Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen im Immunstoffwechselbereich zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik ist, dass sie die Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in einzelnen lebenden Zellen in einer komplexen Mischung verschiedener Zelltypen ermöglicht. Diese Methode zur Untersuchung von T- und B-Zellen kann auch auf viele andere Zelltypen wie Makrophagen, dendritische Zellen oder Primärzellen angewendet werden, die aus einer Gewebeprobe entnommen werden.
Das Verfahren wird von Chin-Wen Wei, einem Doktoranden aus meinem Labor, demonstriert. Um die Organellen für die Quantifizierung zu beschriften, fügen Sie zunächst ein mal zehn zu den sechsten Maus-T-Zellen zu einem runden unteren Faxrohr pro Marker hinzu. Und pellet die Zellen durch Zentrifugation.
vorgewärmt auf 37 Grad Celsius serumfreies Kulturmedium, um die organelle spezifischen Sondenstocklösungen auf endige Arbeitskonzentrationen im Medium zu verdünnen. Und die Zellen in 100 Mikroliter Sondenfarbstoff pro Röhre wieder aufhängen. Als nächstes inkubieren Sie die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator für die entsprechende Färbezeit und stoppen die Reaktion am Ende der Inkubation mit einem Milliliter eiskalten Faxpuffer pro Tube.
Dann sammeln Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation und setzen Sie die Pellets in 100 Mikroliterdes des vortitrierten 24G2-Hybridom-Überstands auf Eis wieder auf. Fügen Sie nach zehn Minuten einen Milliliter Faxpuffer pro Tube hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und beschriften Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern der vortitrierten fluoreszenzkonjugierten Antikörpercocktail von Interesse.
Fügen Sie die entsprechende Konzentration entsprechend der Tabelle hinzu. Und Faxpuffer für 20 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt. Fügen Sie am Ende der Inkubation einen Milliliter Faxpuffer pro Tube hinzu.
Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Und setzen Sie die Zellen in 300 Mikroliter Faxpuffer mit einem Mikrogramm pro Milliliter Propidiumjodid ergänzt. Schalten Sie unmittelbar nach dem Hinzufügen des Kern- und Chromosomen-Gegenflecks den Durchfluss-Zytometer-Analysecomputer, das Durchflusszytometer, die Faxerfassungssoftware und alle anderen Zubehörgeräte je nach Maschinenplattform ein.
Führen Sie PBS für etwa eine Minute durch das System, um sicherzustellen, dass die Durchflussleitung mit PBS und Sheathe-Puffer gefüllt ist. Öffnen Sie ein neues Experiment und legen Sie die Zytometerparameter gemäß den Anweisungen des Herstellers fest. Filtern Sie die Zellen mit einem 70-Mikrometer-Zellsieb.
Und Wirbel vor dem Erwerb jeder Probe, um Klumpen und DoppelteBildung zu vermeiden. Öffnen Sie die Einstellung Auto Kompensation, und erstellen Sie Punktdiagramme für jeden fluoreszierenden Parameter. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, stellen Sie die Kompensation ein und wenden Sie die Kompensation auf die Proben an.
Erstellen Sie ein Vorwärtsstreuungsdiagramm im Vergleich zur Seite und optimieren Sie die Spannungen, damit die Voninteresseenzellen innerhalb des Diagramms angezeigt werden. Erstellen Sie eine Vorwärtsstreuung im Vergleich zu vorwärts Scatter-Höhe Plot und Gate die einzelnen Zellen. Erstellen Sie einen vorwärts streuenden Bereich im Vergleich zum Seitenstreuungsflächendiagramm und beorden die Lymphozyten.
Erstellen Sie einen Vorwärtsstreubereich im Vergleich zu Propidiumjodid-Plot und Gate der lebenden Zellen. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, stellen Sie die Kompensation ein und wenden Sie die Kompensation auf die Proben an. Laden Sie dann das erste Probenröhrchen, erstellen Sie die entsprechenden Zelloberflächenmarkierungsdiagramme, und sammeln Sie mindestens 1 000 Ereignisse der Voninteressespopulation.
Wenn alle Stichproben ausgeführt wurden, exportieren Sie die Flussdaten für die nachfolgende Analyse. Und speichern Sie das Experiment als Vorlage, um die Zytometereinstellungen und Parameter für ähnliche Experimente in der Zukunft beizubehalten. Der endgültige mitochondriale Inhalt der Letzten Seite ist der niedrigste in doppelt negativen T-Zellen, spitzen in der doppelten negativen Stufe zwei und drei und leicht abgehend in der doppelten negativen Stufe vier.
Mit doppelt positiven Thymosyten, die eine höhere Anzahl von Mitochondrien als CD4 und CD8 einzelne positive Thymozyten zeigen, was darauf hindeutet, dass der mitochondriale Inhalt während der Entwicklung schwankt. CD4- und CD8-Einzel-positive Thymozyten weisen eine höhere mitochondriale mittlere Fluoreszenzintensität auf als Milz-CD4- oder CD8-T-Zellen, was darauf hindeutet, dass naive T-Zellen, die in der sauerstoffreichen Blutumgebung zirkulieren, eine noch niedrigere mitochondriale Masse haben als Thymozyten. Interessanterweise ist diese Reduktion des mitochondrialen Inhalts in der CD8 stärker ausgeprägt als die CD4 T Zelllinie, und die T-Zellaktivierung verringert das Vorhandensein dieser Organellen weiter.
Relativ niedriger, aber nachweisbarer, lysosomaler Gehalt wird in allen Thymosytenpopulationen beobachtet, mit einer stärkeren Präsenz in doppelt negativen Thymosezyten. In der Peripherie wird eine relativ hohe Anzahl von Lysosomen in Speicher- und Effektor-CD8-positiven T-Zellen nachgewiesen. Die Kombination von organelle spezifischen Farbstoffen und Oberflächenmarkern mit Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Möglichkeit, den metabolischen Zustand von Zellen in einer komplexen Mischung zu charakterisieren.
Zusätzliche organelle spezifische Farbstoff kann verwendet werden, um endoplasmatische Retikulum zu erkennen, autophagic Vakuole, oder andere intrazelluläre Kompartiment von Interesse.
