Diese Methode kann helfen, Richtungen von Proteinen mit Lipidmembranen zu studieren. In unserem Fall verwenden Sie es, um die kalziumabhängige Bindung von Annexinen an negativ geladene Phospholipide zu analysieren. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie etikettenfrei, sensibel, quantitativ ist und dass Wechselwirkungen in Echtzeit beobachtet werden können.
Somit ermöglicht eine direkte Analyse der realen Ergebnisse. Diese Technik kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie die Interaktion von komplexeren Mikromolekül-Baugruppen oder sogar Zellen. Verwenden Sie klare fünf Millimolar-Lipid-Lösungen, wie im Textprotokoll beschrieben.
Kombinieren Sie die gelösten Lipide im gewünschten Molverhältnis in 10 Milliliter Glasröhren. Verdampfen Sie die organischen Lösungsmittel mit einem trockenen Stickstoffstrom. Lassen Sie das Lipidgemisch auf einem Hochvakuum-Lyophilisierungssystem für drei Stunden, um Restspuren der Lösungsmittel zu entfernen.
Setzen Sie nun den Lipidfilm in einem Milliliter Citratpuffer wieder auf. Die Lipidsuspension bei 60 Grad Celsius 30 Minuten lang in einem Wasserbad inkubieren und alle fünf Minuten kräftig wirbeln. Diese Temperatur liegt um etwa 10 Grad Celsius über der Phasenübergangstemperatur des höchsten Schmelzlipids in der Mischung.
Unterdessen den Extruder mit einer porengroßen Polycarbonatmembran mit einem Durchmesser von 50 Nanometern über der Übergangstemperatur 30 Minuten vorheizen. Die Multilamellar-Vesikelsuspension in den vorgeheizten Extruder eintragen. Übergeben Sie die Mischung 31 Mal durch die Polycarbonatmembran, um kleine unilamellare Vesikel oder SUVs zu bilden.
Halten Sie die Temperatur über der Übergangstemperatur. Übertragen Sie die SUV-Federung auf ein zwei Milliliter Kunststoff-Reaktionsgefäß und fügen Sie den Citratpuffer hinzu, um das Endvolumen auf zwei Milliliter zu bringen. Inkubieren Sie vier Sensoren, die in einem Polytetrafluorethylenhalter in einer 2%SDS-Lösung für mindestens 30 Minuten eingesetzt werden.
Dann waschen Sie sie ausgiebig mit reinem Ultrawasser, um die SDS vollständig zu entfernen und versuchen Sie sie mit einem Strom von trockenem Argon oder Stickstoff. Verwenden Sie ein Plasmareinigungssystem, um Verunreinigungen vollständig zu entfernen. Setzen Sie dazu die trockenen Sensoren in die Plasmareinigungskammer ein, evakuieren Sie die Kammer und spülen Sie sie dreimal mit Sauerstoff.
Schalten Sie dann den Plasmareiniger ein. Verwenden Sie Vakuum, hohe Hochfrequenzleistung und 10 Minuten Prozesszeit. Schalten Sie nach dem Reinigungslauf die Maschine aus und nehmen Sie die Sensoren heraus.
Docken Sie die plasmagereinigten Sensoren vorsichtig mit einer Pinzette in die vier Durchflusskammern. Vermeiden Sie Druck oder Torsion der Kammern und Rohre, die lecker werden können. Spülen Sie das System 10 Minuten lang mit Citratpuffer im offenen Durchflussmodus.
Starten Sie das Programm. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung von Änderungen in der Frequenz und Ableitung des ersten Grundtons und Obertönes mit der Software, bis die Frequenz- und Ableitungsbasislinien stabil sind. Wenn die Basislinien stabil sind, tragen Sie die SUV-Aufhängung im Citratpuffer auf.
Entfernen Sie mit einem Reaktionsgefäß 1,5 Milliliter des Totvolumens, und schließen Sie das System dann im Schleifenflussmodus. Zeichnen Sie die Frequenzableitungsverschiebung für weitere 10 Minuten auf. Wenn die SLB stabil ist, gleicht das System 40 Minuten lang mit einem Laufendenpuffer bei den erforderlichen Calciumkonzentrationen im offenen Durchflussmodus aus.
Fügen Sie das Protein in den laufhaltigen Puffer, der Kalzium enthält. Führen Sie die Anwendung des Proteins im Loop-Flow-Modus durch, bis ein Gleichgewichts-Stabilitätszustand erreicht ist. Trennen Sie nun das gebundene Protein, indem Sie Kalziumionen mit fünf Millimolaren EGTA im Laufendenpuffer im offenen Durchflussmodus chelatisieren.
Regenerieren Sie das Mikrobalancesystem mit 50 Milliliter doppeldestilliertem Wasser in einem kontinuierlichen offenen Durchflussmodus. Entfernen Sie die Rohre aus dem Wasserbehälter und lassen Sie das System trocknen. Entfernen Sie den Kristallsensor vorsichtig und reinigen Sie ihn mit einer 2%SDS-Lösung mit dem Polytetrafluorethylenhalter.
Trocknen Sie die sichtbaren Teile des Durchflussmoduls, in dem sich der Sensor platziert hat. Hier ist die Aufzeichnung der Frequenzkurve und Ableitungsverschiebungen zu sehen. Der prominente Frequenzabfall bei Zugabe der Liposomen deutet auf ihre Absorption hin, da die puffergefüllten Vesikel nicht starr, sondern viskoelastisch sind, die Ableitung nimmt zu.
Anschließend brechen die koalierenden Vesikel. Die gleichzeitige Freisetzung des Puffers in den Vesikeln verringert die adsorbierte Masse, bis ein stabiles Plateau erreicht ist. Die Bindung von Annexin A2 an die Lipide fügt die Masse aus der deutlichen Frequenzverschiebung hinzu, stört aber nicht die Doppelschichtstruktur, wie die einzige kleine Änderung der Ableitung anzeigt.
Wenn Calciumion durch das Chelatbildner EGTA entfernt wird, trennt sich Annexin A2 vom Lipidfilm. Die Frequenz und die Ableitungsaufzeichnungen verschieben sich auf die Ebenen, die mit der Bilayer nur in der Annexin A2-Bindung gesehen werden, ist völlig abhängig vom Calciumion und dass der Lipidfilm intakt bleibt. Ein repräsentatives Negativkontrollexperiment wird hier gezeigt.
Wenn Phosphatidylserin fehlt, sind nach Zugabe von Annexin A2 in Gegenwart des Calciumions keine Veränderungen der Häufigkeit oder Destätiation erkennbar. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die richtige Bilayer-Bildung sicherzustellen. Verwenden Sie die Liposomen sofort, sonst verschmelzen die kleinen Vesikel zu größeren mit weniger Oberflächenspannung, die zu einer instabilen Grundlinie führen kann.
Im Anschluss an dieses Verfahren kann eine quantitative Beschreibung einer Membranprotein-Wechselwirkung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie kooperative versus nicht kooperative Bindung zu beantworten.
