Wir danken Dr. Iain Drummond und Dr. Vladimir Korzh für den Austausch von Nieren-GFP-transgenen Linien. Wir danken auch NYITCOM für die Bereitstellung notwendiger Ressourcen für diese Arbeit. Diese Studie wurde teilweise durch Stipendien unterstützt: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) und der HSCI Pilot Grant (AV).

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labor-Tiere der National Institutes of Health durchgeführt. Das Protokoll wurde von der NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care und Use Committee (NYITCOM IACUC) genehmigt. Alle Operationen und In-vivo- Experimente wurden unter Trikose Anästhesie durchgeführt, und alle Anstrengungen wurden gemacht, um Leiden zu minimieren. 1. Erhalt und Erhaltung von Embryonen <ol><li> Erhalten Sie Embryonen durch Überqueren der Niere GFP fluoreszierenden Zebrafisch. HINWEIS: Beispiele für fluoreszenzmarkierte Zebrafisch-transgene Linien sind in Tabelle 1 aufgelistet. </li><li> Halten Sie die Embryonen bei 28,5 ° C in E3-Lösung während der 24-stündigen Nachdüngung. </li><li> Nach 24 h ersetzen Sie das Medium durch eine E3-Lösung, die 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) enthält. HINWEIS: PTU wird verwendet, weil es die Tyrosinase-abhängigen Schritte in der Melanogenese blockiertUnd verhindert daher eine Pigmentierung. Hier wird diese Lösung als E3-PTU bezeichnet. </li><li> Heben Sie die befruchteten Embryonen bei 28,5 ° C an, bis sie&gt; 6 dpf sind, an welcher Stelle die Nieren gereift sind. HINWEIS: Es ist am besten, Larven im 7-9 dpf Fenster zu benutzen. </li><li> Mit einem fluoreszierenden Seziermikroskop bei 40facher Vergrößerung und grünen Fluoreszenzemissionsfiltern wählen Sie die Larven mit heller Nieren-GFP-Fluoreszenz aus. </li></ol> 2. Montage der Zebrafisch für Live-Imaging <ol><li> Wenn Sie die Embryonen vor 3 dpf fotografieren, entfernen Sie das Chorion aus irgendeinem ungehärteten Zebrafisch, bevor Sie den Zebrafisch für die Bildgebung anbringen. <ol><li> Manuell mit Pinzette dehydrieren (bevorzugt) oder eine chemische Behandlung mit einer Protease-Mischung verwenden. HINWEIS: Die Dechorierung ermöglicht die besten Bilderzeugung. </li></ol></li><li> Die Chorion-Trümmer in der Petrischale mit E3-PTU-Lösung ausspülen und die Schale mit E3-PTU nachfüllen. </li><li> PrepaRe 1-2% Low-Melting Point (LMP) Agarose mit 0,2 mg / ml Tricain-Lösung zur Befestigung der Zebrafisch für Nieren-Photoablation und Live-Imaging. <ol><li> Wenn LMP-Agarose bereits vorher vorbereitet wurde, heizen Sie es in der Mikrowelle auf, um es zu schmelzen. </li></ol></li><li> Sobald die LMP-Agarose vorbereitet ist, legen Sie eine 35 mm Plastik-Petrischale auf ein Sektions-Mikroskop. Legen Sie eine gezogene Glassonde in die Nähe, um die anästhesierten Larven richtig auszurichten. HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt rechtzeitig zu machen und alles zu haben, denn die Embryonen müssen sich orientieren, bevor die Agarose in ca. 1-3 min erstarrt. </li><li> Vor der Übertragung des Embryos auf die Agarose ist darauf zu achten, dass die Agarose kühl ist ( dh bei Körpertemperatur). Verwenden Sie eine Plastik- oder Glasübertragungspipette, um den Embryo in die abgekühlte geschmolzene Agarose-Tricain-Lösung zu legen. HINWEIS: Dies geschieht, weil Agarose, die zu heiß ist, kann schädlich für den Embryo, was zu HerzstillstandOder Tod </li><li> Mit einer Transferpipette den Embryo in die Agarose-Lösung umreißen und den Embryo / Larve in der Mitte einer 35-mm-Schale positionieren. </li><li> Die Agarose, die den Embryo / Larve enthält, schnell ausbreiten, um den Boden der 35 mm Schale gleichmäßig zu bedecken; Das beste Volumen der Agarose zu verwenden ist ~ 1-1.1 ml. </li><li> Verwenden Sie die Glassonde, um den Embryo in der bestmöglichen Position für die Photoablation und die Bildgebung zu orientieren. HINWEIS: Film 1 zeigt die beste Orientierung des Embryos / der Larve für die einseitige Photoablation. Dieser Schritt ist der zeitempfindlichste und sollte schnell durchgeführt werden, bevor die Agarose anfängt zu gelieren, da jeder Versuch, den Fisch nach dem Gelieren neu zu orientieren, schädlich ist. <ol><li> Orientieren Sie die Larve so, dass das interessierende Nierensegment senkrecht zum Strahlengang ist, während das kontralaterale Segment vom Laserstrahl entfernt ist (siehe Film 1 ). HINWEIS: Dies kann durch Drehen der Larve erreicht werden, wie in Film 1 gezeigt . </lI&gt; </ol></li><li> Erlauben Sie etwa 15 min für die Agarose zu verfestigen. Decken Sie die Petrischale ab, um die Verdunstung zu minimieren. Sobald die Agarose erstarrt ist, ist der Embryo oder die Larve bereit für die Photoablation. </li></ol> 3. Laserablation <ol><li> Betreiben Sie das konfokale Abbildungssystem. HINWEIS: Bei Verwendung der referenzierten Imaging-Plattform (siehe Tabelle der Materialien) sind die empfohlenen Einstellungen 40-fache Vergrößerung, eine 0,8 NA-Wasser-Tauchlinse und der erste dichroitische Spiegelsatz, der sowohl eine 488- als auch eine 405-nm-Beleuchtung der Probe ermöglicht. Die Erkennung sollte auf dem grünen Kanal erfolgen. </li><li> Positioniere die Schale mit dem immobilisierten Zebrafisch auf einer konfokalen Bühne. HINWEIS: Diese Vorgehensweise ist für die aufrechte Konfiguration mit einem 40-60X Wasser-Tauchobjektiv optimiert. Es sollte jedoch möglich sein, die Prozedur für ein invertiertes Mikroskop zu modifizieren. </li><li> In der aufrechten Konfiguration positionieren Sie die Petrischale, die den Embryo auf einer Mikroskopie enthältOpe schieben und halten sie mit dem Modellieren von Ton ( zB Plastilin). Positionieren Sie die Glasrutsche mit der Petrischale auf die Bühne des konfokalen Mikroskops. </li><li> Füge 3 ml der Imaging-Lösung E3-PTU (siehe Schritt 1.3) mit 0,2 mg / ml Tricain hinzu. HINWEIS: Die bildgebende Lösung kann auch sofort vor dem Einlegen der Folie auf die Bühne aufgenommen werden. Der Zusatz von Imaging-Lösung sollte sehr sorgfältig durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die Agarose aus dem Boden der Schale schwebt. </li><li> Umschalten auf die Wasser-Tauchlinse (40 oder 60X). Langsam heben Sie die Bühne an und stellen Sie sicher, dass das Objektiv leicht abgewinkelt ist, um zu verhindern, dass Luft im Strahlengang eingefangen wird. Sobald das Objektiv die Lösung in einem Winkel berührt, zentrieren Sie es so, dass es im Blickfeld der Embryonen ist. </li><li> Finden Sie das Segment des Interesses mit der Fluoreszenz-Lichtquelle. Oberflächlich positionieren Sie den Zweig, der auf Verletzungen gerichtet ist, um die Lichtstreuung zu minimieren (siehe Film 1 ). HINWEIS: Die UntersequenzT Schritte verwenden von referenzierten Software (siehe die Tabelle der Materialien), aber die Prozedur kann leicht an andere Plattformen angepasst werden. </li><li> Öffnen Sie die Software. Navigieren Sie zu &quot;View&quot; &quot;Akquisitionssteuerung&quot; &quot;C2plus Compact GUI&quot; und setzt die &quot;Pixel-Verweilzeit&quot; auf &quot;1,9 μs&quot;, &quot;Frame Size&quot; auf &quot;512 x 512 Pixel&quot; und &quot;Pinhole Size&quot; auf &quot;90 μm&quot;. Set &quot;405 nm (oder 408 nm in einigen Systemen) Laserintensität&quot; auf Null und &quot;488 Laserintensität&quot; bis &quot;niedrig&quot; (vorzugsweise &lt;1%). Stellen Sie die &quot;Verstärkung&quot; ein, um einen guten Dynamikbereich zu erhalten, aber nicht das Signal zu sättigen. HINWEIS: Diese Werte sind nicht kritisch und werden für Konsistenz verwendet. Wenn ein 405 nm Laser verwendet wird, führt dies zu einer Erhöhung der GFP-Fluoreszenz. Um die Sättigung des Signals während des Photobleichens zu vermeiden (Schritt 3.11), sollte der Signalverstärkungswert auf dem grünen Kanal verkleinert werden. Die blaue Kanalverstärkung kann bei Null bleiben, da sie nicht für sa verwendet wirdMischen </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan&quot; in der Software-Schnittstelle, um die Niere mit einem 488-nm-Laser zu scannen. Finden Sie das Segment des Interesses, das senkrecht zum Strahlengang ist und das ist gut visualisiert, mit guter GFP-Fluoreszenz. Sobald diese Region identifiziert wurde, ziehen Sie eine Region von Interesse mit einem elliptischen Region-of-Interest (ROI). <ol><li> Navigieren Sie zu &quot;ROI&quot; &quot;Elliptischer ROI zeichnen&quot;. HINWEIS: Dies wird verwendet, um die durchschnittliche GFP-Intensität kontinuierlich zu messen, während das Photobleichen stattfindet, was die Verabreichung einer genauen Dosis der Laserbehandlung ermöglicht. </li></ol></li><li> Navigieren Sie zu &quot;View&quot; &quot;Akquisitionskontrollen&quot; &quot;C2plus Scan Area&quot; und wählen Sie &quot;Band Scan Area&quot;. Die rechteckige Maske erscheint innerhalb dieser Schnittstelle. Manuelles Definieren eines rechteckigen Scanfensters mit dem Cursor ( z. B. Ziehen, Verkleinern und Drehen der Maske), um das für die Laserablation gezielte Segment zu decken. Klicken Sie mit der rechten Maustaste in dieMaskenbereich, um die Auswahl zu akzeptieren. HINWEIS: Nur die ausgewählte Region wird gescannt. </li><li> Beginnen Sie die Zeitmessung bei der Überwachung des grünen Kanals mit nur dem 488 nm Laser, um GFP zu aktivieren. Stellen Sie sicher, dass die Intensität des 488-Lasers relativ niedrig ist (~ 1%). Messen Sie die durchschnittliche Intensität des GFP im interessierenden Bereich, indem Sie &quot;Messen&quot; wählen &quot;Zeitmessung&quot;. Verwenden Sie die Registerkarten &quot;Graph&quot; oder &quot;Data&quot;, um die durchschnittlichen Intensitätswerte im ROI zu überwachen. HINWEIS: Die Erfassungsrate wird durch die Pixelverweilzeit und die Größe des in Schritt 3.9 eingestellten rechteckigen Fensters festgelegt, aber im allgemeinen ermöglicht es die schnelle Überwachung des Signals (~ 2-10 Frames / s). </li><li> Induzieren Schädigung der Nierenzellen mit dem violetten Laser (405 nm) durch Erhöhung der Intensität auf 100% durch Schieben der &quot;Laser Power&quot; Kontrolle ganz nach rechts. Der 488-nm-Laser kann aktiv bleiben, wenn die Intensität niedrig ist. <ol><li> Beobachtung einer Linie gRaph mit der Registerkarte &quot;Graph&quot; oder den numerischen Werten der GFP-Intensität über die Registerkarte &quot;Data&quot; und warten, bis sie auf ein gewünschtes Level fällt, zB 50% der Baseline (wie in Abbildung 1 gezeigt ). HINWEIS: Ein 20-mW-Laser wurde als Teil der referenzierten Lasereinheit verwendet (siehe Tabelle der Materialien ); Die maximale Intensität kann zwischen den Systemen variieren. Eine geringere Intensität kann durch eine längere Exposition kompensiert werden ( dh mit prozentualer GFP-Bleiche als Maß für die Gesamtbelastung). </li></ol></li><li> Sobald die GFP-Intensität innerhalb des elliptischen ROI (Schritt 3.8) auf ein gewünschtes Niveau gefallen ist, verringern Sie sofort die Intensität des violetten (405 nm) Lasers auf &quot;0&quot;, indem Sie den Schieberegler &quot;Laserleistung&quot; ganz nach links bewegen Das Software-Bedienfeld. <ol><li> Erhalten Sie eine neue Grundlinie der GFP-Fluoreszenz. Bestätigen Sie die Ablation, indem Sie ein Verhältnis von X / Y erhalten. HINWEIS: Siehe Abbildung1B; Y = mittlere Intensität vor der Ablation und X = mittlere Intensität nach der Ablation unter Verwendung von durchschnittlich 4 aufeinanderfolgenden Proben innerhalb des ROI. Das genaue Zielverhältnis (50%, 60%, etc. ) hängt von der Verletzungsmenge ab, die für ein gegebenes Experiment gewünscht wird. </li></ol></li></ol> 4. Zeitraffer-Mikroskopie mit Propidium-Iodid-Färbung <ol><li> Bewerben Sie allgemeine Zeitrafferbetrachtungen (in einer früheren Studie 15 skizziert), um die Propidiumjodidfärbung als Korrelat der Nierenzellverletzung nach der Photoablation zu visualisieren. </li><li> Vor der Inkubation der Larven in 30 μM Propidiumjodidlösung (1% DMSO in E3-PTU) für 3 h vor der Einbettung und Photoablation, wie in den Schritten 2 und 3,7 beschrieben. HINWEIS: In der Agarose oder der Imaging-Lösung ist kein zusätzliches Propidiumjodid erforderlich. </li><li> Induzieren segmentale Nierenverletzung, wie in den Schritten 3.1-3.12 beschrieben. </li><li> Erhalten Sie Zeitraffer-Bildstapel, als descriBett in einer früheren Studie 14 , unter Verwendung eines 488 nm Lasers (GFP) und eines 461 nm Laser (Propidium Iodid, PI). HINWEIS: Die beiden Farben werden in konfokalen Stapeln überlagert, um das Verschwinden von GFP und das Auftreten von Propidiumjodidfärbung zu korrelieren. </li><li> Setzen Sie die Parameter für das Erhalten der Zeitraffer-Bildstapel wie folgt: virtuelle Scheibendicke = 4 μm, z-Stapelintervall = 2 μm, Pixelverweilzeit = 1,9 μs, Bildmaße = 512 x 512 und Mittelwertbildung = 2. HINWEIS: Diese Parameter erlauben eine kontinuierliche, 10- bis 15-minütige Intervallaufnahme von bis zu 4 Larven und sorgen für eine minimale Photobleichung der Probe. </li><li> Verwenden Sie Imaging-Software, die mit dem Aufzeichnungsdateiformat kompatibel ist, um die Daten zu visualisieren und zu analysieren. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Es ist zu beachten, dass die gesamte Laserleistung zwischen den Systemen variiert. Jedoch ermöglicht die Verwendung von Prozent-GFP-Photobleichen ein Auslesen der Gesamtenergie, die an die fluoreszierende Niere abgegeben wird, unabhängig von der Änderung der Laserleistung und kompensiert durch die Belichtungsdauer. Denken Sie jedoch daran, dass die Reaktion der verschiedenen Gewebe auf diese Methode der Photoablation variiert. Auch bei der Nierenreifung ist es wesentlich schwieriger, eine 50% ige Reduktion der GFP-Fl...

Akute Nierenverletzung (AKI) 1 , 2 , die auch als akutes Nierenversagen bezeichnet werden kann, ist weitgehend als plötzliche Beeinträchtigung der Nierenfunktion definiert 3 . Während das Niveau des Verständnisses dieser Bedingung im Laufe der Jahre bemerkenswert verbessert wurde, blieben die Morbiditäts- und Sterblichkeitsraten hoch 1 , 2 . Die derzeitige Behandlung für diese Bedingung ist meist unterstützend, da die Ergebnisse aus mehreren klinischen Studien der medikamentösen Therapie negativ waren 4 , 5 . Die Niere ist einzigartig darin, dass sie die Fähigkeit hat, sich selbst zu reparieren. Daher ist die unterstützende Therapie nach einer frühen Diagnose von AKI der beste Weg, um die Morbidität zu begrenzen 6 . Allerdings ist es schwierig, AKI frühzeitig zu erkennen, und die Sterblichkeit ist eine Staffelung von 50-80% für diejenigen, die Dialyse benötigen 5. Mit der Fähigkeit der Nieren, sich selbst zu reparieren und die Mangel an Behandlungsmöglichkeiten für diese Bedingung, ist es wichtig, Methoden zu entwickeln, um diese Nephron-Regeneration zu verbessern. Es gab viele verschiedene Modelle für AKI-Forschung, die verschiedene Agenten der Verletzung und Tier-Modelle enthält verwendet. In Bezug auf Agenten der Nierenschädigung wurde das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin als nephrotoxisches Mittel verwendet, das zu AKI 7 , 8 führt . Allerdings haben mehrere Gruppen festgestellt, dass Gentamicin Behandlung ist tödlich für die Zebrafisch Embryo 9 . Es verursacht Schlauchschäden, die für die Embryo-Erholung zu ernst sind, was das Studium der Regeneration ohne irgendeine Art von Intervention schwierig macht. Säugetiermodelle, wie die Maus und die Ratte, werden auch als wertvoll angesehen, aber sie stehen vor vielen Einschränkungen während des Studiums von AKI. Vielleicht ist der Hauptnachteil von Nagetiermodellen die Schwierigkeit in VisuaDie Nagetierniere zu verteilen und so die präzisen räumlich-zeitlichen Prozesse zu bestimmen, die zu epithelialem Tod und Reparatur führen. Johnson et al. Haben eine Laserablations-basierte Technik berichtet, um eine akute Nierenverletzung in embryonalen und larvalen Zebrafisch zu induzieren 9 . Sie verwendeten gepulste Laserablation, um die Niere nach einer intramuskulären Injektion mit Dextran-Konjugaten zu beschädigen. Die Fluoreszenz von Dextran-Konjugaten ermöglicht die Visualisierung von Schädigung und Regeneration im Tubulusepithel 9 . Dieses Modell überwindet die beiden oben erwähnten Einschränkungen, erlaubt aber keine abgestuften Verletzungsstörungen und ist bei großen, willkürlichen Zellgruppen schwer durchführbar. Das hier beschriebene neue Laserablations-basierte Zebrafisch-Modell von AKI adressiert alle oben genannten Einschränkungen. Die pronephrische Niere im Larven-Zebrafisch ist ein reifes, funktionierendes Organ, das Segmente ähnlich dem Säugetier ne enthältPhron, einschließlich eines Glomerulus, proximalen und distalen Tubuli, und einem Sammelkanal 10 . Zebrafisch-Larven sind auch optisch transparent, so dass es möglich ist, die Niere durch Fluoreszenztechniken zu beobachten. So ist Zebrafisch ein wertvolles In-vivo- Modell von AKI, und die Larven-pronephrische Niere (5-12 Tage nach der Befruchtung (dpf)) kann verwendet werden, um die zellulären und molekularen Prozesse, die an Nierenverletzungen und Reparaturen beteiligt sind, zu untersuchen. Dieses Papier stellt eine Methode dar, durch die spezifische Green Fluorescent Protein (GFP) -exprimierende Nephronsegmente unter Verwendung einer Niedrigenergie (im Vergleich zu einem gepulsten Lasersystem) violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden können. Die GFP-Fluoreszenz ermöglicht das Targeting einer Gruppe von Zellen, wodurch die Veränderungen entstehen, die durch die Beobachtung von GFP-Photobleichen sichtbar werden. Darüber hinaus dient GFP (durch Absorption von violettem Licht) als Energiesenke, um die Verletzung in GFP-exprimierenden Nierenzellen zu verstärken. Zeitraffer-MikrosKopie kann dann verwendet werden, um den Reparaturprozess zu studieren. Studien haben Zellproliferation, Zellmigration und Zellmetaplasie 11 , 12 , 13 gefunden, um alle mögliche Prozesse, die eine wichtige Rolle bei der Nierenreparatur spielen können. Allerdings ist die relative Bedeutung dieser Prozesse und die Details ihres Zusammenspiels aufgrund der Einschränkungen bestehender AKI-Modelle schwer aufzudecken. Mit diesem neuartigen Ansatz konnte gezeigt werden, dass die Zellmigration eine zentrale Rolle bei der Nierenreparatur nach akuten Verletzungen spielt. 14

<table><tbody><tr><td>Petri Dishes, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Procedural Usage: Step 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Petri Dishes, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Procedural Usage: Step 1</td></tr><tr><td>Dechorination forceps - Electron Microscopy Sciences Dumont Tweezers 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Procedural Usage: Step 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastic Transfer Pipet</td><td>Globe Scientific</td><td>135030</td><td>Procedural Usage: Step 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Procedural Usage: Step 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Procedural Usage: Step 2.3</td></tr><tr><td>Pulled glass probe (manufactured manually from glass capillary tubes)</td><td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Procedural Usage: Step 2.4</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Procedural Usage: Step 1.5</td></tr><tr><td>Eclipse C2 Plus Confocal Microscope System</td><td>Nikon</td><td></td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>1x E3 Solution</td><td></td><td></td><td>Recipe used to generate: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; , 0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; Procedural Step Usage: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Procedural Step Usage: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>NIS Elements Software</td><td>Nikon</td><td>C2+</td><td>Procedural Usage: Step 3</td></tr><tr><td>Laser Unit</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Procedural Step 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Procedural Step Usage: 4.2</td></tr></tbody></table>

precise cellular ablation approach for modeling acute kidney injury in developing zebrafish

Akute Nierenverletzung (AKI) ist eine häufige Erkrankung mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Mit den Reparaturfähigkeiten der Niere ist es möglich, eine adäquate Nierenfunktion nach einer unterstützenden Behandlung wiederherzustellen. Jedoch ist ein besseres Verständnis davon, wie Nephron-Zelltod und -reparatur auf zellulärer Ebene stattfinden, erforderlich, um den Zelltod zu minimieren und den regenerativen Prozess zu verbessern. Der Zebrafisch pronephros ist ein gutes Modellsystem, um dieses Ziel zu erreichen, weil es anatomische Segmente enthält, die dem Säugetier-Nephron ähnlich sind. Bisher war das häufigste Modell, das verwendet wurde, um Nierenverletzungen bei Fischen zu untersuchen, das pharmakologische Gentamicin-Modell. Allerdings erlaubt dieses Modell keine präzise räumlich-zeitliche Kontrolle der Verletzung, und daher ist es schwierig, zelluläre und molekulare Prozesse zu untersuchen, die an der Nierenreparatur beteiligt sind. Um diese Einschränkung zu überwinden, stellt diese Arbeit eine Methode dar, durch die im Gegensatz zum Gentamicin-Ansatz ein spezifisches Green Fuorescent Protein (GFP) -exPress-Nephron-Segment kann mit einem violetten Laserlicht (405 nm) fotografiert werden. Dieses neuartige Modell von AKI bietet viele Vorteile, die andere Methoden der Epithelverletzung fehlen. Seine Hauptvorteile sind die Fähigkeit, das Verletzungsniveau und die präzise räumlich-zeitliche Kontrolle im robusten In-vivo- Tiermodell zu &quot;wählen&quot;. Diese neue Methode hat das Potenzial, das Niveau des Verständnisses von Nierenverletzungen und Reparaturmechanismen deutlich zu verbessern.

Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll erfolgreich mit einer Anzahl von Nieren-GFP-transgenen Linien verwendet wurde, einschließlich ET (krt8: EGFP) sqet11-9, ET (krt8: EGFP) sqet33-d10 und Tg (atp1a1a.4: GFP). Die hier gezeigten Beispielergebnisse wurden unter Verwendung der ET (krt8: EGFP) sqet11-9 Linie erhalten. Abbildung 1 zeigt das Beispiel-Photoablationsprotokoll. Die durchschnittliche ...

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Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Diese Arbeit präsentiert ein neues in vivo Modell der segmentalen Nierenverletzung mit Nieren GFP transgenen Zebrafisch. Das Modell ermöglicht die Induktion der gezielten Ablation von Nierenepithelzellen, um die zellulären Mechanismen der Nephronverletzung und Reparatur zu zeigen.

Präziser zellulärer Ablationsansatz zur Modellierung akuter Nierenverletzungen bei der Entwicklung von Zebrafisch

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.6K Aufrufe.  NYITCOM.  Diese Arbeit präsentiert ein neues in vivo Modell der segmentalen Nierenverletzung mit Nieren GFP transgenen Zebrafisch. Das Modell ermöglicht die Induktion der gezielten Ablation von Nierenepithelzellen, um die zellulären Mechanismen der Nephronverletzung und Reparatur zu zeigen. 

Serie: Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

Mechanische Gefäßverletzung in Zebrafischembryonen

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Biologie

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Die Transplantation von Zellen direkt in die Niere von Adult Zebrafisch

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Laser Ablation of the Zebrafish Pronephros to Study Renal Epithelial Regeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in renal failure1. AKI can be caused by a number of factors including ischemia, drug-based toxicity, or obstructive injury1. This results in an inability to maintain fluid and electrolyte homeostasis. While AKI has been observed for decades, effective clinical therapies have yet to be developed. Intriguingly, some patients with AKI recover renal functions over time, a mysterious phenomenon that has been only rudimentally characterized1,2. Research using mammalian models of AKI has shown that ischemic or nephrotoxin-injured kidneys experience epithelial cell death in nephron tubules1,2, the functional units of the kidney that are made up of a series of specialized regions (segments) of epithelial cell types3. Within nephrons, epithelial cell death is highest in proximal tubule cells. There is evidence that suggests cell destruction is followed by dedifferentiation, proliferation, and migration of surrounding epithelial cells, which can regenerate the nephron entirely1,2. However, there are many unanswered questions about the mechanisms of renal epithelial regeneration, ranging from the signals that modulate these events to reasons for the wide variation of abilities among humans to regenerate injured kidneys.
The larval zebrafish provides an excellent model to study kidney epithelial regeneration as its pronephric kidney is comprised of nephrons that are conserved with higher vertebrates including mammals4,5. The nephrons of zebrafish larvae can be visualized with fluorescence techniques because of the relative transparency of the young zebrafish6. This provides a unique opportunity to image cell and molecular changes in real-time, in contrast to mammalian models where nephrons are inaccessible because the kidneys are structurally complex systems internalized within the animal. Recent studies have employed the aminoglycoside gentamicin as a toxic causative agent for study of AKI and subsequent renal failure: gentamicin and other antibiotics have been shown to cause AKI in humans, and researchers have formulated methods to use this agent to trigger kidney damage in zebrafish7,8. However, the effects of aminoglycoside toxicity in zebrafish larvae are catastrophic and lethal, which presents a difficulty when studying epithelial regeneration and function over time. Our method presents the use of targeted cell ablation as a novel tool for the study of epithelial injury in zebrafish. Laser ablation gives researchers the ability to induce cell death in a limited population of cells. Varying areas of cells can be targeted based on morphological location, function, or even expression of a particular cellular phenotype. Thus, laser ablation will increase the specificity of what researchers can study, and can be a powerful new approach to shed light on the mechanisms of renal epithelial regeneration. This protocol can be broadly applied to target cell populations in other organs in the zebrafish embryo to study injury and regeneration in any number of contexts of interest.

Acute kidney injury (AKI) in humans is a common clinical problem caused by damage to the epithelial cells that comprise kidney nephrons, and AKI is associated with high mortality rates of 50-70%1. Following epithelial cell destruction, nephrons have a limited ability to regenerate, though the mechanisms and limitations that guide this phenomenon remain poorly understood. In this video article, we describe our technique for targeted laser ablation of kidney nephron cells in the zebrafish embryo kidney, or pronephros. Our new method can be used to complement nephrotoxicity-induced models of AKI and gain a high-resolution understanding of the cell and molecular alterations that are associated with epithelial regeneration in the kidney nephron.

Laser Ablation des Zebrafisch Vorniere auf Study Renal Epithelregeneration

Acute kidney injury (AKI) is characterized by high mortality rates from deterioration of renal function over a period of hours or days that culminates in ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Akute Nierenverletzung Modell induziert durch Cisplatin bei erwachsenen Zebrafischen

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medizin

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Intravenous Microinjection of Nephrotoxins into Zebrafish Embryo: A Technique to Deliver Nephrotoxic Agents into the Bloodstream of Zebrafish Embryo

Source: McKee, Robert A. et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/54241" target="_blank">Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the intravenous microinjection of nephrotoxins into the tail vein of a zebrafish embryo to study their chemical effects on renal function.

Intravenöse Mikroinjektion von Nephrotoxinen in den Zebrafischembryo: Eine Technik zur Abgabe nephrotoxischer Wirkstoffe in den Blutkreislauf des Zebrafischembryos

Source: McKee, Robert A. et al. Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury. J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the ...