Heute spielt die Massenspektrometrie eine wichtige Rolle in der Strukturbiologie. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über wichtige biologische Makromoleküle in ihrem nativen Zustand zu beantworten, insbesondere Proteine und Proteinkomplexe. Native Massenspektrometrie ist weit verbreitet auf eine Vielzahl von biomolekularen Baugruppen einschließlich Multiprotein- und Nukleinsäuresysteme anwendbar.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie schnell und hochsensibel ist. Es kann verwendet werden, um heterogene Proteinproben zu verhören, machen es möglich, mehrere Proteine im oligomeren Zustand gleichzeitig zu analysieren. Demonstriert wird das Verfahren von Andy Lau, einem Doktoranden in meiner Fraktion.
Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie die hauseigenen Kapillaren für Nanoelektrospray vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Bereiten Sie eine ligaandfreie Probe als Steuerelement für jeden Lauf als Pufferaustausch in Ammoniumacetat vor. Wählen Sie als Nächstes die TOF-Modi für Empfindlichkeit, positive Ionenerfassung und Mobilität aus.
Aktivieren Sie als Nächstes die Trap-, API- und IMS-Gase. Für die IM-Trennung die hier gezeigten Stickstoff- und Argon-Startpunkte verwenden und bei Bedarf anpassen. Legen Sie einen geeigneten m/z Erfassungsbereich fest.
Für ein unbekanntes Protein sollten die ersten Optimierungsschritte einen weiten Bereich verwenden. Setzen Sie die goldbeschichtete Kapillare in einen Kapillarhalter ein. Dann zwischen zwei und drei Mikroliter der proteinkomplexen Lösung von Interesse in die Kapillare laden.
Ziehen Sie die Kapillare vorsichtig fest und legen Sie sie auf die Elektrospray-Quellenstufe. Schieben Sie die Bühne in position, um mit der Datenerfassung zu beginnen. Wenden Sie einen niedrigen Nanostrom-Gasdruck an, bis sich an der Spitze der Kapillare ein Tropfen bildet.
Bewegen Sie die Kapillare in Bezug auf den Kegel und überwachen Sie den Ionenstrom, um einen stabilen Ionenstrom zu erreichen. Wenden Sie eine Kapillarspannung im Bereich zwischen 0,9 und 1,6 Kilovolt an. Legen Sie dann den Probenahmekegel, den Quellversatz, die Quelltemperatur und den Kegelgasstrom so fest, wie im Textprotokoll beschrieben.
Um ein gut aufgelöstes Massenspektrum und eine maximierte Ionenübertragung zu erhalten, passen Sie die MS-Parameter an und überwachen Sie die resultierende Veränderung in den Spektren. Stellen Sie die Fallkollisionsenergie auf einen anfänglichen Startpunkt zwischen 10 und 50 Volt ein. Wenn die Spannungsversätze nicht ausreichen, stellen Sie die Trapkollisionsenergien ein.
Stellen Sie die Falle über ihre Spannung auf einen anfänglichen Startpunkt zwischen 20 und 45 Volt ein. Verbessern Sie die Verwüstung, indem Sie diese Spannung optimieren. Danach optimieren Sie die Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe, wie im Text beschrieben, um die beste Mobilitätstrennung zu erreichen.
Für Studien mit HerA und NurA verwenden Sie eine Wellengeschwindigkeit von 40 Metern pro Sekunde und eine Wellenhöhe zwischen 550 und 650 Volt. Für die DNA-Bindungsanalyse mischen Sie Protein und DNA in einem Molverhältnis, das eine Protein-DNA-Komplexbildung ermöglicht. Fügen Sie immer größere Mengen von einer der folgenden, 5'O-3-Thio-Triphosphat, Tetralithiumsalz, oder ADP.
Mit entsprechender Software messen Sie die Massen der erzeugten Arten und identifizieren Sie die Ligandenbindung, wie ATP und ADP Bindung und oligomere Staaten. Verwenden Sie dann die Ionenintensitäten, die in den rohen ESI MS-Spektren beobachtet wurden, um die entsprechende relative Häufigkeit von Arten zu quantifizieren. Nach der Optimierung der Gerätebedingungen für eine stabile Übertragung reduzieren Sie die Kollisionsenergie und den Probenkegel so gering wie möglich, wobei die Qualität der Spektren erhalten bleibt.
Verwenden Sie die zuvor ermittelte optimierte Wellengeschwindigkeit und Wellenhöhe, um IM MS zu erfassen. Messen Sie die Ionendriftzeit bei drei verschiedenen Wellengeschwindigkeiten unter Beibehaltung der gleichen Wellenhöhe. Um das Protein-Ionen ZU bestimmen CCS messen vier Protein-Kalibratoren, zwei mit der Masse über dem protein untersuchten und zwei mit der Masse unten, mit den gleichen Instrumentationsbedingungen. Zunächst bereiten Sie die Proteinproben vor und tauschen sie in Ammoniumacetat aus, wie im Textprotokoll beschrieben.
Fügen Sie Lösungsmittel in 10%-Schritten hinzu, bis die gewünschte Menge erreicht ist. Eine Stunde lang auf Eis bebrüten. Danach erwerben Sie ein IM-MS-Spektrum für jede Probe.
Mit der SUMMIT-Software weisen Sie Protein-Subkomplexe zu und erzeugen Protein-Interaktionsnetzwerke. Alternativ können Sie manuell eine Liste theoretischer Massen für die erwartete Art erstellen. Um mit der Untersuchung der Proteinkomplexstabilität zu beginnen, erfassen Sie IM-MS-Daten und erhöhen sie gleichzeitig die Trapbeschleunigungsspannung von 10 Volt auf 200 Volt, die sich schrittweise auf das Protein und die Gasphase ausdukt.
Analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software und generieren Sie zweidimensionale Entfaltungsdiagramme, indem Sie die intensitätsnormalisierten CCS-Verteilungen bei jeder Beschleunigungsspannung für jeden Ladezustand stapeln. Native MS-Ergebnisse zeigen den oligomeren Zustand, die Zusammensetzung und die Topologie des HerA- und NurA-Komplexes. Da nichtkovalente Wechselwirkungen in der Gasphase erhalten bleiben, werden native MS von ATP-Gamma-S- und ADP-Titrationsexperimenten verwendet, um die paarweise Nukleotidbindung im HerA und NurA zu bestimmen.
Massenspektren der HerA-Oligomerzustände zeigen, dass die Erhöhung der ATP-Gamma-S-Konzentration die relative Intensität von hexameric HerA erhöht. Die experimentellen CCS-Werte für die Proteine und ihre Komplexe werden dann aus den IM-MS-Experimenten abgeleitet. Diese Werte gelten als gut mit theoretischen Messungen aus der Röntgenkristallographie, die die Verwendung von CCS-Werten für den Aufbau von Modellen der Proteinassembly mit niedriger Auflösung validiert.
Die CIU- und KEcom-Analyse zeigt, dass die DNA-gebundene HerA-NurA stabiler ist als der DNA-freie Komplex. Die CIU-MS-Analyse und die jeweiligen ATP-Bindungszustände zeigen, dass der vier ATP-Gamma-S-gebundene Zustand die komplexe Stabilität in der Gasphase reduziert. Der sechs ATP-Gamma-S-gebundene Zustand, in dem alle Standorte belegt sind, gilt jedoch als der stabilste.
Genaue Messungen der Molekularmasse eines intakten Komplexes liefern wertvolle Einblicke in die biomolekulare Charakterisierung. Wir können Informationen über komplexe Montagewege, Proteinoligomerisierung und Ligandenbindung erhalten. Die Kombination all dieser Informationen ermöglicht die Generierung detaillierter Modelle funktioneller biologischer Baugruppen.
