Name: automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body
Uploaded: 2018-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Wir würden gerne anerkennen, Anthony Bowen deren Folien als einen zweiten menschlichen Side-by-Side-Vergleich dienten als auch Sabrina Nolan deren Folien als dritte menschliche Side-by-Side und zweite Mikroskop Vergleich verwendet wurden.

1. Vorbereitung der Tusche Folie
<ol><li>Pipette 10 µL Cryptococcus Probe auf eine Folie. Jede Runde Hefestamm funktioniert aber für dieses Experiment H99 war die einzige Sorte verwendet. Hinweis: Wenn die Probe direkt aus Kultur, Medien, Verdünnung 1:2 mit PBS oder Wasser helfen Verklumpung der Tusche zu verhindern.</li>
	<li>Pipette 2 µL Indien Tintenfleck auf die Probe und mischen, indem Sie körperlich schieben die Pipettenspitze auf die Probe und in einer kreisförmigen Bewegung verschieben, bis die Tusche gleichmäßig verteilte erscheint.</li>
	<li>Platzieren Sie ein Deckglas über der Probe durch Gedrückthalten der linken Kante des Deckglases gegen die Oberfläche der Folie, dann sanft und gleichmäßig Absenken der Gegenseite das Deckglas über die Probe.</li>
	<li>Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen für 5 min.</li>
	<li>Wenden Sie eine dünne Schicht des Nagellacks sanft auf Deckgläschen Grenze bilden eine Dichtung und bewahren die Tuschefleck an</li>
</ol>(2) Imaging-Folie
<ol><li>Platzieren Sie Folien in einem Hellfeld-Mikroskop mit einer Kamera Aufsatz und bekannten Pixel-µm-Konvertierung. Einstellen Sie Filter, Ziele und Kontrast so, dass Zelle Kapseln klar sind und Zellkörper konzentriert, dunkle Bänder sind. Hinweis: Verschiedene Filter, Ziele und Kontrasteinstellungen funktioniert, aber ein 20 x Ziel, Ph1 Filter und 2 x 2 binning wird empfohlen.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass das Sichtfeld ist dicht aber nicht überbevölkerten mit Cryptococcus Zellen mit deutlichen Kontrast zwischen Zelle Kapsel und Hintergrund, und richtig fokussiert mit den Zellkörper als ein dunkles Band visualisiert. Hinweis: Die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild variiert je nach Probe und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes).</li>
	<li>Speichern Sie Bilder in einem einzelnen Verzeichnis mit klaren Titel, wie die Messung-Algorithmus auf Bilder in einem einzigen Verzeichnis ausgeführt werden wird und die Ausgabe von Daten nach dem Namen der Image-Dateien organisiert werden.</li>
</ol>(3) Algorithmus Setup
<ol><li>Installieren Sie Python Version 2.7 von</li>
	<li>Weitere Python-Bibliotheken durch Ausführen der Befehle "Pip installieren Kissen" und "Pip installieren Openpyxl".</li>
	<li>MATLAB zu installieren, indem Sie die Anweisungen auf</li>
	<li>Build die MATLAB-Python-Bibliothek anhand der Anweisungen auf https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html zur Verfügung gestellt.</li>
	<li>Laden Sie die drei benötigten Dateien in dieser Handschrift Zusatzmaterialien ("QCA.py", "Analysis2.m" und "TestRun.m") enthalten. Hinweis: Diese Dateien können an einem beliebigen Speicherort extrahiert werden, aber alle drei müssen im selben Verzeichnis sein.</li>
</ol>4. Verwendung des Algorithmus
<ol><li>Führen Sie die Anwendung durch einen Doppelklick auf QCA.py. Hinweis: Die Anwendung kann mehrere Minuten zum starten dauern. Die "QCA.py"-Datei enthält die Programmstruktur, die die "m-" Dateien zum Ausführen des eigentlichen Algorithmus aufruft.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte im Programm.<ol>
<li>Eingabe der Erweiterungstyp Bilddateien zeitlich vorangestellt und durch Semikolons getrennt (ex. ". TIF;. JPEG") dann klicken Sie auf die Enter -Taste.</li>
		<li>Wählen Sie das Verzeichnis, in dem die Bilddateien befinden, durch Klicken der Schaltfläche " Verzeichnis auswählen " und wählen Sie den Ordner, der die Bilder enthält.</li>
		<li>Erstellen Sie die Liste der Image-Dateien im Verzeichnis durch Anklicken des Buttons Generieren Bildliste . Die Bilder werden in das Textfeld auf der rechten Seite aufgelistet. Zu überprüfen Sie und sicherzustellen Sie, dass die Liste korrekt und vollständig sind.</li>
		<li>Wählen Sie ein zufälliges Bild aus der Liste als Vorschau klickst du Zufällige Bild auswählen . Achtung: Wenn das Bild nicht in der Lage, durch ein "falsches Bild Modus Fehler" zu öffnen, wird der Algorithmus noch richtig funktionieren trotz das Bild nicht angezeigt. Nach Schritt 4.2.7 zeigt noch das Testbild.</li>
		<li>Geben Sie Mikroskopobjektiv und binning Einstellungen ein. Wenn die Standardeinstellungen nicht übereinstimmen das Mikroskop verwendet, wählen Sie "Custom Pixel Konvertierung" und geben Sie die Pixel-auf-um Konvertierung für die Image-Dateien. Einmal ausgewählt, klicken Sie auf Berechnen, Konvertierung und sicherzustellen Sie, dass die Konvertierung richtig laut das Textfeld auf der rechten Seite ist. Hinweis: Repräsentative in Abbildung 1 gezeigten Bilder wurden mit 40 x Vergrößerung und 2 x 2 binning ausgewählt berechnet.</li>
		<li>Eingabeparameter für die Kreis-Erkennung Algorithmus.<ol>
<li>Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die äußeren Kapsel Erkennung als Min und Max Kapsel Radius Einträge. Eine geringere Reichweite ermöglicht genauere Ergebnisse.</li>
			<li>Geben Sie den minimalen und maximalen Radius nachweisbar für die Zellkörper Erkennung als Min und Max Zellkörper Radius Einträge. Hinweis: Alle vier dieser Einträge sollte zahlen für ihre jeweiligen Werte in Pixel, nach der Quellbilder.</li>
			<li>Bewegen Sie die Kapsel und Zellkörper Empfindlichkeit Schieberegler die Sensibilitätsschwelle des Algorithmus anpassen. Eine geringe Empfindlichkeit wird streng sein und falsche positive Kreis Erkennung reduzieren, sondern auch weniger echte Kreise erkennen kann. Im Gegensatz dazu eine hohe Empfindlichkeit erhöht die Erkennungsrate aber auch unter Umständen falsche positive Kreise. Hinweis: Repräsentative Ergebnisse wurden mit einer Kapsel Mindestradius von 7, Kapsel Maximalradius von 45, minimale Körper Radius von 4, maximale Körper Radius von 30, Kapsel Empfindlichkeit von 87 und Körper Empfindlichkeit von 87.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prüfparameter auf zufällig ausgewählten Bild durch Anklicken der Schaltfläche Testen . Das Ergebnis erscheint oben in der Mitte des Programms, das ursprüngliche Bild zu ersetzen. Wenn die Ergebnisse genauer betrachten, empfiehlt es sich, wählen ein zusätzliche zufällige Bild, als auch zu versuchen, um sicherzustellen, dass die ausgewählten Parameter werden alle ausgewählten Bilder passen.<ol>
<li>Maximieren Sie die Anzahl der Körper und Kapseln erkannt und visuell zu kontrollieren, ob die Kreise scheinen richtig passen. Die Anzahl der Körper in Kapseln erkannt wird in das Textfeld auf der rechten Seite angezeigt. Anderweitig, die Algorithmus-Parameter zu bearbeiten, bis die Ergebnisse genau sind. Hinweis: Die dicken farbigen Kreise sollen nur mit Visualisierung helfen. Die tatsächliche Kreise erzeugt für die Messung ist eine mathematische Kurve, die durch die HCT-Algorithmus berechnet.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie des Erkennungsalgorithmus auf das gesamte Verzeichnis von Image-Dateien durch Klicken auf die Schaltfläche Beginnen Analyse . Jedes Bild analysiert werden und das Programm zeigt "fertig" in das Textfeld auf der rechten Seite wenn alle Bilder analysiert wurden.</li>
		<li>Klicken Sie auf Spiel und Bereinigung . Dies wird entsprechen erkannten Zellkörper, die erkannten Kapseln, die, denen Sie Ihren Wohnsitz, und den wahre Kapsel Radius durch Subtraktion Körper von Kapsel zu berechnen. Hinweis: Wenn der Algorithmus verwendet wird, um Fluoreszenz erkennen oder eine andere Situation, in denen nur ein Kreis ist, dieser Schritt erkannt ist unnötig. Stattdessen klicken Sie Nur ziehen Körper oder die Schaltfläche " Nur ziehen Kapseln " zum Sammeln der Daten für nur blau oder nur die grüne Kreise, beziehungsweise. Es ist wichtig zu beachten, dass wenn nur die Kapsel Daten abgerufen werden der Radius der Gesamtradius des der Zelle wird als Referenz der Radius der Zellkörper nicht abgezogen werden könnte.</li>
		<li>Suchen Sie die fertigen Daten in der Datei "CleanedOuput.csv" im Bildverzeichnis. Wenn nur ein Datenelement ausgewählt wurde, wird die Datei "CleanedBodies.csv" oder "CleanedCapsules.csv" beschriftet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV/AIDS.">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li><li>Kwon-Chung, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+neoformans+and+Cryptococcus+gattii,+the+etiologic+agents+of+cryptococcosis.">Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii, the etiologic agents of cryptococcosis.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 4 (7), 019760 (2014).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsules+from+Pathogenic+and+Non-Pathogenic+Cryptococcus+spp.+Manifest+Significant+Differences+in+Structure+and+Ability+to+Protect+against+Phagocytic+Cells.">Capsules from Pathogenic and Non-Pathogenic Cryptococcus spp. Manifest Significant Differences in Structure and Ability to Protect against Phagocytic Cells.</a> PLoS One. 7 (1), 29561 (2012).</li><li>Garc&#237;a-Rivera, J., Chang, Y. C., Kwon-Chung, K. 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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Die entscheidenden Schritte dieser Technik bereiten die Tusche Folie und die Mikroskopbilder zu erwerben. Während der Algorithmus erfolgreich, mit einer Vielzahl von Folie und Bild Techniken getestet wurde wird die empfohlene Protokoll in diesem Manuskript beschrieben. Die Polysaccharid-Kapsel wird erkannt, basierend auf den Ausschluss von Indien Tintenpartikel aus der Domäne der Kapsel, da diese Teilchen zu groß sind, um das Polysaccharid Fibrille Netzwerk eindringen. Tusche Ausgrenzung führt zu einem hellen Kreis auf einem dunklen Hintergrund. Der Algorithmus erkennt Kreise basierend auf wie gut sie mit ihren Hintergrund kontrastieren. So führt eine schwere Indien Tintenfleck höheren Kontrast zwischen Polysaccharid-Kapsel und Hintergrund, Erhöhung Signal-Rausch-Verhältnis und die Verbesserung der Ergebnisqualität. Im Gegensatz dazu ist der Zellkörper als einen dunklen Kreis auf einem hellen Hintergrund erkannt. Die Zellkörper wechselt aussehen basierend auf die Brennebene des Mikroskops eingestellt ist, erscheint als eine diffuse graue Kreis oben oder unten der Zelle und als eine verkürzte dunkles Band in der Mitte. Aus den gleichen Gründen bereits besprochen sollte die Brennebene, wo die Zellkörper als kondensierte, dunkle Band erscheint, für die Bildaufnahme verwendet werden, da dies in der genauesten Kreis Erkennung führt.
Die Methode hier berichtet ist durch mehrere Änderungen und Runden der Fehlersuche vorangekommen. Der Algorithmus wurde zunächst codierten erwartet, dass Zellen nicht kleiner als 4 oder größer als 60 Pixel basierend auf das Mikroskop, das verwendet wurde. Erweitern Sie die Anwendung dieses Algorithmus auf verschiedenen Vergrößerungen und Zellgrößen, die diese Grenzen durch die Benutzer Eingabefelder im Protokoll beschrieben stattdessen ersetzt wurden. Benutzer können jetzt Parameter spezifisch für jedes Experiment für maximale Genauigkeit geben. Wenn dieser Algorithmus auf eine Situation außerhalb Cryptococcus Kapsel Messung angewendet wird empfiehlt es zuerst Einrichten einer Reihe von Dosisfindung Bedingungen zu bestimmen, wie Muster erzeugt und abgebildet werden.
Die wichtigste Einschränkung dieser Technik ist, dass es mit einer bestimmten Anwendung im Auge, nämlich die Messung von Cryptococcus Kapsel entwickelt wurde. Während es leicht geändert werden kann, um zusätzliche Anwendungen zu passen, ist dieses Skript nur direkt auf die Kapsel Messprotokoll skizzierten anwendbar. Jedoch beschreibt diese Einschränkung auch die Bedeutung dieser Methode in Bezug auf seinem Gebiet und zu den bestehenden Methoden. Darüber hinaus angehende Hefezellen können ein Problem für die Ermittler, die wollen nur übergeordnete Zellgrößen Messen präsentieren. Dieser Algorithmus ist in der Lage erkennen Knospen als einzigartige Zellen (Abbildung S2A). Erstens kann dies ein Problem sein, wenn die Ermittler in welchem Fall sie Knospe Messungen zu entfernen, oder beide Zellen zu entfernen, wenn sie nicht möchten bestimmt die erkannten Kreis die Knospe ist und die das übergeordnete Element ist. Zweitens kann dadurch ein weiteres Problem Wenn die Knospe als Zelle Körper noch innerhalb der Grenzen der elterlichen Kapsel (Abbildung S2B) erkannt wird in dem Fall der Algorithmus die Knospe in Bezug auf die elterliche Kapsel messen wird. In diesem Beispiel wird jede Zelle gezählt werden, zweimal, weil jede Zelle Körper in zwei Kapseln wohnt. Eines dieser Probleme können leicht angegangen werden, sobald das Protokoll fertig ist. Der letzte Datensatz erscheint wie eine Tabellenkalkulation erkannt wo jeder einzelne Zelle ist mit der Bezeichnung nach der Image-Datei aus, und die x und y-Koordinaten der Zellkörper (Abbildung S3). Ermittler können einfach finden und die Daten, die die Knospe entspricht ausschließen. Trotz Kapsel Größe wird eine wichtige und stark studierte Virulenzfaktor Cryptococcus -Bereich bisher noch Standardprotokolle für Kapsel Messung oder Bild Erwerb zu etablieren. Diese Technik wurde entwickelt, um eine präzise und komfortable Art und Weise frei verfügbar für Labors mit minimalen Voraussetzungen diese Rollen ausfüllen.
Zukünftige Anwendungen dieser Technik sind weitgehend auf andere Experimente anwenden. Alle Image-basierte Erkennung oder Messung von kreisförmigen Objekten sollte durch diesen Algorithmus analysierbar. Fluoreszenz-Mikroskopie-Bilder können durch Anwendung des Algorithmus zu einzelnen Laserkanäle analysiert werden. Bakterielle Koloniezahlbestimmung erreicht werden kann, und mit zusätzlichen Modifikationen konnte unterscheiden zwischen Galaktose Reporter. Hefe-Kolonie-Wachstum-Assays konnte auch ausgewertet werden, mit diesem Algorithmus, um Kolonie Bereichsgröße zu schätzen.

Cryptococcus Neoformans ist eine Pathogene Hefe gefunden ubiquitär rund um den Globus, der menschliche Krankheit in erster Linie bei immunsupprimierten Populationen zugeordnet ist. C. Neoformans macht vor allem eine wesentliche Ursache der Gesamtzahl der jährlichen Todesfälle im subsaharischen Afrika aufgrund von Infektionskrankheiten1. Die großen klinische Manifestation der Cryptococcus-Infektion ist Meningoenzephalitis, die Invasion des zentralen Nervensystems mit Verkehrsmitteln in infizierten Makrophagen (Trojanisches Pferd Weise) folgt oder direkte Kreuzung der Blut - Hirn-Schranke. C. Neoformans drückt verschiedene Virulenzfaktoren, einschließlich der Fähigkeit, an der Temperatur des menschlichen Körpers, Urease-Aktivität, Melanization und Bildung eines Polysaccharid Kapsel2zu replizieren. Die Polysaccharid-Kapsel besteht aus Glucuronoxylomannan und Glucoronoxylomannangalactan Polymeren und Funktionen als Schutzbarriere gegen Faktoren wie Umweltbelastung und Host Immunantworten2zu wiederholen.
Obwohl die Größe der Cryptococcus Polysaccharid Kapsel nicht konsequent Virulenz zugeordnet wurde, gibt es Hinweise darauf, dass es ein Faktor bei der Pathogenese2,3,4,5, 6,7. Kapsel Größe Meningitis Pathologie6zugeordnet ist, kann Makrophagen Möglichkeit Cryptococcus -Infektion5Steuern beeinflussen und wenn abwesend8Verlust der Virulenz führen kann. Folglich, Kapsel Größenmessungen sind häufig in der Cryptococcus Forschung jedoch gibt es keine Fieldwide für eine Kapsel Messmethode.
Derzeit, C. Neoformans Polysaccharid Kapsel Messung basiert auf manuelle Messungen von Mikroskopie-Bildern, und die genauen Methoden der Übernahmen von Bild und Messung unterschiedlich Labors9,10, 11. Ein unmittelbares Anliegen dieser Methode ist, dass einige Studien den Erwerb von Tausenden von Einzelmessungen, der was die Genauigkeit und Zuverlässigkeit erschwert. Außerdem, auch wenn die Ergebnisse veröffentlicht werden, gibt es oft unzureichende Beschreibung des Messverfahrens. Viele Publikationen nicht erklären, wie ihre Messungen gewonnen wurden, welche Brennebene verwendet wurde, wie sie den Schwellenwert für die Kapsel Identifikation bestimmt, ob sie Radius oder Durchmesser, verwendet, ob sie eine Messung oder im Durchschnitt mehrere oder andere Details. Einige Publikationen einzige Staat ihre Methode als welches Programm verwendet wurde, z. B. "Adobe Photoshop CS3 diente, die Zellen zu messen"11. Dieser Mangel an Standardisierung und reporting-Detail kann Reproduzierbarkeit schwierig wenn nicht gar unmöglich machen. Unterschiede in der menschlichen Sehvermögen, Computer Helligkeit, Mikroskop-Einstellungen, schieben Sie Beleuchtung und andere Faktoren können variieren zwischen Einzelpersonen, aber auch zwischen Proben, während Berechnungen anhand der Kennzahlen der Pixelwerte Intensität konstant bleibt und zwischen Proben anwendbar. Diese Technik wurde im Zusammenhang mit der Bereitstellung einer standardisierten, genauen, schnelle und einfachen Technik um Kapseln Größen für ein Feld zu messen, in denen gab es vorher keine, generiert.
Wie bereits erwähnt der CHT-Algorithmus ist seit langem etablierte und Skripts zur automatischen Erkennung Kreise vor geschrieben worden. Diese Methode verbessert in zwei Bereichen, wo andere Skripte kurz fallen würde. Erstens ist einfach Kreise erkennen nicht genug, da zwei verschiedene Kreise mit Cryptococcus Zellen zueinander erkannt werden müssen. Diese Methode speziell erkennt Zellkörper in Kapseln, unterscheidet zwischen den beiden und Berechnungen nur auf die entsprechenden Körper-Kapsel-Paare. Zweitens erworben auch als Anschluss an das gleiche Protokoll, verschiedenen Forschern mit verschiedenen landet Bilder. Dadurch, dass die Ermittler Kontrolle über jeden Algorithmus-Parameter, kann dieses Tool auf verschiedenste Akquisemethoden angepasst werden. Es gibt keine Notwendigkeit für eine standardisierte Umfang, Zielsetzung, Filter und So weiter.
Diese Technik kann leicht auf jede Situation angewendet werden, in denen der Prüfer Kreise innerhalb eines Bildes, dass Kontrast mit ihrer Herkunft zu erkennen muss. Beide Kreise heller und dunkler als ihre Hintergrund erkannt werden kann, gezählt und gemessen, mit dieser Technik.

<table><tbody><tr><td>India Ink</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 invisible</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 strain</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Python Programming Language</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

Diese Technik soll einen konsistente, präzise und überschaubaren Prozess für eine große Anzahl von Polysaccharid Kapsel Messungen zur Verfügung zu stellen.
Zunächst wird eine Schwelle Bild basierend auf Intensitätswerte eindeutig berechnet für jedes Bild generiert. Dann Kreise basierend auf Kontrast zwischen Objekt und Hintergrund mit dem etablierten Kreis Hough-Transformation (CHT)-Algorithmus erkannt. Schließlich erkannten Zelle Kapseln und Einrichtungen sind je nach Zentrum koordiniert und Radius Größe abgestimmt, und Daten werden dem Benutzer in einer überschaubaren Tabelle exportiert.
Die Vorteile dieser Technik sind einfache, aber wichtige. Erstens, weil diese Berechnungen durch einen Algorithmus anstatt ein Mensch Genauigkeit und Zuverlässigkeit erhöht. Es ist kein Rückgang der Genauigkeit oder Zuverlässigkeit unabhängig davon, wie viele Proben analysiert werden. Zweitens stellt dieser Ansatz eine potenzielle Betriebsanweisung für das Cryptococcus -Feld statt der aktuellen Situation wo Kapsel Messung variiert nach Labor je. Drittens manuelle Kapsel Messungen sind langsam und monoton, ermöglicht Automatisierung schnelle Messungen auf große Zahlen von Hefezellen, die wiederum Hochdurchsatz-Datenanalyse und immer leistungsfähigere Statistiken erleichtert.
Die wesentlichen Einschränkungen dieser Technik stammen wie die Algorithmus-Funktionen. Zuerst wird der Algorithmus nur Kreise erzeugen. Während Cryptococcus -Zellen und ihre Kapseln auf eine kreisförmige Morphologie nehmen, wäre es schwierig, diese Technik auf unrunde Objekterkennung anzuwenden. Zweitens wegen wie Kreisen erkannt werden kann der CHT-Algorithmus enorme Pseudo-Kreise, die basierend auf den äußeren Rändern der mehreren gruppierten Kreise erkennen. Jedoch kann jeder falsch Zellkörpern gefangen innerhalb des Pseudo-Kreises leicht erkannt und aus den daraus resultierenden Datensätzen entfernt.
Diese Technik dient zur Messung der kreisförmigen Polysaccharid-Kapseln Cryptococcus Arten basierend auf Tusche Hellfeld Mikroskopieren; Obwohl es auf angewendet werden könnte basiert anderen Kontrast kreisförmiges Objekt Messungen.

Bilder werden zuerst durch Mikroskopie von Tusche Dias mit einem Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera (Abb. 1A) gewonnen. Es ist wichtig, Zellen getrennt und in ausreichend niedrigen Dichte nicht um das Blickfeld, als auch zu überwältigen, genügend Fleck zu verwenden, um Kontrast zwischen Zellen und Hintergrund zu schaffen haben. Wie im Protokoll erwähnt, variiert die genaue Anzahl der Zellen für ein optimales Bild je nach der Probe, Mikroskop und Ziel verwendet wird. Wichtige Aspekte sind, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht gruppierten oder überlappende sind, dass die Zelle fokale Flugzeuge nicht signifikant unterscheiden, und dass es bedeutende Tusche Flecken deutlich sichtbar im Hintergrund (mindestens 25 % des Feldes). Diese Richtungen erlauben den Algorithmus, um einzigartig zu jedem Bild einen Schwellenwert zu bestimmen, indem man die durchschnittliche Intensität Pixelwert und die Standardabweichung hinzufügen. Alle Pixel mit einem Intensitätswert höher als dieser Grenzwert gilt weiß und mit einer geringeren Intensitätswert gilt als schwarz. Das resultierende Bild ermöglicht eine klare und scharfe Unterscheidung der wo die Kapsel (Abbildung 1B) endet. Der Algorithmus hat dann einen robusten weiß-auf-schwarz-Kontrast basierend Kreis für die Kapsel zu erkennen und das Originalbild bietet einen robuste schwarz-auf-weiß-Kreis für Zellkörper. Eine repräsentative Visualisierung der erkannten Kreise entsteht im Rahmen des Programms (Abbildung 1C). Dies ermöglicht dem Benutzer, schnell durch die verarbeiteten Bilder analysieren und sicherstellen, dass die Ergebnisse korrekt angezeigt werden.
Es ist wichtig, die genaue Protokoll um optimale Bilder zu erwerben. Suboptimale Bildern führen in der Regel aus einem Mangel an Kontrast zwischen Kapsel und Tinte (Abb. 2A). Optimalen Kontrast und Erwerb Parameter variiert je nach Probe, Experiment, Kamera und Mikroskop-Modelle, etc.. Ein optimales Bild gehört zu dem Hefezellen wenn möglich getrennt in den äußeren Rand der Kapsel deutlichen Kontrast zu der Tuschefleck hat und wo Zellkörper ausgerichtet ist, als ein dunkles Band erscheinen die scharf mit dem Hintergrund kontrastiert. Wenn zu viele Zellen in das Blickfeld sind oder wenn der Fleck zu hell ist, werden die Pixelwerte Intensität cluster und das Programm wird möglicherweise nicht in der Lage, verdeutlichend Kapsel Größe (Abbildung 2B) einen Grenzwert festzulegen. Wenn Sub-optimale Bilder verwendet werden kann das Programm Kreise falsche Größen zu erkennen, keine Kreise erkennen oder erkennen mehrere Pseudo-Kreise basierend auf Artefakte im Bild Schwelle (Abbildung 2C).
Erkennung von Zellkörpern stellt ein ähnliches Problem, dass die Zellkörper als einem robusten schwarzen Kreis auf dem weißen Hintergrund der Kapsel visualisiert werden müssen. Dieses Problem wird im Protokoll angesprochen, wenn die gewünschte Brennebene für die Bildaufnahme beschreiben. Die besten Brennebene zu verwenden ist eine in der Zellkörper als dunkle, konzentrierte Band(Abbildung 3)angezeigt wird. Dieses Brennebene ist akzeptabel als Standard, da er die Zelle richtig konzentriert. Dies wurde bestätigt durch die Visualisierung der Zellwand mit Uvitex, einen Chitin-Fleck (Abbildung 3B). Die Uvitex Fleck zeigt deutlich eine gestochen scharfe, konzentriert Zellwand mit schwachem Signal in der Mitte (wo die oberen und unteren Rand der Zellkörper, unscharf befleckt werden würde).
Bei der Entwicklung dieser Methode war es auch wichtig, sicherzustellen, dass kann dieser Algorithmus genau bestimmen, Kapsel und Zellkörper Messungen. Während die repräsentative Kreise in den obigen Abbildungen vielversprechend sind, wurden die tatsächliche Messungen zwischen Computer und menschlichen Messungen verglichen. Wenn das Protokoll genau befolgt und optimale Bilder stammen, der Algorithmus ist genau und zuverlässig (Abb. 4A). Jedoch wenn das Protokoll nicht korrekt befolgt ist und suboptimale Bildern sich aufgrund von schlechten Färbung, Überfüllung oder anderen zuvor genannten Parameter ergeben, der Algorithmus verliert Genauigkeit und kann nicht rekapitulieren menschliche Messungen (Abbildung 4B ). Da diese Technik ursprünglich für eine bestimmte Person entwickelt wurde (Erstautor), eine andere Person wurde gebeten, es zu benutzen, um festzustellen, ob Unterschiede zwischen Färbung und Messung Stile Genauigkeit trotz folgendes Protokoll auswirken würde. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Technik überall anwendbar, solange das Protokoll als Beauftragte (Abb. 4C) folgte. Ebenso kann diese Technik mit jedes Mikroskop erwerben Phase kontrastreiche Bilder der unterschiedliche Musterpräparate Tusche verwendet werden. Um sicherzustellen, dass der Algorithmus korrekt mit anderen Mikroskop-Setups bleibt, die um ein Drittel dieses Experiment wiederholt wurde Ermittler mit einem unterschiedlichen Hellfeld-Mikroskop gekoppelt mit einer Kamera und erkannten Kapsel Durchmesser mit manuell gemessene Kapsel im Vergleich Durchmesser. Kein signifikanter Unterschied wurde zwischen Computer und menschlichen Messungen (Abbildung 4D) beobachtet.
Zu guter Letzt wurden zukünftige Anwendungen dieses Algorithmus im Zusammenhang mit der Fluoreszenz Färbung erkundet. Da Fluoreszenz-Bildgebung noch auf Signal-Rausch-Verhältnis der Pixelwerte Intensität basiert sollte der Algorithmus leicht auf Fluoreszenzbilder anwendbar, solange der Fleck kreisförmig in der Natur ist. Diese Anwendung wurde bestätigt, als der Algorithmus konnte erfolgreich nachweisen, dass Uvitex Zellkörpern aus den zuvor beschriebenen Bildern (Abbildung 5A, 5 b) gebeizt. Benutzer sollten darauf achten, den Algorithmus-Parameter für ihr Experiment zu optimieren, und standardisierte Protokolle sollten in Zukunft für neuen Anwendungen entwickelt werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig1.jpg"> Abbildung 1 : Repräsentative Ergebnisse Bildbereiche optimal erhalten. A. das ursprüngliche Bild von Hellfeld-Mikroskopie eine Tusche Folie erworben. B. die binäre Bild erstellt mit einer Schwelle aus der durchschnittliche Intensität Pixelwert hinzugefügt, um die Standardabweichung berechnet. Alle Werte oberhalb dieser Schwelle gelten weiß und alle folgenden gelten als schwarz. C. eine Visualisierung der Kapseln (grün) und Zellkörper (blau) vom Algorithmus erkannt. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Ergebnisse von einem Bild suboptimal erzielt. A. der ersten Tusche Folie über Hellfeld Mikroskopieren erworben. Uneben und unzureichende Färbung führt zu einem besonders hellen Hintergrund mit Steigungen von Intensität. B. die resultierende binäres Bild, in dem Kapseln aufgrund hoher Hintergrundsignal klar unterschieden werden können. C. mehrere Kapseln sind nicht nachweisbar. Alle Bilder wurden bei 40 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig3.jpg"> Abbildung 3: Detecting Zellkörper. A. Hellfeld Bild der Kapsel an die bevorzugte Brennebene zentriert. B. Uvitex Fluoreszenzbild aus dem Zellkörper an der bevorzugten Brennebene. Bilder wurden bei 100 X Vergrößerung mit 2 x 2 binning erhalten. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig4.jpg"> Abbildung 4: Vergleiche der Ergebnisse für Algorithmus (schwarz) und Mensch (grau) Analysen. A. wenn Folien laut Protokoll vorbereitet sind und optimale Bilder stammen gibt es keinen nennenswerter Unterschied zwischen den Messungen. B. wenn das Protokoll nicht gefolgt ist der Algorithmus nicht genau identifizieren und Kapseln zu messen. Hier entsprach nicht speziell der Hintergrund und es gab Kontrast zwischen Kapseln und Hintergrund nicht klar. Erhebliche Abweichungen über t-Test berechnet wird als gemerkt * für P < 0,05 Werte. C. ein unabhängiger Ermittler wurde gebeten, das Protokoll zu folgen und ihre Analysen mit dem Algorithmus zu vergleichen. Zuverlässigkeit ist über Beobachter aufrechterhalten, solange die Bilder richtig erworben werden. D. Eine zweite unabhängige Ermittler mit einem zweiten Mikroskop wurde verwendet, um zu bestätigen, dass der Algorithmus Genauigkeit über Einzelpersonen und Hardware behält. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56957/56957fig5.jpg"> Abbildung 5 : Eine mögliche alternative Anwendung des Algorithmus: Identifizierung und Messung der Fluoreszenz-Mikroskopie. Zellkörper wurden gebeizt und mit Uvitex abgebildet, dann durch Algorithmus identifiziert. Die erkannten Kreis erstreckt sich vorbei an was als die Zellwand bezeichnet werden würde, denn die Erkennung auf das Fluoreszenzsignal basiert. Der Erkennungsalgorithmus kann zugeschnitten werden speziell die hellsten Anhäufung des Signals (Zellwand) identifizieren durch Ändern der Schwellenwerts zur Erzeugung von der anfänglichen binären Bildes in Zahlen 1 b und 2 bdargestellt. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig1.jpg"> Ergänzende Abbildung1: ein repräsentativer Screenshot der Anwendung in einer Windows-Umgebung ausgeführt. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig2.jpg"> Ergänzende Abbildung2: Darstellungen der erkannten angehende Hefezellen. Maßstabsleiste stellt 10 µm. A. Eine Mutterzelle und Knospe als getrennte Zellen innerhalb ihrer eigenen Kapsel gezählt. B. A Mutterzelle und Bud zählt zweimal, einmal für ihren eigenen Kapsel und einmal für die andere Zelle Kapsel, wodurch insgesamt vier Zellen aus einem Elternteil und eine Knospe erkannt. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/56957/56957supfig3.jpg"> Ergänzende Abbildung 3: eine Darstellung der endgültigen Angaben nach Zelle Erkennung und Messung. Image-Datei verweist auf den Namen des ursprünglichen Bildes. Gesamtradius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen grüne Kreise, Kapsel und Zellkörper kombiniert. Kapsel x und y Kapsel beziehen sich auf die Koordinaten der Kapsel, wofür diese Daten zu gelten. Körper-Radius bezieht sich auf den Radius der repräsentativen blaue Kreise. Kapsel Radius bezieht sich auf den Gesamtradius abzüglich der Körper Radius, was im Umkreis von nur die Kapsel. Diese Werte werden in Mikron, solange der Benutzer eine Pixel-µm-Umtauschverhältnis in Schritt 3.2.5 enthalten. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56957/56957supfig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.2K Aufrufe.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. Dieses Verfahren beschreibt eine automatisierte Batch-Bildprozessor Polysaccharid Kapsel und Körper Radien messen soll. Während ursprünglich für Cryptococcus Neoformans Kapsel Messungen entwickelt, die automatisierte Bildverarbeitung auch auf andere Grundlage Kontrasterkennung kreisförmigen Objekte angewendet werden kann.

Serie: Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

Forschung

Genetik

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

Biochemie

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Biotechnik

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protokoll zur Co-Kultivierung von Saccharose-sezernierenden Cyanobakterien mit Pilzpartnern

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Automatisierte Messung von Cryptococcus Arten Polysaccharid-Kapsel und Zellkörper

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Trennung von Bakterien durch Kapsel Betrag mittels einer diskontinuierlichen Dichtegradienten

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Quantitative Metabolomik von Saccharomyces Cerevisiae mittels Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie

Size Matters: Messung des Durchmessers der Kapsel in Cryptococcus neoformans

Automatisierung von Bio-Rasterkraftmikroskop-Messungen an Hunderten von C. albicans-Zellen

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren

Assemblierung und Quantifizierung von Co-Kulturen, die heterotrophe Hefe mit phototrophen zuckersezernierenden Cyanobakterien kombinieren