. Für diesen Datensatz schnitt die automatisierte Pipeline die Daten mit einer Ein-Punkt-Drei-Angstrom-Auflösung.
Benutzer können jedoch entscheiden, die Daten mit einer niedrigeren Auflösung zu schneiden. Kontinuierliche Elektronendichte ist für die gesamte Aminosäurekette mit Ausnahme des eterminalen Histidin-Tags sichtbar. Von den vier Substitutionen, die das GCSH von Mensch und Rind unterscheiden, sind drei in der Elektronendichte leicht identifizierbar.
Dies ist weniger klar für die Aspartinsäure Zu Lysin 125 Substitution. Für die die Elektronendichte der Seitenkette aufgrund von Flexibilität nur teilweise aufgelöst wird. Das aktuell erhaltene Modell hat einen R-Arbeitswert von 20 Punkt vier Prozent und einen R-freien Wert von 23 Punkt enacht Prozent und kann durch zusätzliche Zyklen des automatisierten und manuellen Modellbaus und der Veredelung weiter optimiert werden.
Es ist wichtig, die Anforderungen an Ihr System anzupassen. Wenn Sie beispielsweise die bereits beobachtete Auflösung auf einen bekannten Wert festlegen, können Sie Zeit sparen und eine bessere Datenerfassung sicherstellen. Die vollautomatische Datenerfassung hat die Kristallographie demokratisiert und jetzt können selbst kleine Labore ein berühmtes Projekt in Angriff nehmen, als dies bisher nur mit enormer Mannskraft machbar war.
