Name: an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Neuro-Bio Ltd. finanziert. Wir möchten Dr. Giovanni Ferrati und Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) Danke für ihre Kommentare und Ratschläge auf dem Manuskript.

Unter anerkannten Protokolle wurden alle Tierversuche durchgeführt.
Hinweis: In diesem Abschnitt die Reihenfolge der wichtigsten Phasen durchgeführt während der Versuchsdurchführung und der vorgeschlagenen zeitlichen Abstand erfolgt (Abbildung 1). Darüber hinaus wird eine schrittweise Beschreibung des Protokolls ergänzt durch ein Bedienfeld "illustrative", mit kritischen Aktionen von Gehirnentfernung bis hin zu Gewebe Homogenisierung nach der Inkubationszeit (Abbildung 2). Die Details bezüglich der Materialien und die Anweisungen, um das Gerät und die nachfolgende Phase für die WB-Analyse zu bauen sind zuvor beschriebenen22.
(1) chirurgische Werkzeuge, Vibratome Einstellungen und Vorbereitung der Behandlung
Hinweis: Führen Sie die folgenden Schritte vor dem Start der Versuchsdurchführung:
<ol><li>Bereiten Sie zwei unterschiedlichen künstliche Liquor Flüssigkeiten (aCSFs), verwendet für das Schneiden von Gehirn und die andere für die inkubationsschritt29wie zuvor beschrieben. Kurz, die Arbeiten-Konzentrationen (in Mmol) von zwei aCSFs sind für die "schneiden" ACFS: 120 NaCl, 5 KCl, 20 Nahco33, 2,4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4und 10 Glukose; 6.7 HEPES Salz und 3,3 HEPES Säure; pH-Wert: 7,1. Während für die "Aufnahme" ACFS: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 Nahco33, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1,3 KH2PO4und 10 Glukose; pH-Wert: 7,1.</li>
	<li>Die Lösungen gut mischen und dann auf Eis gelegt und slicing ACFS um es Kälte beim Entfernen des Gehirns und das anschließende Schneiden mit Sauerstoff. Halten Sie Sie bei Raumtemperatur (RT) und Versorgungsmaterial Sauerstoff Aufnahme ACFS.</li>
	<li>Legen Sie die Instrumente unter der Dissektion Haube für die Enthauptung und Gehirn entfernen, d. h., Guillotine, chirurgischen Präparation Kit (Schere, Pinzette, Messer) und Spachtel.</li>
	<li>Richten Sie die Vibratome Parameter, indem er die Scheibendicke (300 µm in dieser Zubereitung) und die Häufigkeit von 7 und die Geschwindigkeit, mit 6. Legen Sie die Vibratome Kammer an der entsprechenden Stelle und mit Eis umgeben.</li>
	<li>Öffnen Sie das Carbogen (95 % O2, 5 % CO2) Ventil um das "Aufschneiden" (ACFS) während das Gehirn Schneiden mit Sauerstoff. Wählen Sie die minimale Durchflussmenge um 2 mL/min.</li>
	<li>Nehmen Sie zwei 15-mL-Röhren, die Bedingungen zu testen. Fügen Sie in eine Röhre 10 mL der "Aufnahme" ACFS allein (Kontrollgruppe) und in der anderen 10 mL der "Aufnahme" ACFS angereichert mit T30 in einer Konzentration von 2 µM (behandelten Gruppe). Vortex sowohl Rohre und halten sie auf dem Eis bis zu ihrer Verwendung in der Setup-Vorbereitungsphase (Abschnitt 3).</li>
</ol>(2) Anästhesie, Gehirn-Extraktion und schneiden
Hinweis: In dieser Studie wurden 9 Wildtyp P14 männliche Wistar-Ratten verwendet. Gehirn-Extraktion und anschließende schneiden dar einen wichtigen Bestandteil des Protokolls, da sie schnell (innerhalb von 10 min) erfolgen sollte, um zu verhindern oder zumindest verlangsamen Gewebe Degeneration Prozesse.
<ol><li>Fügen Sie 1,5 mL 100 % w/w von Isofluran auf einer baumwollschicht in die Induktion Kammer hinzu, legen Sie das Tier innen und schließen Sie den Deckel. Warten Sie, bis das Tier tief betäubt ist, bestätigt das Fehlen der Pedal-Reflex, und dann enthaupten Sie das Tier mit der Guillotine zu.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf des Tieres in einen Topf mit eiskaltem schneiden ACFS im Gehirn Entfernung Schritt (Abbildung 2A -C).</li>
	<li>Einschneiden der Haut über den Schädel mit einem chirurgischen Klinge, dann schneiden Sie den Schädel mit einer Schere nach der Mittellinie aus dem hinteren Teil und fahren Sie körpertiefe bis zum Erreichen des Knochens über der OBs (Abbildung 2A).</li>
	<li>Ziehen Sie seitlich die beiden Seiten des Schädels mit einer Zange um Zugriff auf das Gehirn (Abb. 2 b) erhalten. Legen Sie einen Spachtel ventral zum Gehirn, schöpfen Sie sanft es aus, und halten Sie es im eiskalten "schneiden" ACFS für ca. 5 min (Abbildung 2) hydratisiert.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Gehirn auf Filterpapier und schneiden Sie das Kleinhirn mit einer Klinge (Abb. 2D). Kleben Sie das Gehirn vertikal auf der Vibratome CD und legen Sie sie in der speziellen Kammer, füllen Sie ihn mit eiskalten "schneiden" ACFS und liefern Sie Sauerstoff (Abb. 2E).</li>
	<li>Passen Sie es schneiden, und fahren Sie mit dem Gehirn-Schnitt (Abb. 2F). Sammeln Sie die Abschnitte mit der Region von Interesse, wie die medialen Scheidewand (MS), Diagonale Band von Broca (DBB) und Substantia Innominata (SI), wie zuvor beschrieben22. Von oben nach unten enthalten die drei Scheiben die rostral (R), Mittelstufe (I) und kaudalen (C) Teil der BF (Abbildung 2).</li>
	<li>Teilen Sie entlang der Mittellinie jeder Abschnitt mit einer kleinen Schere, erhalten zwei spiegelnde Hemislices (Abb. 2 H), einzeln als Kontrolle und behandelten Zustand bei der gleichen anatomischen Ebene verwendet.</li>
	<li>Halten Sie die Hemisections in der Vibratome Kammer für 5-10 min, dann mit einer Glaspipette in einem sprudelnden Topf mit Aufnahme ACFS überführen. Halten Sie bei RT für ca. 30 min zu erholen.</li>
	<li>Füllen Sie in der Zwischenzeit drei Glasfläschchen mit 3 mL Aufnahme ACFS allein (zuvor im Schritt 1.6 für die Kontrollgruppe bereit) und drei Fläschchen mit 3 mL ACFS angereichert mit T30 (zuvor im Schritt 1.6 bereit) für die behandelten Gruppe.</li>
</ol>3. Setup Vorbereitung
<ol><li>Die Hemisections in ihre entsprechenden Glasfläschchen (Abbildung 2I) zu übertragen, um drei aufeinander folgende Hemislices (einschließlich der rostral, zwischen- und kaudalen BF-Region) für die Kontrollgruppe (grüner Rahmen, Abbildung 2J) haben und deren passenden Partnern bei der behandelten Gruppe (roter Rahmen, Abbildung 2J).</li>
	<li>Übertragen Sie das Hirngewebe mit zwei verschiedenen Pinseln, eine für die Steuerung Hemislices und eine weitere für die behandelten Gegenstücke, um eine Kontamination zwischen Bedingungen zu verhindern.</li>
	<li>Jede Glasflasche mit dem entsprechenden Deckel, präsentieren die Sauerstoff Nadel (21G) (Abb. 2J) zu versiegeln. Verbinden Sie das Hauptrohr des Apparates mit Carbogen Quelle (Abbildung 2 K). Sauerstoff für die Hemislices während der Inkubationszeit mit einer minimalen Flussrate von 2 mL/min zu liefern, um jede Bewegung des Hirngewebes und mechanische Beschädigungen während des Versuchs zu vermeiden. Starten Sie die 5 h Inkubation. Führen Sie die Schritte 3.1-3.3 innerhalb von 5 Minuten. Hinweis: Prüfen Sie häufig (alle 15-20 min) ob der Sauerstoff in die Fläschchen versorgt wird und seinen Fluss nicht das Gewebe von unten bewegt.</li>
</ol>4. Probe Homogenisierung
<ol><li>Nach der Inkubation stoppen Sie der Sauerstoffzufuhr zu und entfernen Sie den Deckel aus dem Fläschchen. Übertragen Sie die Hemislices, mit der richtigen Bürsten, in 1,5 mL Röhrchen mit 250 µL Lyse Puffer, Aufrechterhaltung der Rohre auf dem Eis (Abbildung 2 L). Machen die Lyse Puffern, mischen PBS 1 X mit Phosphatase und Protease-Hemmer Cocktails sowohl 1: 100 verdünnt und Homogenisieren des Gewebes mit verschiedenen Stößel, Kontamination zwischen den Proben zu verhindern. Füllen Sie diese Aktionen innerhalb von 10-15 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie das Gehirn lysate bei 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Transfer des Überstands in neue Schläuche und halten die Proben bei-80 ° C.</li>
</ol>5. Lesen der Proteinkonzentration und Western-Blot Analyse
<ol><li>Bestimmen Sie die Proteinkonzentration jeder Probe zu und anschließend bereiten Sie die Aliquote der Western-Blot Analyse als zuvor beschriebenen22 vor.</li>
	<li>Führen Sie statistische Analyse, um die Bewertung der Auswirkungen der Behandlung auf Protein-Expression.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen. Susan A. Greenfield ist der Gründer und Präsident der Neuro-Bio-Limited, ein privat geführtes Unternehmen und hält Anteile an der Gesellschaft. Emanuele Brai und Antonella Cogoni sind Mitarbeiter von Neuro-Bio Ltd.

Der wichtigste Aspekt dieses Protokolls, basiert auf der bewährten ex Vivo -Gehirn-Technik ermöglicht zwei spiegelnde Hemislices, gewonnen aus der gleichen anatomischen Ebene, Überwachung ihrer Reaktion nach der Anwendung eines bestimmten synchron zu testen Zustand (Steuern oder behandelt); Dies bietet daher eine experimentellere Paradigma so streng kontrolliert wie möglich. Die Möglichkeit der Bewertung in einer Zeit, Dosis und ortsspezifische Weise verschiedene Neurochemikalien, die im Zusammenhang mit neuronalen Beeinträchtigung wie bei neurodegenerativen Veranstaltungen22, stellt ein wesentliches Merkmal. Diese Methode verbindet die Vorteile einer in Vivo physiologische Umgebung mit denen von in-vitro- Präparate, wie Genauigkeit bei der Beschaffung des Interessenbereichs und schaffen den idealen Rahmen der extrazellulären. Dieses Protokoll stellt eine Anpassung des gemeinsamen Gehirns schneiden Verfahren am meisten benutzt für ex-Vivo elektrophysiologische Aufnahmen25,26,27 und optische Bildgebung28, 29,30, oder in Vitro organotypischen Slices, die eine engere in-Vivo -Situation zu simulieren, indem Sie ermöglichen die Erhaltung der beiden Struktur- und synaptischen Organisation23,24 ,31,32.
Darüber hinaus ist dieses Verfahren könnte dazu beitragen, verringern Sie die Anzahl der Tiere in Verhaltensstudien verwendet, da es teilweise eine in Vivorepliziert-wie Zustand, die übernommen werden können, um in-vitro- Daten, z. B. Zellkultur zu bestätigen und immunhistochemische Analysen, und dann in Vivo Experimente zu antizipieren.
Die vorgeschlagene Methode stellt auch einige Einschränkungen, z. B. die Schnittdicke und Integrität, die gegebenenfalls nicht das endgültige Ergebnis verändern kann. Die Inkubationszeit ist auch ein wesentlicher Bestandteil dieser Technik, da es den Vergleich zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten beeinflussen könnten. Darüber hinaus kann eine Reihe von Verfahren oder technische Probleme bei allen Arbeitsschritten des Protokolls, wie angetroffen werden: (1) mechanische Beschädigung beim Extrahieren oder schneiden das Gehirn, die vermieden werden, indem präzise und schonende Behandlung des Gewebes; (2) schweben von der Hemislices während der Inkubation durch eine übermäßige Sauerstoffzufuhr, die mechanisch das Gewebe schädigen können, wenn es die Sauerstoff Nadel berührt untergetaucht in der ACFS, was sich auf seine Integrität. Dies kann durch Anpassung an den Mindestsatz der Blasenbildung verhindert werden; und (3) fehlen oder ungleichmäßige Sauerstoffzufuhr, die können an den leeren Kanister, eine Beschädigung oder Trennung in das Schlauchsystem, ein Plug-in die Sauerstoff Nadel bezogen werden oder wenn es nicht ordnungsgemäß inmitten der ACFS. Da die Konstante Sauerstoffzufuhr und seinen Fluss während des Verfahrens stellt eines der wichtigsten Aspekte dieses Protokolls, ist es wichtig, alle diese Parameter, um einen homogenen Zustand zwischen den untersuchten Gruppen zu erhalten häufig zu beobachten.
Andere wichtige Schritte im Protokoll sind vertreten durch die Zeitfenster erforderlich, um jede Aktion ausführen, die bei gefolgt wird so viel wie möglich die Integrität und Funktionalität des Gewebes zu erhalten. Um diese Parameter zu beurteilen, kann darüber hinaus immunhistochemische Analysen durchgeführt werden, um spezifische Marker, die im Zusammenhang mit neuronalen Lebensfähigkeit und elektrophysiologische Aufnahmen als zuvor beschriebenen23,29erkennen.
Neben den hier dargestellten Ergebnissen könnte diese Methode entworfen ad hoc für bestimmte Untersuchungen sein. Zum Beispiel kann es zu angewendet werden: (1) Monitor und vergleichen die Aktivität verschiedener Verbindungen in mehreren des Gehirns Bereichen Brüten sie mit der gewählten Lösung, z. B. ACFS oder Neurobasal Medium; (2) führen Sie Untersuchungen auf Hypoxie, da die Sauerstoffzufuhr in jeder Hemisektion selektiv gesteuert werden kann; (3) Gehirn Gewebeeigenschaften von transgenen Tiermodellen von verschiedenen Krankheiten zu untersuchen; (4) gleichzeitig zu erkunden Sie, auf der gleichen anatomischen Ebene die Auswirkungen der in Vivo einseitige Gehirn-Injektionen und vergleichen Sie sie mit der Kontrolle Hemisphäre; und (5) andere Organe oder Gewebe Eigenschaften, daher potenziell erleichtern und Verkürzung der Drogen-screening-Studien zu erkunden.

AD ist eine chronische Krankheit gekennzeichnet durch allmähliche Neurodegenerative Beeinträchtigung beeinflussen verschiedene Hirnareale wie entorhinalen Kortex (EG), BF, Hippocampus (HC) und Riechkolben (OB)1,2,3, 4,5. Im Spätstadium der Entwicklung AD führen zu einem progressive kognitive Rückgang, so dass diese Erkrankung die häufigste Form der Demenz, entfallen etwa 70 % von allen Fällen6. Trotz umfangreicher Versuche zu verstehen, der Anfangsphase verursacht AD ist nicht derzeit eine definierte experimentelle Indikation Aufklärung sie. Darüber hinaus ist die populärste Theorie - "Amyloid-Hypothese" - zunehmend in Frage gestellt, da es nicht bietet ein vollständiges Profil in der Erklärung der AD Pathobiologie, noch eine pharmazeutische Ziel, die wirksame7,8 bewährt hat ,9.
Eine alternative Theorie, die zunehmend Beachtung deutet darauf hin, dass die anfängliche Mechanismen bei der Neurodegeneration zu einem neuronalen Cluster vor allem anfällig in AD3,10,11 zusammenhängen , 12 , 13 , 14. dieser heterogenen zellulären Hub umfasste innerhalb der BF, Mittelhirn und Hirnstamm, Projekte auf mehrere Regionen, wie z. B. die EG, HC und OB15,16. Trotz ihrer Vielfalt in neuronale Morphologie und Neurotransmitter-Synthese teilt diesen Kern der Zellen ein gemeinsames Merkmal im Ausdruck AChE, die auch ein nicht-enzymatische Funktion17,18haben kann. Diese nicht-klassischen Rolle als Roman Signaltechnik Molekül Kalzium (Ca2 +) fließen in Neuronen vermittelt die trophische oder toxische Ereignissen in Bezug auf Ca2 + Dosis, Verfügbarkeit und neuronale Alter17,18 unterzogen werden können , 19.
Während Neurodegeneration die beobachteten zelluläre Verlust daher möglicherweise mit diesem nicht-enzymatische Funktion17,18,20, was auf ein 30mer Peptid (T30) gespalten aus dem C-Terminus AChE zurückzuführen ist 20. im Einklang mit früheren Ergebnissen, geweitermacht Zellkultur und optische Bildgebung18,21 Vorbereitungen, wir unter Beweis gestellt, durch einen neuartigen Ansatz basierend auf ex Vivo Ratte Gehirnscheiben mit BF Strukturen, die induzierte T30 ein AD-ähnlichen Profil22. Insbesondere bietet diese neue Methodik ein physiologischer Szenario als Zellkultur, da es viele der Merkmale von einem intaktem Gewebe von anatomischen bis hin zu Schaltung Konservierung, wenn auch nur für ein Zeitfenster von Stunden unterhält. Wir angewendet dieses Protokoll zur Erkundung der Ereignisse in den frühen Phasen der Neurodegeneration, Überwachung der akuten Reaktion auf T30-Antrag.
Trotz der großen Körper der Literatur auf Gehirn Scheiben zu untersuchen molekulare Signalwege in neuronale Schäden impliziert oder Neurogenese23,24, dieses Protokoll bietet zum ersten Mal eine direktere und Sensitive ausgelesen im Vergleich für die gemeinsame Nutzung von organotypischen Scheiben. Jedoch wie der Fall für organotypischen Gehirn Abschnitte ist, kann dieser akuten Slice-Verfahren auch für verschiedene Zwecke, wie die Auswertung der neuroprotektive oder neurotoxische Moleküle, Entdeckung der primären molekulare Veränderungen in einem bestimmten Prozess angenommen werden, immunhistochemische Analysen und pharmakologischen Tests für zentrale Nervensystem im Zusammenhang mit Krankheiten.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S7653</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P9333</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>S5761</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>63138</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>P5655</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes salt</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H7006</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Hepes acid</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>H3375</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>G7528</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>223506</td><td>Reagent for aCSF preparation</td></tr><tr><td>T30 peptide</td><td>Genosphere Biotechnologies, France</td><td></td><td>AChE-derived peptide tested</td></tr><tr><td>Surgical dissecting kit</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Item #: MOUSEKIT</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Surgical blades</td><td>Swann-Morton, UK</td><td>BS 2982</td><td>Brain removal step</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Glue</td><td></td><td></td><td>Brain preparation for slicing</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Germany</td><td>VT1000 S</td><td>Slicing</td></tr><tr><td>Brushes</td><td></td><td></td><td>Tissue handling</td></tr><tr><td>Oxygen canister</td><td></td><td></td><td>Sectioning and incubation phase</td></tr><tr><td>1x Phosphate buffer saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Phosphatase inhibitors</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Protease inhibitors</td><td>Roche complete PIC, USA</td><td>4693116001</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Starlab, UK</td><td>I1415-5390</td><td>Homogenization step</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Protein Assay</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Protein concentration</td></tr></tbody></table>

an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices

Trotz zahlreicher Studien, die versuchen, zuverlässige Tiermodellen zu entwickeln, welche reflektieren die primären zugrunde liegenden Neurodegeneration Prozesse, wurden nur sehr wenige weithin akzeptiert. Hier schlagen wir ein neues Verfahren aus der bekannten ex-Vivo Gehirn Stück Technik, die eine engere in Vivobietet angepasst-wie Szenario als in-vitro- Vorbereitungen für die Untersuchung der frühen Ereignisse auslösen Zelldegeneration, als bei der Alzheimer-Krankheit (AD) beobachtet. Diese Variante besteht aus einfachen und leicht reproduzierbar Schritten, die Erhaltung der anatomischen Cytoarchitecture der ausgewählten Hirnregion und seine lokalen Funktionalität in einem physiologischen Milieu zu ermöglichen. Verschiedene anatomische Bereiche erhalten Sie bei demselben Gehirn, bietet die Möglichkeit, mehrere Experimente mit den fraglichen Behandlungen in einer Website, Dosis und Zeit-abhängigen Weise durchführen. Mögliche Einschränkungen betreffen die Ergebnisse im Zusammenhang mit dieser Methodik beziehen sich auf die Erhaltung des Gewebes, d. h. die Aufrechterhaltung seiner anatomischen Integrität während der Schneiden und Inkubation Schritte und die Schnittdicke die die biochemische und immunhistochemische Analyse beeinflussen. Dieser Ansatz kann für verschiedene Zwecke, wie die Erforschung der molekularer Mechanismen in physiologische oder pathologische Bedingungen, Drogen-Screening oder Dosis-Wirkungs-Assays eingesetzt werden. Dieses Protokoll könnte schließlich auch die Zahl der Tiere in Verhaltensstudien beschäftigt reduzieren. Die Anwendung hier berichtet wurde vor kurzem beschrieben und zum ersten Mal auf ex-Vivo Ratte Gehirnscheiben mit basalen Vorderhirn (BF), eines der zerebralen AD in erster Linie betroffenen Regionen getestet. Insbesondere wurde nachgewiesen, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, abgeleitet aus dem C-Terminus der Acetylcholinesterase (AChE) eine AD-wie Profil, Auslösung, entlang der Antero-posterioren Achse der BF, eine differentielle Expression der veranlassen könnte Proteine verändert n. Chr., wie z. B. den alpha7 Nikotin-Rezeptor (α7-nAChR) phosphoryliert Tau (p-Tau) und Beta-Amyloid (Aβ).

Die hier vorgestellten Protokoll zeigt an, dass die Verwaltung eines giftigen Peptids, T30, in eine Website-abhängigen Weise die Expression von α7-nAChR, p moduliert-Tau und Aβ in BF-haltigen Abschnitten (Abb. 3A). Der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der rostral behandelt Hemislice im Vergleich zu seiner Kontrolle Gegenstück (Scheibe 1, p = 0.0310) (Abb. 3 b), während die mittlere Scheibe Änderungen zwischen den zwei Bedingungen (nicht offenbaren Scheibe 2, p = 0.1195) (Abb. 3 b). Im hinteren Bereich eine deutliche Reduzierung ist in den T30-exponierten Teil über die Steuerseite (Scheibe 3, p = 0.0476) (Abb. 3 b). Auf Antrag der T30, p-Tau sind deutlich erhöht im Frontzahnbereich gegen die Kontrolle, die passende Seite (Scheibe 1, p = 0,0158) (Abbildung 3). Auf der anderen Seite die anderen zwei BF-haltigen Abschnitte zeigen keinen signifikanten Unterschied zwischen den Bedingungen (Scheibe 2, p = 0.1014; schneiden 3, p = 0.6405) (Abbildung 3). Nach der Belichtung T30 Aβ ist erheblich verbessert in die rostral und mittlere Hemisections im Vergleich zu ihren unbehandelten kontralateralen Portionen (Scheibe 1, p = 0.0136; schneiden 2, p = 0.0109) (Abbildung 3D). In dem kaudalen Segment gibt es keine Veränderung zwischen den beiden Behandlungen (Scheibe 3, p = 0.1231) (Abbildung 3D). Der primäre Antikörper gegen p-Tau erkennt das Epitop, enthält des phosphorylierten Ser202 Rückstands. Der primäre Antikörper gegen Aβ erkennt mehrere Isoformen, von Aβ37 bis hin zu Aβ42. Daten wurden analysiert, wie zuvor beschriebenen22 mit zwei gepaarten t tailed-tests und dargestellt als SEM. N = (Hemislices pro Gruppe, Ratten) ist (27, 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig1.jpg"> Abbildung 1: Sequenz und der vorläufige Zeitplan für die wichtigsten Schritte durchgeführt während der Versuchsdurchführung. Der zeitliche Abstand der ersten und dritten Schritts variieren in Bezug auf die Bedienerebene Erfahrung. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig2.jpg"> Abbildung 2: sequentielle Schritte illustriert das Protokoll Fortschreiten. (A–D) Extraktion des Gehirns aus dem Schädel und Trennung des Kleinhirns vom Rest des Gehirns. (E) Befestigung des Gehirns auf Vibratome Scheibe und Transfer in die Dissektion Kammer, die von Eis umgeben und gefüllt mit kaltem ACFS ständig Sauerstoff während dem Schneiden. (F) koronalen Gehirn schneiden. (G) Auflistung der Scheiben, mit rostral (R), Mittelstufe (ich) und kaudalen (C) Strukturen des basalen Vorderhirns. (H) Trennung der Abschnitte in zwei passenden Hemislices. (ich) jeder Hemisektion befindet sich in der entsprechenden Fläschchen. (J) Fläschchen in der Unterstützung, in der Geräte-Box positioniert und separat geschlossen. (K) Inkubation Zeitraum nach der Anbindung des Systems an die Sauerstoffquelle (Schwarzer Kreis). (L) Homogenisierung der Proben nach der Behandlung. Diese Zahl wird von22geändert. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig3.jpg"> Abbildung 3: T30 vermittelte standortspezifisch Ausdruck α7-nAChR, p-Tau und Aβ Rostro-kaudalen Achse BF. (A) Darstellung der koronalen Gehirnscheiben einschließlich der basalen Vorderhirn Kerne (weiße gepunktete Linien), aufgeteilt in zwei komplementäre Portionen und unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt. (B) nach T30 Belichtung der Nikotin-Rezeptor zeigt eine deutliche Steigerung in der vorderen Unterteilung (T30-1) und eine deutliche Reduktion der hintere (T30 3) im Vergleich zu den entsprechenden Kontrolle Seiten (STRG 1 und STRG-Taste 3). Die mittlere Scheibe zeigt keine Änderungen zwischen den zwei Bedingungen (Ctrl 2, T30-2). (C) p-Tau Ausdruck ist deutlich höher in den behandelten rostral Teil (T30-1) über seine Kontrolle passende Gegenstück (STRG 1), während die anderen beiden Scheiben nicht keinen Unterschied in den beiden Gruppen (Scheibe 2 und Scheibe 3) enthüllen. (D) Aβ zeigt eine deutliche Steigerung in der vorderen und mittleren behandelten Unterteilungen (T30-1 und T30-2) im Vergleich zu ihren entsprechenden unbehandelten Seiten (STRG-Taste 1 und 2 STRG). In den kaudalen Abschnitten gibt es keine Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Fehlerbalken zeigen SEM. * p < 0.05.n = (Hemislices pro Gruppe, Ratten) ist (27, 9). Maßstab ist 1 mm. Diese Zahl wurde von22geändert. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

6.9K Aufrufe.  Culham Science Centre. Wir präsentieren eine Methode, die bieten weitere Einblicke in die frühe Ereignisse zugrunde liegenden Neurodegeneration und basiert auf der etablierten Ex-Vivo -Gehirn-Technik verbindet die Vorteile eines in Vivo und in Vitro Experimente. Darüber hinaus stellt es eine einzigartige Gelegenheit zum direkten Vergleich von behandelten und unbehandelten Gruppe in der gleichen anatomischen Ebene.

Serie: An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Organotypic Slice Cultures for Studies of Postnatal Neurogenesis

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This method maintains the characteristic topographical morphology of the hippocampus while allowing direct application of pharmacological agents to the developing hippocampal dentate gyrus. Additionally, slice cultures can be maintained for up to 4 weeks and thus, allow one to study the maturation process of newborn granule neurons. Slice cultures allow for efficient pharmacological manipulation of hippocampal slices while excluding complex variables such as uncertainties related to the deep anatomic location of the hippocampus as well as the blood brain barrier. For these reasons, we sought to optimize organotypic slice cultures specifically for postnatal neurogenesis research.

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis using the organotypic slice culture technique. This method allows for in vitro manipulation of adult neurogenesis and allows for the direct application of pharmacological agents to the cultured hippocampus.

Organotypischen Kulturen für Studien der postnatale Neurogenese

Here we describe a technique for studying hippocampal postnatal neurogenesis in the rodent brain using the organotypic slice culture technique. This ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Acute Hippocampal Slices from Rats and Transgenic Mice for the Study of Synaptic Alterations during Aging and Amyloid Pathology

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The hippocampus can be extracted quickly and easily from rats and mice and slices remain viable for hours in oxygenated artificial cerebrospinal fluid. Moreover, basic electrophysisologic techniques are easily applied to the investigation of synaptic function in hippocampal slices and have provided some of the best biomarkers for cognitive impairments. The hippocampal slice is especially popular for the study of synaptic plasticity mechanisms involved in learning and memory. Changes in the induction of long-term potentiation and depression (LTP and LTD) of synaptic efficacy in hippocampal slices (or lack thereof) are frequently used to describe the neurologic phenotype of cognitively-impaired animals and/or to evaluate the mechanism of action of nootropic compounds. This article outlines the procedures we use for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and Alzheimer's disease (AD)1-3. Use of aged rats and AD model mice can present a unique set of challenges to researchers accustomed to using younger rats and/or mice in their research. Aged rats have thicker skulls and tougher connective tissue than younger rats and mice, which can delay brain extraction and/or dissection and consequently negate or exaggerate real age-differences in synaptic function and plasticity. Aging and amyloid pathology may also exacerbate hippocampal damage sustained during the dissection procedure, again complicating any inferences drawn from physiologic assessment. Here, we discuss the steps taken during the dissection procedure to minimize these problems. Examples of synaptic responses acquired in "healthy" and "unhealthy" slices from rats and mice are provided, as well as representative synaptic plasticity experiments. The possible impact of other methodological factors on synaptic function in these animal models (e.g. recording solution components, stimulation parameters) are also discussed. While the focus of this article is on the use of aged rats and transgenic mice, novices to slice physiology should find enough detail here to get started on their own studies, using a variety of rodent models.

This article outlines procedures for preparing hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations associated with brain aging and age-related neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease.

Vorbereitung der akuten Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für das Studium der Synaptic Veränderungen während des Alterns und Amyloid-Pathologie

The rodent hippocampal slice preparation is perhaps the most broadly used tool for investigating mammalian synaptic function and plasticity. The ...

Neurowissenschaften

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Exzitotoxische Stimulation der Hirn Microslices als<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Medizin

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

Die Analyse der neurovaskuläre Remodeling in Entorhino-Hippocampus Organotypischen Kulturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Vorbereitung der akuten Gehirnscheiben mit einem optimierten N-Methyl-D-Glucamine-schützende Recovery-Methode

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparing Acute Brain Slices from the Dorsal Pole of the Hippocampus from Adult Rodents

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of cellular and synaptic properties. Nevertheless, there is an ever increasing need to perform correlated analyses between different experimental modes in addition to slice electrophysiology, for example: immunohistochemistry, molecular biology, in vivo imaging or electrophysiological recording; to answer evermore complex questions of brain function. However, making meaningful conclusions from these various experimental approaches is not straightforward, as even within relatively well described brain structures, a high degree of sub-regional variation of cellular function exists. Nowhere is this better exemplified than in the CA1 of the hippocampus, which has well-defined dorso-ventral properties, based on cellular and molecular properties. Nevertheless, many published studies examine protein expression patterns or behaviorally correlated in vivo activity in the dorsal extent of the hippocampus; and explain findings mechanistically with cellular electrophysiology from the ventro-medial region. This is further confounded by the fact that many acute slice electrophysiological experiments are performed in juvenile animals, when other experimental modes are performed in more mature animals. To address these issues, this method incorporates transcardial perfusion of mature (&#62;60 day old rodents) with artificial cerebrospinal fluid followed by preparation of modified coronal slices including the septal pole of the dorsal hippocampus to record from CA1 pyramidal cells. This process leads to the generation of healthy acute slices of dorsal hippocampus allowing for slice-based cellular electrophysiological interrogation matched to other measures.

The purpose of this protocol is to describe a method to produce slices of the dorsal hippocampus for electrophysiological examination. This procedure employs perfusion with chilled ACSF prior to slice preparation with a near-coronal slicing angle which allows for preservation of healthy principal neurons.

Whole-cell patch-clamp recordings from acute rodent brain slices are a mainstay of modern neurophysiological research, allowing precise measurement of ...

Acute Mouse Brain Slicing to Investigate Spontaneous Hippocampal Network Activity

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell resolution using electrophysiology, microscopy, and pharmacology. However, a major consideration in the design of in vitro experiments is the extent to which different slice preparations recapitulate naturalistic patterns of neural activity as observed in vivo. In the intact brain, the hippocampal network generates highly synchronized population activity reflective of the behavioral state of the animal, as exemplified by the sharp-wave ripple complexes (SWRs) that occur during waking consummatory states or non-REM sleep. SWRs and other forms of network activity can emerge spontaneously in isolated hippocampal slices under appropriate conditions. In order to apply the powerful brain slice toolkit to the investigation of hippocampal network activity, it is necessary to utilize an approach that optimizes tissue health and the preservation of functional connectivity within the hippocampal network. Mice are transcardially perfused with cold sucrose-based artificial cerebrospinal fluid. Horizontal slices containing the hippocampus are cut at a thickness of 450 &#956;m to preserve synaptic connectivity. Slices recover in an interface-style chamber and are transferred to a submerged chamber for recordings. The recording chamber is designed for dual surface superfusion of artificial cerebrospinal fluid at a high flow rate to improve oxygenation of the slice. This protocol yields healthy tissue suitable for the investigation of complex and spontaneous network activity in vitro.

This protocol describes the preparation of horizontal hippocampal-entorhinal cortex (HEC) slices from mice exhibiting spontaneous sharp-wave ripple activity. Slices are incubated in a simplified interface holding chamber and recordings are performed under submerged conditions with fast-flowing artificial cerebrospinal fluid to promote tissue oxygenation and the spontaneous emergence of network-level activity.

Akute Maus Gehirn Schneiden, um spontane Hippocampal-Netzwerk-Aktivität zu untersuchen

Acute rodent brain slicing offers a tractable experimental approach to gain insight into the organization and function of neural circuits with single-cell ...

Neuronal Death Assay to Evaluate Cell Death in Ex Vivo Epilepsy Model

Source: Carvalho, M., et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/61330">A Model of Epileptogenesis in Rhinal Cortex-Hippocampus Organotypic Slice Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2021)
This video demonstrates the technique of assessing neuronal death in rhinal cortex-hippocampus organotypic slices. Neuronal death occurs via evolving epileptic seizures &#8212; resembling in vivo epilepsy &#8212; and is detected through dual-staining of the dead cells using propidium iodide and immunofluorescence.

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Zusammenfassung

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