Diese Methode ermöglicht die Erzeugung einer großen Anzahl von menschlichen Leberknospenvorläufern und Hepatozyten-ähnlichen Zellen mit hoher Reinheit. Die Fähigkeit, diese Leberzellen zu erzeugen, könnte für die regenerative Medizin und andere Bereiche wichtig sein. Durch die Steuerung der entwicklungsfördernden Signalwege zur Förderung der Leberdifferenzierung und Unterdrückung der Bildung unerwünschter Zelltypen ermöglicht diese Methode eine effiziente Generierung von menschlichen Leberknospenvorläufern und hepatozytenähnlichen Zellen um sechs bzw. 18 Tage Differenzierung.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die hohe Reinheit der menschlichen Leberzellen erzeugt. Um dieses Verfahren zu sein, fügen Sie 50 Milliliter IMDM zu einem konischen Kolben hinzu, der einen Rührbalken enthält. Erhitzen Sie das Medium auf 50 Grad Celsius und fügen Sie 0,5 Gramm PVA hinzu, während Sie kontinuierlich rühren, um einen PVA-Bestand mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter vorzubereiten.
Danach entfernen Sie die PVA-Lösung aus dem Heizkissen und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen. Sobald die Lösung abgekühlt ist, filtern Sie sie durch einen sterilen 0,2 Mikrometer Filter. Bereiten Sie CDM2 und CDM3 vor, indem Sie die gefilterte PVA mit anderen Reagenzien kombinieren, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben.
Verwenden Sie einen sterilen 0,2 Mikrometer-Filter, um alle Medien zu filtern. Bereiten Sie dann die verbleibenden Basismedien CDM4 und CDM5 vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Um das Differenzierungsmedium vorzubereiten, tauen Sie zunächst die gefrorenen kleinen Moleküle und/oder Wachstumsfaktoren bei Raumtemperatur auf.
Aliquot out die erforderliche Menge an Basismedium und fügen Sie die angegebenen kleinen Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Basismedium in den entsprechenden Konzentrationen. Am Vortag vor Gebrauch, tauen Sie die Matrix bei vier Grad Celsius. Verdünnen Sie am nächsten Tag die Matrix im Verhältnis eins zu 100, indem Sie 500 Mikroliter Matrix in 50 Milliliter kaltes DMEM hinzufügen.
Pipette die verdünnte Matrix in die erforderliche Anzahl von Brunnen mit gerade genug Volumen der Lösung, um die Oberfläche des Brunnens zu bedecken. Übertragen Sie die matrixbeschichtete Platte mindestens 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Unmittelbar vor der Aussaat die verbleibende Matrixlösung aus den beschichteten Brunnen absaugen.
Dann, saugen Sie das Medium von einer weitgehend konfluenten hPSC-Kulturplatte und fügen Sie kommerziell gekaufte Dissoziationsmittel hinzu, um sicherzustellen, dass sie gerade genug verwenden, um die Oberfläche zu bedecken, auf der die Zellen wachsen. Inkubieren Sie die hPSCs im Dissoziationsmittel bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten oder bis einige Kolonien beginnen, sich zu lösen. Fügen Sie als Nächstes DMEM und F-12 hinzu, um das Dissoziationsmittel zu verdünnen.
Verwenden Sie eine serologische Pipette mit fünf Millilitern, um die Pipette mehrmals nach oben und unten zu pipette, um alle Zellen von der Oberfläche des Brunnens abzuwaschen. Sammeln Sie die resuspendierten Einzelzellen in einem 50 Milliliter konischen Rohr und verdünnen Sie sie bei Bedarf mit DMEM und F-12. Zentrifugieren Sie dieses Rohr von gesammelten hPSCs bei 350 mal g und bei vier Grad Celsius für drei Minuten, um die Zellen zu pellet.
Während Sie auf die Zentrifugation warten, saugen Sie die Matrix von der Platte ab, in der die hPSCs gesät werden. Fügen Sie eine ausreichende Menge an mTeSR-Medien zu Dentrinsbrunnen hinzu, um sie abzudecken. Wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist, saugen Sie vorsichtig den Überstand an und lassen Sie die pelletierten hPSCs an der Unterseite des konischen Rohres.
Setzen Sie das Zellpellet in mTeSR mit einem Mikromolaren aus kommerziell erhaltenem Thiazovivin auf. Mit einer P1000 Pipette zwei- bis dreimal sanft trituieren, um das Zellpellet gleichmäßig in eine Einzelzellsuspension zurückzusetzen. Sofort 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein Hämozytometer pipette und die Anzahl der Zellen zählen.
Passen Sie das Volumen der resuspendierten hPSCs mit Thiazovivin-ergänztem mTeSR an, um die gewünschte Zellkonzentration für die Beschichtung zu erreichen. Schütteln Sie dann die Platte mehrmals in einem Kreuzmuster, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind. Nachdem die hPSCs mindestens 24 Stunden lang plattiert wurden, verwenden Sie ein Phasenkontrastmikroskop, um die Morphologie der Zellen mit besonderem Schwerpunkt auf dem Durchmesser der plattierten hPSC-Kolonien zu überprüfen.
Bereiten Sie als Nächstes das APS-Differenzierungsmedium tag1 vor, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben. Einen Tag nach der Aussaat die Thiazovivin-ergänzten mTeSR von den beschichteten hPSCs ansaugen und kurz mit IMDM-Medien waschen. Fügen Sie danach Tag einMedium zu den hPSCs hinzu.
Zeichnen Sie die Zeit auf und legen Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius wieder in den Inkubator. Fahren Sie mit den nachfolgenden Differenzierungsschritten fort, indem Sie das benötigte Differenzierungsmedium vorbereiten und es den Zellen an den jeweiligen Tagen der Differenzierung um die gleiche Tageszeit hinzufügen. In dieser Studie werden angereicherte Populationen von Leberknospenvorläufern und anschließend hepatozytenähnlichen Zellen aus hPSCs erzeugt.
Am zweiten Tag der Differenzierung haben sich primitive Streifenzellen in Tag zwei definitive Endodermzellen differenziert. Die überwiegende Mehrheit dieser Zellen drückt SOX17 und FOXA2 aus. Am dritten Tag der Differenzierung haben sich die Endodermzellen in Vorgut-Vorläufer differenziert, die polygonal in der Form erscheinen.
Später, am sechsten Tag, haben sich die Vorgut-Vorläufer in Leberknospen-Vorläufer unterschieden. Diese Leberknospen-Vorläufer drücken AFP, TPX3 und HNF4alpha aus. Über drei hPSC-Linien erzeugt diese Methode Tag sechs AFP-positive Lebervorläufer mit einer Effizienz von ca. 89%Schließlich erscheinen nach 18 Tagen Leberdifferenzierung von hPSCs Albumin-positive Hepatozyten-ähnliche Zellen.
Morphologisch erscheinen diese Zellen epitheliale und bilden helle Ränder, die an Gallenkanaliculi erinnern. In diesem Stadium erscheint das Zytoplasma des Tages 18 hPSC-abgeleitete Hepatozyten dunkler als der Kern. Bei der Aussaat menschlicher pluripotenter Stammzellen zur Differenzierung ist es unerlässlich, sie mit der richtigen Dichte auszusäen und sie auch durch Schütteln der Platte über den Brunnen zu verteilen.
Die Fähigkeit, menschliche Hepatozyten in vitro zu produzieren, ist eine basisklastige Technologie, die es Wissenschaftlern ermöglicht, Mechanismen zu untersuchen, die der Leberentwicklung zugrunde liegen. Diese Methode produziert eine große Anzahl von menschlichen Hepatozyten in vitro, die verwendet werden könnten, um Leberfunktion und Krankheit zu untersuchen und schließlich neue Therapien für Leberversagen zu ermöglichen.
