Es ist eine genaue und hohe Durchsatzmethode zur Messung von RSV-Neutralisationsantikörpern erforderlich, als wichtiger Marker für den Schutz vor respiratorischen Synzytialviren. Diese Methode ist sehr reproduzierbar mit Inter-Assay-Variationen für das Referenzantiserum unter 10%Wir glauben, dass dieser Assay in vielen Laboratorien weltweit zu relativ niedrigen Kosten leicht etabliert werden kann. Wir beschreiben hier einen bildgebenden Mikroneutralisationstest, der auf RSV-Untergruppe A getestet wurde und auch für Die RSV-Untergruppe B und verschiedene Probentypen angepasst werden kann.
Demonstriert wird das Verfahren von Reuben Tse, einem Mitglied des Forschungsteams von MCRI. Um Platten am ersten Tag auszusäen, setzen Sie zuerst A549-Zellen in DMEM-Medien mit 10%FCS und 1.000 Einheiten Penicillin-Streptomycin-Mischung in einer Konzentration von 400.000 Zellen pro Milliliter wieder aus. Dann säen Sie 96-gut flache sterile Platten mit 40 000 A459 Zellen mit einer Dichte von 100 Mikrolitern pro Brunnen.
Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung über Nacht. Um die Serumverdünnung am zweiten Tag vorzubereiten, tauen zunächst die menschlichen RSV-Referenzserum- und Serumtestproben bei Raumtemperatur auf. Dann legen Sie sie in einem Wasserbad bei 56 Grad Celsius für 30 Minuten zu erhitzen und zu aktivieren.
Als nächstes bereiten Sie mehr als 110 Mikroliter einer ein bis 100 Verdünnung des Referenzserums vor, indem Sie 1,5 Mikroliter des Referenzserums mit FCS-freien DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung auf ein Endvolumen von 150 Mikrolitern mischen. Pipette 110 Mikroliter dieser Verdünnung in gut A12 einer 96-Well U-Boden sterilen Platte. Um serielle ein bis zwei Verdünnungen auf der Platte zu machen, fügen Sie zunächst 55 Mikroliter FCS-freie DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung zu den Brunnen B12 bis H12 hinzu.
Dann mit einer neuen Spitze transferieren 55 Mikroliter von gut A12 auf gut B12. Pipette nach oben und unten fünf Mal, um die Lösung zu mischen, und weiter, bis Sie gut H12 erreichen. Pipette aus den überschüssigen 55 Mikroliter der Lösung von gut H12.
Als nächstes bereiten Sie eine einbis 100 Verdünnung der Serumproben vor und fügen Sie 110 Mikroliter jeder Verdünnung zu den entsprechenden Bohrungen A1 bis A9 und E1 bis E9 der 96-well sterilen Platte hinzu. Dann 55 Mikroliter FCS-freies DMEM-Medium mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in die Bohrungen eins bis neun geben. Machen Sie seriell einbis zwei Verdünnungen von Zeile A in Zeile D und von Zeile E in Zeile H, wie zuvor beschrieben.
Fügen Sie 55 Mikroliter FCS-freies DMEM-Medium mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in die Brunnen in den Spalten 10 und 11 ein. Um den Virusbestand vorzubereiten, legen Sie zunächst eine gefrorene Durchstechflasche RSV in ein 37 Grad Celsius Wasserbad, um ihn schnell aufzutauen, und legen Sie dann die Durchstechflasche auf Eis. Als nächstes fügen Sie das Virus zu den DMEM-Medien, die Penicillin-Streptomycin-Mischung bei etwa 200 PFU pro Brunnen, um ein Gesamtvolumen von 55 Milliliter für 100 Brunnen zu machen.
Um die Virusserummischung vorzubereiten, fügen Sie zunächst 55 Mikroliter des verdünnten Virus in alle Brunnen der Spalten eins bis neun und Brunnen der Zeilen E bis H der Spalten 10 und 11 hinzu. Dann 55 Mikroliter FCS-freie DMEM-Medien mit Penicillin-Streptomycin-Mischung in alle Brunnen der Reihen A bis D der Spalten 10 und 11 geben und die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid-Umgebung für eine Stunde bebrüten. Untersuchen Sie vor der Impfung von A549-Zellen mit RSV die Zellplatte unter einem Lichtmikroskop, um zu bestätigen, dass A549-Zellmonolayer zu 80 % konfluent sind.
Dann invertieren Sie die Platte sanft, um die Medien zu entsorgen, und bersten Sie die Platte leicht auf einem sterilen saugfähigen Papiertuch. Danach mit gefiltertem sterilem PBS waschen. Als nächstes 100 Mikroliter pro Brunnen des Virusserumgemisches in die entsprechenden Brunnen auf der A549-Zellplatte nach der im Manuskript enthaltenen Plattenschablone geben und die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für eine Stunde bebrüten.
Verwenden Sie am Ende der Inkubation eine Pipette, um 90 Mikroliter pro Bohrgut zu entfernen, und fügen Sie 100 Mikroliter der Medien hinzu, die 1XM199, 1,5%CMC und 2%FCS in Penicillin-Streptomycin-Mischung enthalten. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für drei Tage. Um eine Assayplatte zu fixieren und zu entwickeln, kehren Sie zunächst die RSV-infizierte A549-Zellplatte vorsichtig um, um die Medien mit M199, CMC, 2%FCS und Penicillin-Streptomycin-Mischung zu entsorgen.
Dann fügen Sie langsam 200 Mikroliter Fixationspuffer zu jedem Brunnen hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei minus 20 Grad Celsius für 20 Minuten. Dann entsorgen Sie den Fixierungspuffer und blots sanft auf einem saugfähigen Papiertuch.
Lassen Sie die Platte 10 Minuten lang mit dem Gesicht nach unten trocknen. Dann mit gefilterten PBS-Puffer enthält 05 Polysorbat 20, machen 5%Milch-Blockierungslösung. Fügen Sie 200 Mikroliter der Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
Am Ende der Inkubation die Platte sanft umkehren, um die Lösung zu entsorgen und auf einem saugfähigen Papiertuch zu bleben. Um den primären Antikörper herzustellen, verdünnen Sie einen bis 500 Ziegen XRSV Antikörper in der Blockierlösung. Fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Platte bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Waschen Sie die Platte dreimal mit gefiltertem PBS-Polysorbat. Als nächstes machen Sie den sekundären Antikörper, indem Sie ein bis 5.000 Alexa Fluor Esel Anti-Ziegen-Immunglobulin G in der Blockierlösung verdünnen. Fügen Sie 50 Mikroliter zu jedem Brunnen hinzu und brüten bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.
Waschen Sie die Platte fünfmal mit gefiltertem PBS-Polysorbat. Um Plaques mit einem automatisierten Spot-Reader zu zählen, verwenden Sie zunächst eine ungenutzte 96-Well-Kulturplatte, um das Instrument zusammenzuarbeiten, indem Sie die Zähleinstellungen im FITC-Kanal eingeben. Lesen Sie dann die Zellplatte, wickeln Sie sie in Folie und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Überprüfen Sie als Nächstes die Bilder von Brunnen auf Artefakt-Plaques oder gestörte Zellmonolayer und schließen Sie Brunnen mit gestörten Zellmonolayern aus. Die durchschnittliche Anzahl der Plaques der No-Serum-Kontrollbrunnen wurde berechnet und verwendet, um die 50%-Neutralisationsabschaltung zu bestimmen, die zu einer 50%igen Hemmung der Virusaktivität führen würde. Die reziproke Serumverdünnung wurde auf der x-Achse und die Anzahl der Plaques auf der y-Achse eines Halbprotokolldiagramms aus einer Linie zwischen den beiden Punkten gezeichnet.
Die 50%neutralisationstitres der Testserumproben waren rot und Serumverdünnungen mit Anzahlen unmittelbar über oder unter dem 50%-Wert der No-Serum-Kontrollbrunnen wurden identifiziert. RSVAPRN-Assays in zwei verschiedenen erwachsenen Kohorten aus Gambia und gesunden Freiwilligen in Melbourne führten dazu, dass die gambischen Erwachsenen im Vergleich zu den Erwachsenen in Melbourne einen niedrigeren mittleren NAB-Titer hatten. Das gezeigte humane RSV-Referenzserum weist eine sehr geringe Variabilität mit dem Variationskoeffizienten von 6,82% dieser verbesserte RSV-Plaquereduktions-Neutralisationstest mit hohem Durchsatz kann leicht in vielen Laboratorien implementiert werden und wird die internationalen Harmonisierungsbemühungen der WHO für RSV-neutralisierende Antikörper-Assays unterstützen.
Dies wird für die Bewertung neuer RSV-Impfstoffkandidaten in Zukunft von entscheidender Bedeutung sein.
