Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie biofilmentwicklung, wie zum Beispiel, wie man wichtige Umweltbedingungen identifiziert, die das Wachstum von Biofilmen und Verhaltensmerkmale während der Entwicklung beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die mehrkanaligen, mikrofluidischen Platten eine schnelle Erfassung statistisch signifikanter Ergebnisse ermöglichen. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Biofilmstruktur geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung von Antibiotika-Behandlungen und Bio-Remediation angewendet werden.
Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Kämpfen, weil sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Details des Protokolls und akribische Fähigkeiten erforderlich sind. Um einen Fehler bei der Verbindung des Instruments mit der Software zu vermeiden, schalten Sie zuerst den PC-Arbeitsplatz ein, gefolgt vom Fluoreszenzmodul. Stellen Sie sicher, dass der Fluoreszenz-Verschluss eingeschaltet ist, und schalten Sie die Hardware-Controller ein.
Schalten Sie als Nächstes den Imaging-Systemcontroller und die CCD-Kamera ein. Schalten Sie dann die Bildverarbeitungsstation ein. Wenn das gesamte Gerät fertig ist, starten Sie die Steuerungsanwendung und geben Sie das Kennzeichen ein, das sich auf dem Etikett auf der Seite der Platte befindet.
Für die Grundierung entfernen Sie zunächst die 48 gut mikrofluidische Platte aus der Verpackung, ohne die Glasoberfläche an der Unterseite der Platte zu berühren, und reinigen Sie den Glasschlitten am Plattenboden mit einem Linsengewebe. Um die mikrofluidischen Kanäle zu grundieren, Pipette 200 Mikroliter von 37 Grad Celsius minimalen Medium in den Ausgang gut, mit Vorsicht, Blasen zu vermeiden. Legen Sie die Platte dann auf die Plattenbühne.
Wischen Sie die Schnittstelle mit Ethanol ab und versiegeln Sie sie auf der Plattenbühne, sobald das Ethanol getrocknet ist. Stellen Sie im manuellen Modus am Steuermodul die Flüssigkeit als Luria-Bertani-Brühe auf 37 Grad Celsius und max. schiere als fünf Dym pro Quadratzentimeter ein. Klicken Sie auf die Ausgangsbohrungen, um den Fluss vom Ausgang zum Eingangsbrunnen zu aktivieren, um die Kanäle zu grundieren.
Nach fünf Minuten den Fluss anhalten, um sich auf die Aussaat vorzubereiten, und entfernen Sie die Platte vorsichtig von der Bühne. Dann, aspirieren Sie ein beliebiges Restmedium aus dem Ausgang gut, ohne ein Medium aus dem inneren Kreis zu entfernen, das zu den mikrofluidischen Kanälen führt. Um die experimentellen Kanäle auszusäen, fügen Sie 300 Mikroliter minimalen Mediums in den Inputbrunnen, gefolgt von der Zugabe von 300 Mikrolitern Bakterienkultur, in den Output gut.
Bringen Sie die Platte auf die Bildaufnahmestufe zurück, um sicherzustellen, dass die Schnittstelle mit Ethanol abwischt, bevor Sie sie auf die Platte legen, und verwenden Sie den Live-Kamera-Feed, um sich auf einen einzigen Kanal zu konzentrieren. Während der visuellen Überwachung des Live-Feeds, nehmen Sie den Fluss bei 1 bis 2 Dym pro Quadratzentimeter für etwa 2 bis 4 Sekunden, Um die Zellen in den experimentellen Kanal zu ermöglichen, aber nicht die Serpentinkanäle, und lassen Sie die Platte auf der temperaturgesteuerten Stufe für eine Stunde, damit die Zellen anhaften. Am Ende der Befestigungszeit die Platte vorsichtig von der Bühne entfernen und die Bakterien aus dem Ausgang gut absaugen, ohne den Kanal zu stören.
Verwenden Sie dann eine neue Pipettenspitze, um das Medium aus den Eingangsbrunnen zu entfernen. Öffnen Sie in der Software die mehrdimensionale Erfassung, um die Bildaufnahme des Mikroskops zu steuern, und wählen Sie Zeitraffer, mehrere Stufenpositionen und mehrere Wellenlängen aus. Erstellen Sie auf der Registerkarte Speichern einen einfachen Basisnamen, der sicherstellt, dass der Basisname für Incroments, falls eine Datei vorhanden ist, aktiviert ist.
Fügen Sie alle wesentlichen Details des Experiments in die Beschreibung ein. Klicken Sie auf Verzeichnis auswählen, um den Ordner auszuwählen, in dem alle Dateien gespeichert werden. Verwenden Sie den Live-Kamera-Feed und das 10-fache Ziel, um die Bühnenpositionen einzustellen, wobei sie sich auf die Mitte des Kanals konzentrieren, der sich oberhalb oder unterhalb der auf der Platte eingravierten Kanalnummern befindet.
Wechseln Sie zum 20-fachen Objektiv, und suchen Sie den optimalen Anzeigebereich und die Fokusebene innerhalb des Kanals. Fügen Sie dann die Bühnenposition mit den neuen Einstellungen zur Liste hinzu. Legen Sie im Wellenlängenmenü die Anzahl der Wellenlängen auf 3 fest, und legen Sie die erste Wellenlänge auf FITC 100%kamera, mit einer Belichtungszeit von zehn Millisekunden, die zweite Wellenlänge zu hellfeld 50%Kamera 50% sichtbar, mit einer minimalen Belichtungszeit von 3 Millisekunden und die dritte Wellenlänge zu allen geschlossen, so dass kein Licht auf dem letzten Kanal zwischen den Erfassungszeiten bleibt.
Öffnen Sie im Menü AutoRun bearbeiten die Registerkarte Protokolleinrichtung, und legen Sie ein neues Protokoll mit einer Dauer von 24 Stunden fest, wobei der Flow in Vorwärtsrichtung mit der entsprechenden experimentellen Scherrate eingestellt ist. Klicken Sie auf Hinzufügen und Speichern, um das Protokoll zu speichern und die Registerkarte Sequenzeinrichtung zu öffnen. Um eine neue Sequenz einzurichten, wählen Sie Luria-Bertani Brühe bei 37 Grad, als Standardflüssigkeit für alle Kanäle.
Wählen Sie unter Schrittiteration 1 für die Kanäle 1 bis 12 das Protokoll mit der ersten experimentellen Scherrate aus und aktivieren Sie alle Kanäle. Wählen Sie für die Kanäle 13 bis 24 das Protokoll mit der zweiten experimentellen Scherrate aus und aktivieren Sie alle Kanäle. Wählen Sie dann Anwenden und Speichern unter aus, um die Sequenz zu speichern und das AutoRun-Menü zu öffnen, um die gespeicherte Sequenz auszuwählen, die für den AutoRun verwendet werden soll.
Um das zeitnahe Wachstums-Biofilmexperiment einzurichten, fügen Sie bis zu 1300 Mikroliter steriles minimales Medium in den Eingangsbrunnen der mikrofluidischen Platte ein und geben sie in die Bildaufnahme zurück. Wischen Sie dann die Schnittstelle mit Ethanol ab und versiegeln Sie die Platte. Vergewissern Sie sich, dass die Protokolle und Sequenzen ordnungsgemäß eingerichtet sind.
Wählen Sie Start aus, um den AutoRun zu starten, und klicken Sie sofort auf Abrufen, um die Bildsammlung des Mikroskops zu starten. Klicken Sie am Ende der ersten Bildaufnahme auf Pause, und wählen Sie den Livebildmodus in der Wellenlänge des hellfelden aus. Wählen Sie zum Anzeigen jeder Bühnenposition und zum Festlegen der neuen Einstellungen aus, um jede Bühnenposition anzuzeigen, und wählen Sie auf aktuell gesetzt aus.
Klicken Sie dann auf "Fortsetzen", bevor Sie mit der nächsten geplanten Erfassung beginnen. In diesem repräsentativen zeitgefristeten Biofilmwachstumsexperiment war die Biofilmabdeckung oder die prozentuale Schwellenoberfläche für alle drei Schereinstellungen unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass die Schere einen direkten Einfluss auf die Abdeckung der Biofilmoberfläche hatte. Die gesamte relative Messung der Biofilmakkumulation, erhöht als Funktion der Zeit, wobei die Wachstumsrate von der höchsten Scherspannung auf die niedrigste Scherspannung zurückgeht.
Unter jeder Bedingung gab es auch eine klare Periode exponentiellen Wachstums, aus der eine quantitative Wachstumsrate berechnet werden konnte. Insgesamt verringerte sich der Rauheitskoeffizient im Laufe der Zeit unter allen Scherbedingungen, was darauf hindeutet, dass alle Biofilmoberflächen glatter wurden. Im Vergleich zur niedrigsten Schere führten die höheren Schereinstellungen jedoch zu einer glatteren Oberfläche im Laufe der Zeit, was darauf hindeutet, dass ein schnellerer Scherfluss zu einer glatteren und gleichmäßigeren Oberfläche beiträgt.
Darüber hinaus nahm die texturale Entropie oder die Zufälligkeit in der Morphologie im Laufe der Zeit für alle Scherbedingungen zu. Beim Ausführen dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die angegebene Reihenfolge zu befolgen und sich die Zeit zu nehmen, jeden Schritt genau auszuführen. Die benötigten Fähigkeiten können ein paar Läufe dauern, um zu meistern.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie HBLC oder GCMS durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Konzentrationen von Substraights, wie Glukose, zu beantworten, die verbraucht werden. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biofilme, um allgemeine Strömungsumgebungen in Echtzeit mit kontrollierten experimentellen Bedingungen und Hydrotherapie-Probenzuverfahren zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit BSL2-Bakterienstämmen extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen geeigneter Schutzausrüstungen und die Verwendung geeigneter Abfallprotokolle immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.
