Name: optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana
Uploaded: 2018-04-30T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Wir danken Jozsef Storch, Mitchel Richmond, Jarrad Gollihue und Andrea Sanchez für konstruktive und kritische Diskussion. Dr. Sharyn Perry für die phänotypische Fotografien. Dieses Material basiert auf Arbeit von der National Science Foundation unter Genossenschaft Vereinbarung Nr. 1355438 unterstützt.

1. Erstellen einer Verdünnung-Bibliothek
<ol><li>Beschriften Sie 625 Verdünnung Bibliothek Platten von hand um sicherzustellen, dass sie auf die entsprechende Platte aus der chemischen Bibliothek übereinstimmen. Darüber hinaus verbinden im Fluss und Schläuchen, die Multichannel-Tipp Wash automatisiert Labware Positionierer (ALP) indem sie durch das Laufwerk der Konsole an den 5-Gallonen-Behälter (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Auf zugreifen Sie den Computer und die Waschpumpe durch die Verbindung von der Gerätesteuerung bis zur Multichannel-Tipp Wash ALP schalten Sie ein, damit Wasser zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Last, befestigt mit der Hand, den Stapler 10 zum Stapler-Karussell in der folgenden Reihenfolge in Hotels A - D (Abbildung 4, Stapler); eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Saal 1, vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 2-5 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen aus der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler). Darüber hinaus laden eine Schachtel AP96 P20 Pipettenspitzen in Raum 6 und vier 96-Well-V-Bodenplatten in Zimmer 7-9 mit den beiden oberen Platten, Lager Konzentrationen der bestellten Bibliothek und die beiden unteren Platten leer (Abbildung 5, Stapler).</li>
	<li>Eingestellt von hand, bis das Deck mit einer 300 mL Wasser-Reservoir auf P3, 300 mL 70 % EtOH Badewanne auf P7, Tipp Loader ALP (TL1) und Mehrkanal-Tipp Wash ALP (TW1) (Abbildung 4und Abbildung 5, Deck Deck).</li>
	<li>Mit der Betriebssoftware, präsentieren Sie AP96 P20 Pipettenspitzen aus den Stapler 10 und verschieben Sie sie in die Tipp-Loader-ALP. Hinweis: 1,5 bis 1.12 alle sind mit der Flüssigkeit, die Handhabung des Roboters Betriebssoftware durchgeführt; siehe Tabelle der Materialien.</li>
	<li>2 Zimmer von Hotel A zu präsentieren und trennen Sie alle vier 96-Well-V-Boden Platten auf dem Deck, Platzierung der Unterseite zwei auf P4 und P8 und die beiden oberen auf P5 und P9 (Abbildung 4).</li>
	<li>Laden Sie AP96 P20 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf. Aspirieren 90 µL aus 300 mL Wasser-Reservoir und verzichten in der 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Platte auf P8.</li>
	<li>Mischen Sie die chemische Bibliothek Platte auf P5 wiederholt Absaugen und 15 µL dreimal. Darüber hinaus Aspirieren Sie 10 µL aus der chemischen Bibliothek Platte auf P5 und verzichten Sie 10 µL in die Verdünnung Platte auf P4 zu.</li>
	<li>Mischen Sie den Lösungen der Platte auf P4 wiederholt Absaugen und 50 µL insgesamt drei Mal. Einmal gemischt, saubere Zeiten der AP96 P20 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH von P7, dann waschen in der Multichannel-Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine Volumen von 110 % des Wassers vier.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,9 für das zweite paar Platten auf P8 und P9. Beim Erstellen der zweiten 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte, Stapel die Platten in der folgenden Reihenfolge von unten nach oben: P4, P9, P5 und P8. Legen Sie den Stapel auf einem leeren statischen ALP; P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis 5 Zimmer im Hotel A leer ist. Wiederholen Sie Schritt 1.5 auf Raum 6 erreichen, Umzug neue AP96 P20 Pipettenspitzen in der Tipp-Loader-ALP und Platzierung der verwendeten AP96 P20 Pipettenspitzen auf einer leeren statischen Alm.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.6-1.10 bis Zimmer 9 Hotels A leer ist. Jedoch müssen um zur Hotel B zu gelangen, die Platten und Tipps auf dem Deck in Hotel A. zurückgeladen werden</li>
	<li>Nachfüllen Sie, Handarbeit, 300 mL Wasser-Reservoir. Dieser Schritt ist entscheidend, und das Computerprogramm übernehmen eine Pause über diese Nachricht, dass der Benutzer drücken Sie "weiter", vor dem nächsten Schritt fort.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 1,5-1.13 für die restlichen Hotels, gewährleistet eine volle 300 mL Wasser-Reservoir jedes Mal vor dem Fortfahren zum nächsten Hotel.</li>
</ol>2. Hinzufügen von Medien-Saatgut-Mischung zu Platten Screening
<ol><li>½ Murashige und Skoog (MS) Medien machen mit 0,1 % Agar durch Zugabe von 4,3 g MS Salts, 0,50 g MES, 1,0 g Agar, 1 L DI H2O. einstellen den pH-Wert 5,7 aber die Zugabe von 5 M Kaliumhydroxid während der Überwachung mit einer pH-Elektrode.</li>
	<li>Sterilisieren Sie Samen durch Schütteln sie in 1 % Bleichmittel und SDS zwischen 15 und 30 min., und spülen Sie dann 4 mal mit einem gleichen Volumen Wasser durch Zentrifugation. Sobald die Samen steril sind, legen Sie sie bei 4 ° C bis zu 24 Stunden, 7 Tage für Vernilization. Das Arabidopsis Biological Resource Center beschreibt zusätzliche Methoden der Sterilisation, Vernilization und Wachstum22.</li>
	<li>Fügen Sie Samen auf Medien von hand bei einer Dichte von 0,1 g/100 mL. Diese Dichte führt zu einem Durchschnitt von 3-10 Samen pro Bohrloch einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Ort, von Hand, vier 96-Well-Wohnung-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A (Abbildung 6, Hotel A). Legen Sie eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf der Tipp-Loader-ALP, 300 mL Reservoir gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Schritten erstellte 2,1-2,3 auf P3 und 300 mL Reservoir gefüllt mit 70 % EtOH auf P7 (Abbildung 4, Deck und Abbildung 6 Deck). Hinweis: 2,5 bis 2,8 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Präsentieren Sie Zimmer 1 und 2 im Hotel A zu, und trennen Sie die Stapel von vier Platten. Setzen Sie eine Platte auf jede der leeren statischen Alpen (P4, P5, P6, P8, P9, P10, P11 und P12). Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen auf 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Aspirieren 90 µL aus 300 mL Medien-Samen Reservoir auf P3 und verzichten in den ersten 96-Well-Wohnung-Bodenplatte. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle acht Platten der Medien-Saatgut-Mischung enthalten.</li>
	<li>Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL aus dem 300 mL Behälter gefüllt mit 70 % EtOH auf P7. Waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp waschen ALP durch Absaugen und Verzicht auf eine 110 % Volumen Wasser viermal, entladen Sie die Tipps bei TL1 und sammeln Sie die Platten mit der hand.</li>
</ol>3. Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Platten Screening
<ol><li>Last, von Hand, eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen in Zimmer 1 des Hotel A, zwei 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten in Zimmer 2, 4, 6 und 8 und zwei 96 gut flach-Screening Bodenplatten in Zimmer 3, 5, 7 und 9 (Abbildung 4 Stapler und Abbildung 7, Hotel A). Verbinden Sie Schläuche darüber hinaus zum und vom Multichannel Tipp Wash ALP auf den 5-Gallonen-Tank. Hinweis: 3.2 bis 3.10 erfolgen mit der Betriebssoftware.</li>
	<li>Konfigurieren Sie das Deck um 300 mL 70 % EtOH Wash Reservoir an P7 enthalten; Das Medien-Samen Reservoir kann auf dem Deck auf P3 gelassen werden (Abbildung 4, Deck und Abbildung 7, Deck). Darüber hinaus schalten Sie die Konsole Fahrt durch Verbindung von der Gerätesteuerung Wasser durch Multichannel Tipp Wash ALP zirkulieren. Dies schaltet automatisch am Ende des Protokolls.</li>
	<li>Präsentieren Sie die AP96 P250 Pipette Tip Box von Hotel A und verschieben Sie es an der Spitze Loader ALP.</li>
	<li>Präsentieren die 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten aus Zimmer 2 Hotels A Deck und Platz eins auf statische ALP P4 und auf P8. Die 96-Well-Wohnung zu präsentieren-Screening Bodenplatten aus Zimmer 3 Hotel a auf das Deck und legen Sie eine statische ALP P5 und eine auf P9.</li>
	<li>Laden Sie AP96 P250 Pipettenspitzen mit dem Loader Tipp ALP auf den 96-Kanal 200 µL Kopf.</li>
	<li>Mischen die 96-Well-V-Verdünnung Bodenplatte auf P4 durch Absaugen und Verzicht auf 50 µL dreimal. Im Anschluss daran Aspirieren 10 µL von dieser Platte und verzichten in der 96-Well-Wohnung-Screening Bodenplatte auf P5.</li>
	<li>Mischen Sie die Lösungen in die Platte bei P5 Absaugen und 50 µL dreimal. Reinigen der AP96 P250 Pipettenspitzen mit Ethanol durch Absaugen und Verzicht auf 70 µL 70 % EtOH aus dem Reservoir auf P7 und dann waschen Sie die Tipps in Multichannel Tipp Wash ALP durch Absaugen und Verzicht auf ein Volumen von 110 % des Wasser viermal.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die zweite 96-Well-V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatte (P8) und 96-Well-flach-Screening Bodenplatte (P9).</li>
	<li>Stapel die beiden 96-Well V-Verdünnung Bibliothek Bodenplatten zusammen und die beiden 96-Well flache Unterseite Screening Platten zusammen. Verschieben Sie die Platten an statischen Alpen P1, P2, P6, P10, P11, P12 oder P13.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,9 dreimal, insgesamt acht Mal Platten Screening verdünnte Chemikalien hinzufügen. Zu guter Letzt überprüfen Sie die Anzahl der Samen in jede Vertiefung der Screening-Platten durch visuelle Konformation und ergänzen Sie diesen Brunnen mit weniger als drei Samen durch zusätzliche sterilisiert und vernalized Samen.</li>
</ol>(4) Inkubation und Visualisierung von Screening-Platten
<ol><li>Inkubieren Sie 96-Well flach-Boden Screening-Platten für vier Tage in einer Klimakammer bei 22 ° C auf einem 16/8 Hell-Dunkel-Zyklus in ein Behältnis Austrocknung. 96-Well flach-Boden Screening-Platten unter dem sezierenden Mikroskop zu visualisieren. Notieren Sie alle abweichende Phänotypen zur weiteren Untersuchung.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll soll Forscher helfen bei der Bewältigung einer vorwärts Chemische Genetik-Bildschirms auf Arabidopsis. Wir bieten repräsentative Ergebnisse von einem Bildschirm von 50.000 Verbindungen (Abbildung 2 und Abbildung 3), einer der größten vorwärts Chemische Genetik Bildschirme auf Arabidopsis9,13,23bisher durchgeführt. Die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter aktiviert eine effizientere Verdünnung Bibliothek und screening-Bibliothek-Generation, Verbesserung der Geschwindigkeit und Effizienz der Identifizierung der neuartige Substanzen. Erhöhung der Kapazität auf Leinwand in einer Hochdurchsatz-Natur wurde durch eine Verringerung der Arbeit im Namen der Forscher begleitet. Diese Technik wurde entwickelt, um mit 96-Well-Platten verwendet werden, die kleinen Samen oder Pflanzen unter dem sezierenden Mikroskop sichtbar unterbringen können. Verwendung von Platten mit größeren Brunnen um größere Samen passen würde Änderungen an den Durchsatz und die Gestaltung erfordern.
Zusätzliche Einschränkungen dieser Technik umfassen die Schwierigkeit dieses Stück der Ausrüstung mit aseptischen Techniken zu verwenden; Allerdings sind wir nicht hohe Prozentsätze einer Kontamination durch ½ MS Medien fehlt Saccharose gestoßen. Man könnte jede Kontamination Problem umgehen, indem Sie Platzierung des Roboters in einem sterilen Raum, ermöglicht für sterilen Bedingungen und Zellkultur oder mithilfe eines liquid Handling-Roboters mit einer sterilen Kammer24,25. Eine weitere Einschränkung ist Spitzengröße und Samen Aspiration. Eine kleine PIPETTENSPITZE wie AP96 P20 würde mit Samen verstopfen; Daher muss eine größere PIPETTENSPITZE für Saatgut zu dosieren und Mischen von Lösung verwendet werden.
Wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls gehören die sorgfältige Beschriftung von alle Platten in der Verdünnung Bibliothek und Screening-Bibliothek, sicherzustellen, dass sie in der richtigen Ausrichtung zusammen mit der richtigen Reihenfolge sind, wenn den Roboter füttern. Klare Kennzeichnung und systematische Verarbeitung ist unkompliziert und kann dieses Problem überwunden. Ein weiterer entscheidender Schritt besteht darin, die richtige Ausrüstung an der richtigen Stelle ist, bevor das Experiment in den Stapler 10 und auf dem Deck. Wenn das Gerät nicht richtig auf dem Deck platziert ist, könnte der 96-Kanal 200 µL Kopf abstürzen das Gerät beschädigen und Wartung erfordern. Ein weiterer wichtiger Schritt ist sicherzustellen, dass die korrekte Menge der Flüssigkeit innerhalb der 300 mL-Behälter befindet und dieser Betrag korrekt in die Software eingegeben wird. Wenn die Zahlen nicht übereinstimmen, die Tipps erreichen nicht die Flüssigkeit und streben wird nicht auftreten.
Es ist auch notwendig, Maßnahmen ergreifen, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse korrekt sind. Ein Fehler, die wir bemerkt während der Entwicklung des Protokolls wurde verknüpft, um Leben zu kippen. Nach aufeinanderfolgenden be- und Entladen verlieren die Spitzen ihre Fähigkeit, Aspirieren und genau dosieren. Es ist daher unerlässlich, dass jeder Satz von 96 Tipps verwendet wird bis zu vier Mal. Es ist auch wichtig, das Waschwasser regelmäßig, um zu vermeiden, das Potenzial für Chemikalien, versehentlich hinzugefügt werden, um die Platten screening zu ändern. Schließlich haben einige Chemikalien eine Tendenz zur Lösung26auszufällen. Um sicherzustellen, dass jede Chemikalie in der richtigen Konzentration hinzugefügt wird, fließen mischen Schritte in der Verdünnung und Screening Protokoll. Mischen Sie kann in geringen Mengen von Chemikalien wird von Bibliothek zu Bibliothek hinzugefügt, anspruchsvolle Interpretation des chemischen Potentials induzierte Phänotypen Nichtbeachtung.
Mit der richtigen Platten für jeden Teil des Protokolls ist auch sehr wichtig. V-Boden Platten sollen sicherstellen, dass kleine Mengen an Flüssigkeit abgesaugt werden können und sind für den Einsatz bei der Erstellung der Bibliothek Verdünnung empfohlen. Diese Platten eignen sich jedoch nicht für das Screening Teil des Protokolls, da ihre Reflexion von Licht zu schlechten Visualisierung der Phänotypen führt. Um die Phänotypen der 3-4 Tage alte Sämlinge beobachten, muss der Bildschirm in flach-Boden Platten durchgeführt werden.
Sobald die siebungplatten erstellt wurden, wird die Visualisierung benötigt. flach-Boden 96-Well-Platten ermöglichen einfache Visualisierung unter Mikroskopen zu sezieren. Es ist zwingend notwendig, dass die Platten in Austrocknung-Behältern zur Verringerung der Verdunstung der Medien gespeichert sind. Eine Alternative zur mikroskopischen Visualisierung ist einen hochauflösende Scanner verwenden. Bilder mit hoher Auflösung zeigen die Mehrheit der Phänotypen, die in diesem Bildschirm beobachtet und bieten ein Archiv mit den Ergebnissen, die in der Zukunft revidiert werden können. Sobald Visualisierung abgeschlossen ist, und die Bibliothek Ihrer Wahl gezeigt, könnte diese Methode dann auf verschiedene Organismen oder durch eine andere chemische Bibliothek durchgeführt werden. Modifikationen am Gerät können für die sterile Kultur, so dass Ventures in das Reich der Stammzellen, Pilze, Insekten und kleine Pflanzen2,18,25,27.

In den vergangenen 20 Jahren haben Forscher auf dem Gebiet der Pflanzenbiologie große Fortschritte mit Hilfe chemischer Genetik Ansätze, sowohl vorwärts als auch rückwärts, gemacht, ein besseres Verständnis der Zellwand Biosynthese, Zellskelett, Hormon-Biosynthese und Signalisierung, Gravitropismus, Pathogenese, Purin-Biosynthese und Endomembrane Handel mit1,2,3,4,5. Einsatz nach vorne Chemische Genetik Techniken ermöglicht die Identifizierung von Phänotypen von Interesse und erlaubt es den Forschern, die genotypischen Grundlagen für bestimmte Prozesse zu verstehen. Im Gegensatz dazu sucht reverse Chemische Genetik Chemikalien, die mit einer vorher festgelegten Protein Ziel6interagieren. Arabidopsis hat an der Spitze dieser Entdeckungen in Pflanzenbiologie, weil sein Genom klein abgebildet und kommentiert. Es hat eine kurze Generationszeit, und es gibt mehrere Mutant/Reporter Zeilen zur Verfügung, um die Identifizierung von aberranten subzelluläre Maschinen7zu erleichtern.
Es gibt zwei große Engpässe, die verlangsamen den Fortschritt der vorwärts chemische genetische Bildschirme, die ersten screening-Prozess und bestimmen das Ziel der Verbindung von Interesse8. Eine große Hilfe bei der Erhöhung der Geschwindigkeit des kleinen Molekül-Auswahl ist die Verwendung von Automatisierung und automatisierte Anlagen9. Liquid Handling-Roboter sind ein hervorragendes Instrument für den Umgang mit großen Bibliotheken von kleinen Molekülen und maßgeblich voran in den biologischen Wissenschaften10gewesen. Die hier vorgestellten Protokoll wurde entwickelt, um den Engpass zugeordneten Screening-Verfahren ermöglicht die Identifizierung von bioaktiven kleine Moleküle mit einer schnellen Rate. zu lindern Diese Technik verringert die Last der Arbeit und Zeit im Auftrag des Betreibers und auch gleichzeitig die wirtschaftliche Kosten für die Prinzip-Ermittler.
Bisher haben die meisten chemische Bibliotheken analysiert zwischen 10.000 und 20.000 Verbindungen, einige mit mehr als 150.000 andere mit nur 709,11,12,13,14, statt. 15 , 16. das Protokoll hier eingeführt wurde auf einer kleinen Molekül-Bibliothek von 50.000 Verbindungen (siehe Tabelle der Materialien) umgesetzt, die größeren vorwärts Chemische Genetik Bildschirme durchgeführt auf Arabidopsis bis heute. Dieses Protokoll passt mit dem aktuellen Trend zu mehr Effizienz und Geschwindigkeit betreffend vorwärts Chemische Genetik, zumal es bezieht sich auf Fungizid, Herbizid Entdeckung, Insektizid Entdeckung entdecken, drug Discovery und Krebsbiologie17 ,18,19,20,21. Obwohl hier mit Arabidopsis implementiert, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden Zellkulturen, Sporen und möglicherweise sogar Insekten im flüssigen Medium innerhalb 96, 384 oder 1536-Well Platten. Aufgrund seiner geringen Größe ist Arabidopsis zugänglicher Screening in 96-well-Platten. Verteilung von Saatgut gleichmäßig auf alle Brunnen ist jedoch eine Herausforderung. Aussaat von Hand genau, aber arbeitsintensiv ist, und zwar gibt es Geräte, die Samen in 96-Well Platten zu verzichten, sie sind teuer in der Anschaffung. Hier zeigen wir, wie dieser Schritt mit nur einem kleinen Verlust an Genauigkeit umgangen werden kann.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode war eine große chemische Bibliothek gegen Arabidopsis mehr überschaubar, ohne Kompromisse bei der Genauigkeit, über die Verwendung von einem liquid Handling-Roboter screening zu machen. Die Verwendung dieser Methode verbessert die Effizienz des Forschers durch verringern den Zeitaufwand für die anfängliche Verdünnung Serie Management und nachfolgenden phänotypischen Bildschirmen ermöglicht schnelle Visualisierung der Proben unter dem sezierenden Mikroskop und schnelle Runden Identifizierung neuer bioaktiver kleiner Moleküle. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Ergebnisse dieses Protokolls in 4 Schritten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig1.jpg"> Abbildung 1: allgemeine Workflow des Bildschirms nach vorne Chemische Genetik. Einen Überblick über das Protokoll für jedes der 4 wichtigsten Schritte mit einigen Details beschrieben werden. 1: Erhalt der chemischen Bibliothek, 2: die Verdünnung Bibliothek, 3: macht die Screening-Platten und 4: Inkubation und Visualisierung der Screening-Platten. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Keyboard</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Mouse</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer Screen</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>Computer</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used for protocol design and operating the Biomek FX</td></tr><tr><td>DIVERSet Diverse Screening Library</td><td>ChemBridge</td><td>N/A</td><td>Chemical library</td></tr><tr><td>Biomek Software</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A</td><td>Runs and designs the Biomek FX</td></tr><tr><td>Device Controller</td><td>Beckman Coulter</td><td>719366</td><td>Operates the water pump/tip washing station</td></tr><tr><td>Stacker Carousel Pendent</td><td>Beckman Coulter</td><td>148240</td><td>Manual operation of Biomek Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek Stacker Carousel</td><td>Beckman Coulter</td><td>148520</td><td>Rotary unit that houses all FX Stacker 10&#039;s</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>FX Stacker 10</td><td>Beckman Coulter</td><td>148522</td><td>Elevator unit that houses components for screen</td></tr><tr><td>Biomek FX</td><td>Beckman Coulter</td><td>https://www.beckman.com/liquid-handlers</td><td>Robot that performs the desired operations</td></tr><tr><td>Accuframe</td><td>Artisan Technology Group</td><td>76853-4</td><td>Frames arm to place components corretly</td></tr><tr><td>Framing Fixture</td><td>Beckman Coulter</td><td>719415</td><td>Centers arm in the Accuframe</td></tr><tr><td>Multichannel Tip Wash ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719662</td><td>Washes the tips after the ethanol bath</td></tr><tr><td>Tip Loader ALP</td><td>Beckman Coulter</td><td>719356</td><td>Pneumatically loads tips onto the arm</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air for pneumatic tip loading</td></tr><tr><td>MasterFlex Console Drive</td><td>Cole-Parmer</td><td>77200-65</td><td>Pump used to circulate water through the Multichannel Tip Washer</td></tr><tr><td>Air Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides air from air compressor to Tip Loader</td></tr><tr><td>Water Hose</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Provides water from 5 Gallon Reserviour to Tip Washer</td></tr><tr><td>Static ALP&#039;s</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Supports equipment for the Screen</td></tr><tr><td>5 Gallon Reserviour</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Recirculates the dirty water from cleaning the tips</td></tr><tr><td>Grippers</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Grabs and moves the equipment to the correct places</td></tr><tr><td>96-Channel 200 &amp;micro;L Head</td><td>Beckman Coulter</td><td>Comes with Biomek FX</td><td>Holds the 96 tips used within the screen</td></tr><tr><td>AP96 P200 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717251</td><td>Used to make the screening library</td></tr><tr><td>96 Well Flat Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>9018</td><td>Aids in visulization of screen</td></tr><tr><td>96 Well V-Bottom Plate</td><td>Costar</td><td>3897</td><td>Aids in storing of dilution library</td></tr><tr><td>AlumaSeal 96 Sealing Film</td><td>MedSci</td><td>F-96-100</td><td>Seals for storage both the chemicle library and dilution library</td></tr><tr><td>Plastic ziplock sandwich bags</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Used to ensure a humid environment for screen</td></tr><tr><td>AP96 P20 Pipette Tips</td><td>Beckman Coulter</td><td>717254</td><td>Used in the dilution library creation</td></tr><tr><td>Growth Chamber</td><td>Percival</td><td>AR36L3</td><td>Germinates seeds for phenotypic visulization</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Holds seeds to add into wells where liquid seeding failed seed adequatly</td></tr><tr><td>Toothpick</td><td>Local Provider</td><td>N/A</td><td>Pushes seeds from spatula to wells</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog Basal Salt Mixture</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M524</td><td>Add to MS media mixture</td></tr><tr><td>MES Free Acid Monohydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19483580</td><td>Added to MS media to decrease pH</td></tr><tr><td>Agar Powder</td><td>Alfa Aesar</td><td>9002-18-0</td><td>Increases thickness of media to support seed suspension</td></tr><tr><td>5M KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td>Increases pH to adequate levels</td></tr><tr><td>1L Media Storage Bottle</td><td>Corning</td><td>1395-1L</td><td>Holds enough media for a screen</td></tr><tr><td>Polypropylene Centrifuge Tubes</td><td>Corning</td><td>431470</td><td>Sterilizes seeds prior to vernilization</td></tr><tr><td>pH Probe</td><td>Davis Instruments</td><td>YX-58825-26</td><td>Used for making media</td></tr><tr><td>ALPs (Automated Labware Positioners) Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987836</td><td>Aids in setting up the accompaning equipment for the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek 2000 Stacker Carousel Users Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>609862-AA</td><td>Aids in setting up the Stacker Carousel</td></tr><tr><td>Biomek FX and FX&lt;sup&gt;P&lt;/sup&gt; Laboratory Automation Workstations Users Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987834</td><td>Used to frame the Multichannel Pod</td></tr><tr><td>Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Customer Startup Guide</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN B32335AB</td><td>Used to aid in setting up the Biomek FX</td></tr><tr><td>Biomek Software User&#039;s Manual</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN 987835</td><td>Used to set up and understand the Software</td></tr></tbody></table>

optimizing the use of a liquid handling robot to conduct a high throughput forward chemical genetics screen of arabidopsis thaliana

Chemischer Genetik wird zunehmend Züge in Pflanzen zu entschlüsseln, die widerspenstigen zu traditionellen Genetik durch gen-Redundanz oder Letalität möglicherweise eingesetzt. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit eines synthetischen kleinen Moleküls als bioaktive gering; Daher müssen Tausende von Molekülen getestet werden, um diejenigen von Interesse finden. Liquid handling Roboter Systeme sind entworfen, um große Anzahl von Proben, die Erhöhung der Geschwindigkeit, mit der eine chemische Bibliothek untersucht werden kann, zusätzlich minimieren/Standardisierung Fehler, zu behandeln. Erreichung einen Hochdurchsatz-vorwärts Chemische Genetik-Bildschirm aus einer Bibliothek von 50.000 kleine Moleküle auf Arabidopsis Thaliana (Arabidopsis), Protokolle mit einer Benchtop-Mehrkanal-Flüssigkeit handling-Roboter entwickelt, die minimale erfordern Techniker-Beteiligung. Mit diesen Protokollen wurden 3.271 kleine Moleküle entdeckt, dass sichtbare phänotypische Veränderungen verursacht. 1.563 Verbindungen induziert kurze Wurzeln, 1.148 Verbindungen verändert Färbung, 383 Verbindungen verursacht Wurzelhaare und andere, nicht kategorisiert, Änderungen und 177 Verbindungen gehemmt Keimung.

Die Fähigkeit, genau und effizient charakterisieren Phänotypen basierend auf die Zugabe von kleinen Molekülen bei screening-Konzentrationen unter dem sezierenden Mikroskop ist das Endziel dieser Methode der vorwärts Chemische Genetik auf Arabidopsis. Die Phänotypen beobachtet, wenn alle 50.000 Verbindungen gezeigt hatte war vielfältig und kann in mehrere unterschiedliche Klassen (Abbildung 2) aufgeteilt werden. Abbildung 3A -F zeigt Beispiele der Phänotypen, die bei kleiner Vergrößerung unter dem sezierenden Mikroskop beobachtet wurden. Einige Phänotypen bereitgestellten eindeutigen Ergebnisse (Abbildung 3, H). Diese mussten erneut getestet werden, bei niedrigeren Konzentrationen um sicherzustellen, dass die Chemikalie keinen anderen Phänotyp bei einer niedrigeren Dosis bieten.
Schlechte Ergebnisse können aus vielen Gründen entstehen. Schlechte Keimrate der Samen ist. Dadurch kann eine Screening-Platte, überwiegend weisen keine Keimung oder unvollständige Keimung Phänotypen (Abbildung 3, H), die irreführend sein können. Um dies zu überwinden, vor dem test Keimrate für alle Samen verwendet. Sobald Keimrate sich etabliert haben und sind mehr als 95 % für Arabidopsis, ist Vernalisation von Saatgut vor chemischen Zusatz ein wichtiger Schritt, die gleichzeitige Keimung zu gewährleisten. Mangel an gleichzeitigen Keimung kann zu Fehlalarmen in Phänotypisierung führen. Darüber hinaus können schlechte Ergebnisse entstehen, wenn Medien erlaubt ist, während der Inkubation verdunsten. Diese mangelnde Flüssigkeitszufuhr verhindert, dass Samen keimen und kann durch den Einsatz von Austrocknung-Behältern vermieden werden. Darüber hinaus DMSO und Medien-Lösungen sind in den beiden externen Spalten jede Platte, Sicherstellung der ordnungsgemäßen Mikroklimata und Keimrate erzielt werden.
Befriedigende experimentelle Ergebnisse werden erzielt, wenn Keimungsraten sind > 95 %, Samen sind vor der Zugabe in 96-Well flach-Boden-Platten, Gewährleistung gleichzeitige Keimung, vernalized und Medien verdampft nicht während der Inkubation. Im Idealfall würden Chemikalien getestet werden, in einer Konzentration, die alle Samen zu keimen und Phänotypen genau beurteilt werden kann (Abb. 3A-F). Die Mehrheit der Behandlungen produziert Sämlinge mit Phänotypen, die optisch nicht zu unterscheiden von mock Steuerelemente mit keine morphologischen Phänotypen (Abbildung 3A), mit der überwiegenden Mehrheit der abweichende Phänotypen bestehend aus wurden gebleicht und stark verkümmerte Wurzeln (Abbildung 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2.jpg"> Abbildung 2: die häufigsten Phänotypen beobachtet und der Anteil des einzelnen Phänotyps beobachtet. (A) insgesamt 3.271 kleine Moleküle erwiesen sich bei 100 µM bioaktiven nach vier Tagen Inkubationszeit. Die Farbe gibt den Schweregrad des Phänotyps (schwarz = schweren, weißen = weniger stark). Die am häufigsten beobachteten Phänotyp bezogen sich auf Wurzel Morphologie, mit mehr als 1.500 Verbindungen induzierende verkümmerte Wurzeln unterschiedlichen Schweregrades. Färbung wirkte auch häufig durch die Verbindungen in dieser Bibliothek mit 1.148 Sämlinge als vollkommen gebleicht oder teilweise verfärbt. Knapp 400 Mischungen produziert charakteristische Wurzelhaare Phänotypen – entweder verkümmert oder beide verkümmert und bunt. Schließlich war die Keimung von knapp 200 Verbindungen betroffen. In diesen Fällen Samen keimen nicht abgeschlossen oder nicht einmal ansatzweise zu keimen. (B) Sämlinge ausstellenden Anomalien in der Wurzel Morphologie, entweder verkümmert oder stark verkümmert, fast die Hälfte aller phänotypisch aberranten Sämlinge konstituiert. Die nächste größte Gruppe waren diejenigen, die in gebleichtem oder verfärbte Sämlinge geführt. Phänotypen, die Wurzelhaare Anomalien auch besteht ein beträchtlicher Teil, während die Hemmung der Keimung, entweder keine Keimung oder unvollständige Keimung betrafen, trat nur bei einem kleinen Prozentsatz aller bioaktiven Verbindungen. Schließlich gab es eine Reihe von Phänotypen, die bei solch einer niedrigen Frequenz aufgetreten, sie waren in der Kategorie "Sonstige", zum, die Beispiel, die Produktion von grünem Schleim, in Abbildung 3zu sehen war gruppiert. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig3.jpg"> Abbildung 3: Bilder der repräsentativen Phänotypen beobachtet, während der Bildschirm nach vorne Chemische Genetik. Keine sichtbaren morphologischen Anomalien (A), Braun (B), verkümmert (C) Root, stark verkümmert Wurzelhaare root (D), gebleicht (E), grüner Schleim (F), unvollständige Keimung (G) und keine Keimung (H). <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig4.jpg"> Abbildung 4: Übersicht der Stapler 10 und Deck vor Einleitung des Protokolls eingerichtet. Die Stapler-Karussell besteht aus vier Stapler 10 (Hotels A - D) die jeweils zehn Zimmern untergebracht werden. Das Deck bietet eine Vielzahl an Alpen: Tipp-Loader, der Stapler-Shuttle, Multichannel-Tipp waschen und 13 statische Alpen. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig5.jpg"> Abbildung 5: Stapler 10 und Deck eingerichtet zum Erstellen einer Bibliothek Verdünnung erforderlich. Die vier Stapler 10 sind voller Kisten mit AP96 P20 Pipettenspitzen in Zimmer 1 und 6 des Hotels A - D und Stapeln von vier 96-Well-V-Bodenplatten in 2-5 und Zimmer 7-9 Zimmer des Hotels A - D. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig6.jpg"> Abbildung 6: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von Medien-Saatgut Mischung zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit vier 96-Well-Wohnung geladen-Bodenplatten in Zimmer 1 und 2 des Hotel A. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7 und eine Schachtel mit AP96 P250 Pipettenspitzen auf TL1. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57393/57393fig7.jpg"> Abbildung 7: Stapler 10 und Deck eingerichtet für Hinzufügen von kleinen Molekülen zu Screening Platten. Die Stapler-10 ist mit einer Schachtel AP96 P250 Pipettenspitzen in Saal 1, einen Stapel von zwei 96-Well-V geladen-Verdünnung der unteren Platten in Zimmer 2, 4, 6, und 8 und einen Stapel von zwei 96-Well-Wohnung-Bodenplatten gefüllt mit der Medien-Saatgut-Mischung in Zimmer 3 , 5, 7 und 9. Das Deckslayout besteht aus zwei 300 mL Reservoirs auf statische Alpen P3 und P7. <a href="/files/ftp_upload/57393/57393fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

Optimierung der Nutzung eines Liquid Handling Roboters, einen hohen Durchsatz nach vorn Chemische Genetik Bildschirm von Arabidopsis Thaliana durchzuführen

Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Chemical genetics is increasingly being employed to decode traits in plants that may be recalcitrant to traditional genetics due to gene redundancy or ...

optimizing-use-liquid-handling-robot-to-conduct-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

6.6K Aufrufe.  University of Kentucky. Ein hoher Durchsatz-Bildschirm synthetische kleiner Moleküle wurde auf der Modell-Pflanzenart Arabidopsis Thalianadurchgeführt. Dieses Protokoll, entwickelt für eine liquid Handling-Roboter, erhöht die Geschwindigkeit des vorwärts Chemische Genetik Bildschirme, die Entdeckung der neuartigen kleine Moleküle, die Auswirkungen auf die Physiologie der Pflanzen zu beschleunigen.

Serie: Optimizing the Use of a Liquid Handling Robot to Conduct a High Throughput Forward Chemical Genetics Screen of Arabidopsis thaliana

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal transduction pathways, transcriptional regulatory networks, gene expression, genome-editing, and gene-silencing. Furthermore, significant progress has been made in the regeneration of plants from protoplasts, which has generated even more interest in the use of these systems for plant genomics. In this work, a protocol has been developed for automation of protoplast isolation and transformation from a &#39;Bright Yellow&#39; 2 (BY-2) tobacco suspension culture using a robotic platform. The transformation procedures were validated using an orange fluorescent protein (OFP) reporter gene (pporRFP) under the control of the Cauliflower mosaic virus 35S promoter (35S). OFP expression in protoplasts was confirmed by epifluorescence microscopy. Analyses also included protoplast production efficiency methods using propidium iodide. Finally, low-cost food-grade enzymes were used for the protoplast isolation procedure, circumventing the need for lab-grade enzymes that are cost-prohibitive in high-throughput automated protoplast isolation and analysis. Based on the protocol developed in this work, the complete procedure from protoplast isolation to transformation can be conducted in under 4 hr, without any input from the operator. While the protocol developed in this work was validated with the BY-2 cell culture, the procedures and methods should be translatable to any plant suspension culture/protoplast system, which should enable acceleration of crop genomics research.

A high-throughput, automated, tobacco protoplast production and transformation methodology is described. The robotic system enables massively parallel gene expression and discovery in the model BY-2 system that should be translatable to non-model crops.

Ein Roboter-Plattform für Hochdurchsatz-Isolierung von Protoplasten und Transformation

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Forschung

Genetik

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.

Hochdurchsatz-robotically Assisted Isolation von temperaturempfindlichen Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages for identifying biologically active chemical structures that can modify complex phenotypes such as lifespan. Described here is a simple protocol for producing hundreds of 96-well culture plates with fairly consistent numbers of C. elegans in each well. Next, we specified how to use these cultures to screen thousands of chemicals for effects on the lifespan of the nematode C. elegans. This protocol makes use of temperature sensitive sterile strains, agar plate conditions, and simple animal handling to facilitate the rapid and high throughput production of synchronized animal cultures for screening.

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Here we describe a simple protocol for rapidly producing hundreds of nematode growth media agar, 96-well culture plates with consistent numbers of Caenorhhabditis elegans per well. These cultures are useful for the phenotypic screening of whole organisms. We focus here on using these cultures to screen chemicals for pro-longevity effects.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Biochemie

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatisierte Roboter Liquid Handling Versammlung Modular DNA-Geräte

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Biotechnik

Hochdurchsatz-Screening für die Proteinkristallisation

High-Throughput Screening to Obtain Crystal Hits for Protein Crystallography

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into an ordered lattice amenable to diffraction remains challenging. The crystallization of biomolecules is largely experimentally defined, and this process can be labor-intensive and prohibitive to researchers at resource-limited institutions. At the National High-Throughput Crystallization (HTX) Center, highly reproducible methods have been implemented to facilitate crystal growth, including an automated high-throughput 1,536-well microbatch-under-oil plate setup designed to sample a wide breadth of crystallization parameters. Plates are monitored using state-of-the-art imaging modalities over the course of 6 weeks to provide insight into crystal growth, as well as to accurately distinguish valuable crystal hits. Furthermore, the implementation of a trained artificial intelligence scoring algorithm for identifying crystal hits, coupled with an open-source, user-friendly interface for viewing experimental images, streamlines the process of analyzing crystal growth images. Here, the key procedures and instrumentation are described for the preparation of the cocktails and crystallization plates, imaging the plates, and identifying hits in a way that ensures reproducibility and increases the likelihood of successful crystallization.

Autor im Rampenlicht: Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie  

This protocol details high-throughput crystallization screening, ranging from the 1,536 microassay plate preparation to the end of a 6 week experimental time window. Details are included about the sample setup, the imaging obtained, and how users can perform analyses using an artificial intelligence-enabled graphical user interface to quickly and efficiently identify macromolecular crystallization conditions.

Hochdurchsatz-Screening zur Gewinnung von Kristalltreffern für die Proteinkristallographie

X-ray crystallography is the most commonly employed technique to discern macromolecular structures, but the crucial step of crystallizing a protein into ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Generischen Protokoll zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion mit automatisierten Microbioreactor Technologie

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

Ein High-Throughput-Screen für Biomining Cellulase Aktivität von Metagenombanken

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

Biologie

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative und automatisierte Hochdurchsatz-genomweiten RNAi-Screens in C elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

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