We thank Dr. Frank Wolschendorf for access to the Cytation 3 automated imaging plate reader. This work was funded in part by NIH grant R01-AI104499 to OK. Parts of the work were performed in the UAB CFAR facilities and by the UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, which are funded by NIH/NIAID P30 AI027767 and by NIH 5P30 AR048311.

HINWEIS: M. tuberculosis mc 2 6206 ist ein avirulenten Stamm 17, 18, alle Arbeiten in diesem Protokoll kann in einem Biosafety Level 2 - Anlage (BSL-2) durchgeführt werden. 1. Kulturbedingungen für Green Fluorescent Protein exprimieren M. tuberculosis mc 2 6206 (Mtb -GFP) HINWEIS: Die M. tuberculosis H37Rv - auxotrophe Stamm mc 2 6206 abgeleitet (Δ panCD, Δ leuCD) , transformiert mit dem Plasmid gfp pMN437 exprimierenden 16 in diesem Protokoll verwendet wird. Es ist möglich , die Mtb -GFP Stamm mit nicht - GFP - exprimierenden Wildtyp - Stamm zu ersetzen für Forscher leichter Zugänglichkeit des Stammes zu ermöglichen. Allerdings ist die GFP - Expression wünschenswert visuelle Bestätigung der Phagozytose und die Bildung von Mtb / Makrophagen - Aggregate zu ermöglichen. Für long Zeitlagerung, Mtb -GFP wurden ergänzt mit 20% Glycerin bei -80 ° C in vollständiger 7H9 Medium (in Schritt 1.1 beschrieben) eingefroren. <ol><li> Bereiten vollständige Mtb -GFP Medien (7H9-C) durch Ergänzung 7H9 - Medium mit 10% OADC Middlebrook, 0,02% Tyloxapol, 24 ug / ml D-Pantothensäure, 50 ug / ml L-Leucin und 50 ug / ml Hygromycin B. </li><li> Ein Fläschchen mit Mtb -GFP auftauen und in einem 30 ml quadratischem Boden PETG Kolben auf 10 ml 7H9-C hinzufügen. </li><li> Bei 37 ° C auf einem Rotationsschüttler (50 rpm). Nehmen Sie Messungen der optischen Dichte (OD 600) alle paar Tage , bis die OD 600 erreicht 1,0 (ca. 5-8 Tage). </li><li> Verdünnen und Passage Kultur nach Bedarf eine OD 600 zwischen 0,2 bis 1,0 zu halten. </li><li> Zur Infektion eine etablierte Kultur der Mtb -GFP innerhalb der logarithmischen Wachstumsphase (OD 600 von 0,6-1) verwenden. Um klumpig Kulturen zu vermeiden, beschallen die Mtb Kulturflasche in einem Wasserbad (130 W, 3 x 5 s Pulse) ONCe oder zweimal pro Woche </li></ol> 2. Kulturbedingungen für THP-1-Zellen <ol><li> Bereiten vollständige THP-1-Zellmedium (RPMI-C) von RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 10 mM HEPES ergänzt. </li><li> Inkubiere Zellen in einem T-75 - Kolben bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers oder Durchflusszytometrie jeden zweiten Tag und aufrechtzuerhalten THP-1-Zellen in einer Dichte zwischen 0,1 bis 0.600.000 pro mL. </li></ol> 3. Infektion Protokoll zum Generieren Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen <ol><li> THP-1 Zellpräparation (pro 96-well - Platte) <ol><li> Zentrifuge 7 x 10 6 THP-1 - Zellen bei 250 xg für 5 min. Resuspendieren in 7 ml RPMI-C. </li></ol></li><li> Mtb -GFP Vorbereitung <ol><li> Zentrifuge 2,8 x 10 8 Mtb -GFP bei 3.200 xg für 5 min in einem Schwenkbecherzentrifuge ueine Umwandlung von 1,0 OD 600 = 3 x 10 8 Bakterien / ml singen. </li><li> Wasche einmal mit RPMI-C und zentrifugiert wie in Schritt 3.2.1. </li><li> Resuspendieren in 7 ml RPMI-C und 10 s vortexen. </li></ol></li><li> Infektion HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für eine Vorlage. <ol><li> Vorbereiten eine Platte mit 96 Vertiefungen durch Zugabe von 200 &amp; mgr; l sterilem Wasser in den Reihen A und H und Spalt 1 und 12 für eine Wasserverdampfung von Felgenkulturmedium zu verhindern. </li><li> Füge 200 &amp; mgr; l RPMI-C, bis Spalte 2 (B2 bis G2) für die Hintergrundkontrolle (Blank). </li><li> Mtb -GFP Suspension (Stufe 3.2) zu THP-1 - Zellsuspension (Schritt 3.1) und gut mischen durch Pipettieren zu infizieren, hinzuzufügen. Die endgültige THP-1 Zelldichte beträgt 5 x 10 5 pro ml , und die entsprechende Vielzahl der Infektion ist 40. </li><li> Gießen Sie die THP-1 / Mtb -GFP Suspension in einem 25 - ml - Reservoir. </li><li> In 200 ul THP-1 / Mtb -GFP Suspension auf die restlichen 96 Vertiefungen (B3 bis G11) usinga Mehrkanalpipette. HINWEIS: Wenn mit mehreren 96-Well - Platten arbeiten, resuspendieren regelmäßig die restlichen THP-1 / Mtb Suspension in dem Vorratsbehälter eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten , zu jeder Vertiefung zugegeben. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 7-10 Tage. </li><li> Änderungsmedien alle 2 Tage durch langsames Entfernen 100 ul verbrauchtes Medium von der Oberseite jeder Vertiefung und sanft Zugabe von 100 &amp; mgr; l vorgewärmtes RPMI-C einen Mehrkanal-Pipette. Resuspendieren Sie nicht Brunnen und stören die Mtb / Makrophagen - Aggregate auf dem Boden der Wells. </li><li> Sichtprüfung der Vertiefungen durch Fluoreszenzmikroskopie (4-10 x Objektiv) täglich, Kenntnis von der Größe von Mtb / Makrophagen - Aggregate nehmen. Am Tag 7-10, sollte Mtb / Makrophagen - Aggregate ausreichend groß sein (siehe 2 für die Bezugnahme auf Abbildung) für die Arzneimittelwirksamkeitsprüfung (Abschnitt 4) , um fortzufahren. </li><li> Falls gewünscht, können die Aufnahmen der 96-Mulden eine automatisierte Cell Imaging System ausgestattetmit Hellfeld und GFP - Filter setzt Mtb / Makrophagen - Aggregatbildung zu dokumentieren. HINWEIS: Wenn die Benutzer keinen Zugriff auf ein automatisiertes Imaging-System haben, Bilder von repräsentativen Brunnen mit GFP und Hellfeld-Funktionen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Mikroskop aufgenommen werden. </li></ol></li></ol> 4. Growth Inhibition Assay zur Wirksamkeit von Medikamenten gegen Mtb Beurteilen von Mtb / Makrophagen - Aggregates Abgeleitet <ol><li> Arzneimittelzubereitung (dreifacher Ausfertigung Bedingungen für zwei Medikamente) HINWEIS: Siehe Abbildung 1A für Vorlage. <ol><li> In einem separaten 96-Well-Platte, fügen Sie 125 ul 7H9-C Medien B2 bis zu G10. </li><li> Bereiten zwei Medikamente bei der doppelten höchsten gewünschte Endkonzentration in 1 ml 7H9-C für die Verdünnung zu berücksichtigen, in Schritt 4.2.4. </li><li> In 250 ul jeder Droge in die Vertiefungen B11-C11-D11 und E11-F11-G11, die jeweils für drei Exemplaren Behandlungen. </li><li> Verwendung einer Mehrkanalpipette, seriell dilute die Testmedikamente zweifach um 125 &amp; mgr; l von B11-G11 in B10-G10 bewegt. Mischen durch Pipettieren 5 mal bei jedem Schritt. </li><li> Weiter 125 &amp; mgr; l von einer Spalte zu bewegen (von rechts nach links) über die Platte, und nicht mehr, nachdem Spalte 4. </li><li> Nach dem Mischen Spalte 4, verwerfen 125 &amp; mgr; l in einen Abfallbehälter. Die Spalten 2 und 3 sollten keine Medikamente enthalten, die für die Verwendung als Hintergrund (Blank) und positive Wachstumskontrollen zu ermöglichen. Hinweis: Alternativ folgen Vorlage in 1B zum Testen Droge Bibliotheken. Jede 96-Well-Platte 58 Medikamente in einer einzigen Konzentration aufnehmen kann. Bereiten Sie dieses Medikament Platte doppelt um die gewünschte endgültige Konzentration verwendet wird, da es in der Mitte in Schritt 4.2.4 verdünnt werden. </li></ol></li><li> Medikamentöse Behandlung: <ol><li> Rufen Sie die 96-Well - Platte der Mtb - infizierten Makrophagen (Mtb / Makrophagen - Aggregate) enthält. </li><li> dekantieren sorgfältig alle relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) mit einer Mehrkanalpipette.Führen Sie diese in einem zweistufigen Weise: zunächst 150 ul entfernen, ohne die Platte kippen, und entfernen Sie dann verbleibenden Medien (~ 50 &amp; mgr; l) durch die Platte Kippen und die Pipettenspitze an den unteren Rand des Bohrlochs eingesetzt wird. Als Mtb / Makrophagen - Aggregate an der Unterseite des Schachts adhärenten sind, sollten kein Material verloren. </li><li> Fügen Sie vorsichtig 100 ul 7H9-C Medien auf alle relevanten Brunnen (B2 durch G11) der Platte die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthält. </li><li> Verwendung einer Mehrkanalpipette, dann 100 &amp; mgr; l aus der Arzneimittel enthaltenden 96-Well-Platte (Schritt 4.1) in die entsprechenden Vertiefungen der Platte Infektion. </li><li> Platz in versiegelten Beutel und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Quantifizierung der Wirksamkeit von Medikamenten den Assay Resazurin Mikrotitter Verwendung <ol><li> Bereiten Resazurin Stammlösung in einer Endkonzentration von 0,8 mg / ml in H 2 O. Man filtriert durch 0,22 um Porengrße PVDF - Membran für Sterilisierung.</li><li> Bereiten Resazurin - Lösung von Resazurin Arbeitsstammlösung Mischen, H 2 O und Tween-80 (20% ige Lösung in H 2 O) in einem 2: 1: 1 - Verhältnis. Endkonzentrationen 0,4 mg / ml Resazurin und 5% Tween-80. </li><li> Unter Verwendung eines Plattenlesegerät, ein Setup-Programm, um die Fluoreszenz bei 530 nm Anregung und 590 nm Emission alle 30 min für 24 h bei 37 ° C gelesen. Vorwärmen Plattenleser auf 37 ° C. </li><li> Fügen Sie 20 &amp; mgr; l Resazurin Arbeitslösung zu allen relevanten Vertiefungen (B2 bis G11) der arzneimittelbehandelten Platte (Schritt 4.11) eine Mehrkanal-Pipette. </li><li> Legen Sie die Platte auf dem Plattenleser und starten Sie das Programm einrichten in Schritt 5.3. ANMERKUNG: Um die Verarbeitung von großen Mengen von Assayplatten zu erleichtern, ist es ausreichend, den Test in einem 37 ° C Inkubator zu entwickeln und auszuführen einzelne Fluoreszenz all 24 h liest. Dies gilt auch für Benutzer, den Zugriff auf einen Plattenleser nicht mit kinetischen und Inkubation Fähigkeiten haben. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Hier haben wir im Detail eine alternative Mtb - Infektionsmodell geeignet für die Arzneimittelwirksamkeitstests beschrieben. Dieses Modell berücksichtigt zwei wichtige Faktoren , die eine stärkere Berücksichtigung in der frühen TB Arzneimittelentwicklung gegeben werden sollte: das Vorhandensein von physiologisch relevanten Hindernisse für Arzneimittelpenetration und metabolischen Veränderungen von Mtb während der Infektion. Während wir früher die Vorteile unserer Infektionsmodell gezeigt haben , und schlug vor , der Skalierung , die Infektion für den Durchsatz Kompatibilität 16, hier oben die Möglichkeit , zeigen wir , dass diese direkt in durch die Anpassung des Systems tatsächlich erreichbar ist 96-Well - Plattenformat. Die Fähigkeit , Mtb / Makrophagen zu erzeugen Aggregate direkt in 96-Well - Platten ist von Vorteil , da es die Anforderung zu Pipette entfernt , und die Aggregate aus einem großen Kulturkolben in einzelne Wells, die schwierig ist inhärent verteilt , da die Grßen der Aggregate Größen erreichen&gt; 500 &amp; mgr; m. Die Größe der infizierten Makrophagen-Aggregate würde die Verwendung von P200 Mehrkanalpipetten zu verhindern, die für Durchsatz-Tests notwendig sind, wie wäre es entweder die Spitzen oder umfangreiche Pipettieren verstopfen würden die Aggregate auseinander brechen. Die Modifikation dieser Infektion System auf 96-Well - Platten reduziert die Menge der Manipulationsschritte benötigt und erzeugt gleichförmige Vertiefungen mit ähnlichen Mengen von Mtb / Makrophagen - Aggregate. Als solches ist dieses Testsystem besonders wertvoll nicht nur in den frühen Entwicklungsprozess die Wirksamkeit von Blei Kandidatenverbindungen in vivo, aber in dem Durchsatzscreening von Medikamentenbibliotheken vorherzusagen. Ein wesentlicher Vorteil des Modells beschrieben Infektion ist die Verwendung eines BSL-2 - kompatible Mtb - Stamm. Die Fähigkeit, unter BSL-2 Bedingungen zu arbeiten, ist sehr kostengünstig, beschleunigt Manipulation des Protokolls und vor allem ermöglicht es Labors, die den Zugang zu einem BSL-3-Anlage müssen die nicht durchführense erweiterte Suchtests Droge. Das verwendete auxotrophen Mtb mc 2 6206 - Stamm ist ein Derivat von H37Rv 17, 18 , die alle aber 4 Gene, panCD und leuCD behält, die Arzneimittel - Resistenz oder Toleranz nicht 16 beeinflussen. Im Vergleich zu anderen üblicherweise verwendeten Mtb Surrogate wie M. bovis BCG und M. smegmatis, mc 2 6206 Mtb ist am engsten mit Mtb H37Rv virulenten Referenzstamm für die Pathogenese Studien. Wichtig ist , hält sie den RD-1 - Locus, die aus BCG fehlt und spielt eine wichtige Rolle in Virulenz und Mtb Granulombildung 19. Vergleichsweise ist Mtb mc 2 6206 auch relevant für TB-Medikamentenentwicklung Assays als M. smegmatis, die eine schnell wachsende Arten, die aus Mtb genomisch ist anders und hat andere Antibiotika - Resistenzprofile. Der Test hier beschrieben ist auch wertvoll aufgrund ihrer hohen Flexibilität. Die 96-Well - Platten , die Mtb / Makrophagen - Aggregate enthalten , können für die Titration von medikamentöser Behandlung in Triplikaten nicht nur verwendet werden , wie wir (Abbildung 3), sondern auch für das Screening von gesamte Medikamentenbibliotheken (1B) gezeigt haben. Bei einer einzigen Konzentration, die jeweils 96-Well-Platte 58 Verbindungen können Bildschirm. Diese Zahl würde sich drastisch auf&gt; 300 Verbindungen, wenn die Infektion System auf eine 384-Well-Platte ausgelegt ist, die auf der Basis, dass die Tatsache, vollständig durchführbar ist, dass wir starke Resazurin Signale nach nur Lassen der Bakterien für 3 Tage zu replizieren erhalten. In der Tat wäre es relativ einfach sein, dieses System auf 384-Well-Platte-Format anzupassen, wie auch andere als Down Skalieren der Volumina proportional die kleineren Well-Format zu entsprechen, die Mehrheit des Protokolls würde unverändert bleiben. Damit ausreichendes Signal für die Resazurin-Assay, kann es sein,erforderlich, um die Inkubation in Schritt 4.2.5 bis 7 Tage zu verlängern genügend bakterielle Replikation zu ermöglichen. Während Kopplung dieser Infektionsmodell mit dem Resazurin - Assay als Auslese für Mtb Lebensfähigkeit hat viele Vorteile, nämlich seine Kosteneffizienz und schnelle Assay - Protokoll während vergleichbare Ergebnisse zu anderen Goldstandard -Computersysteme wie BACTEC 460 20 zu erhalten, hat es dennoch einige Einschränkungen . Der Resazurin Test kann nicht zwischen bakteriostatische und bakterizide Drogen unterscheiden, da sie nur die metabolische Aktivität misst. Dies ist eine wichtige Einschränkung im Auge zu behalten, wie die metabolische Aktivität von Natur aus niedrig in latent Mtb ist. Allerdings ist die Schlüsselkomponente dieser Test die Infektion Modell, das mit Auslesungen für Mtb Wirkstoffansprechverhaltens andere als die Resazurin - Assay kompatibel sein kann. Beispielsweise nach medikamentöse Behandlung, Brunnen direkt ausplattiert zur Koloniebildung Einheit (CFU) Zählen werden könnte, das Gold standard bakterizide Aktivität von Verbindungen zu testen (obwohl dies mit Throughput-Screening nicht kompatibel ist). Alternativ könnte dieses System gekoppelt werden exprimierenden Mtb Luciferase, die 21 eng an CFU Zählen korreliert wurde. Um ein Luciferase - System nutzen Wirkstoffansprechverhaltens zu messen, nur zwei Änderungen des Protokolls wäre erforderlich: i) Austausch von Mtb -GFP mit Mtb -luciferase und ii) die Verwendung von Bright-Glo Luciferin - Reagenz anstelle von Resazurin in Schritt 5. die Verwendung von Luciferase exprimierenden Mtb würde die Entwicklung des Assays auf 30 min verkürzt werden, während erheblich die Testempfindlichkeit auf ein Niveau erhöht wird, die mit 384-Well - Platte - Format leicht kompatibel wäre. Zusammengefasst haben wir erfolgreich dieses Infektionsmodell in eine 96-Well-Plattenformat umgestellt, die relativ wenige Manipulationsschritte, hohe Reproduzierbarkeit und die Fähigkeit, endlose Mengen von Ausgangs zu produzierenMaterial, alle wichtigen Faktoren in Durchsatz Kompatibilität. Dieser Test ist auch leicht anpassbar an viele verschiedene Formate und Auslesen, es ist eine wertvolle Bereicherung für den frühen Mtb Drug Discovery - Prozess zu machen.

<html> Tuberkulose (TB) bleibt eine ernsthafte globale Bedrohung für die Gesundheit trotz der Verfügbarkeit von Anti-TB - Chemotherapien seit über 40 Jahren ein. Dies ist zum Teil auf die Forderung nach langen Behandlungszeiten von mehr als 6 Monaten mehrere Arzneimittelkombinationen, die die Nichteinhaltung 2 zu Patient führt. Die Entstehung von arzneimittelresistenten TB in den letzten Jahren hat weitere Probleme in einem Bereich verstärkt , in der erfolgreiche Entwicklung klinisch zugelassenen Medikamente 3 praktisch nicht existent ist. Denn trotz erschöpfende Anti-TB - Medikamentenentwicklung, nur ein einziges Medikament für die klinische Anwendung FDA gewesen 4 in den letzten 40 Jahren zugelassen. So werden neue Generationen von Anti-TB-Medikamente sind dringend erforderlich, um dieses Problem zu lösen. Ein wesentliches Problem bei der TB Drug Discovery ist der Mangel an erfolgreichen Transfer von Verbindungen mit in - vitro - Aktivität zur Wirksamkeit in der klinischen Einstellung= &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. Zunächst wurden Zielbasierte Ansätze verwendet 5 für Anti- Mtb Drogen zu screenen, die in ganze Bakterienzellen zu übersetzen ist fehlgeschlagen. Selbst wenn Mtb - Zellen verwendet werden, wird es oft durchgeführt Brühe gewachsenen Kulturen verwendet, die nicht genau Arzneimittelwirksamkeit in vivo 8, 9 vorherzusagen. Diese Probleme wurden erkannt und Wirkstoff - Screening - Assays gegen Makrophagen enthalten , Mtb oder latent Mtb wurden erfolgreich etabliert 8, 10, 11, 12. Aber auch diese erweiterte Tests geben keine ausreichende Berücksichtigung der Durchdringung Barrieren, die Drogen in den nicht-gefäßLungenLäsionen auftreten, und in der Nekrosen an der Stelle der Infektion. Tatsächlich, Auch für die First-Line - TB - Medikamente Rifampicin, suboptimale Dosierung wurde 13, 14, 15 als auch in vivo Gewebe und Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) Penetration aufgrund unzureichender in Frage gestellt als Wirksamkeit gegen intrazelluläre Mtb 8 verringert, 9. Als solche neue Modelle und Tests, die Berücksichtigung dieser Parameter während der frühen Führung Entwicklungsprozess zweifellos TB Drug Discovery nehmen würde Anstrengungen verbessern würde. Um diesem Bedarf zu begegnen, wir eine kostengünstige, schnelle und BSL-2 - kompatible Alternative Infektionsmodell für Mtb Arzneimittelwirksamkeitsprüfung 16 vor kurzem etabliert. Diese Infektionsmodell produziert dicht Mtb verpackt in großen Makrophagen Aggregatstrukturen, die physiologisch relevante zelluläre Penetrationsbarrieren rekapituliert und erzeugt Makrophagen-agierten <em&gt; Mtb mit einem veränderten physiologischen Zustand latenten Mtb ähnelt. Mtb von dieser Infektion Modell abgeleitet wurde mit dem Resazurin Mikrotitertest (REMA) kombiniert Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten, die mit der berichteten Fähigkeit von gemeinsamen TB - Medikamente Ergebnisse im Einklang mit anderen intrazellulären Infektionsmodellen und korreliert gut produziert hohen CSF - Konzentrationen in Bezug auf Serumkonzentrationen erzielen 16. Hier beschreiben wir ausführlich in der Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen Makrophagen-agierten Mtb geeignet für die Arzneimittelempfindlichkeitstests unter Verwendung von REMA herzustellen. Insbesondere zeigen wir, wie diese Infektion System auf eine 96-Well-Format für die Kompatibilität mit Durchsatz-Screening von Kandidaten-Anti-TB-Medikamente angepasst werden könnte.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>Follow manufacturer&#039;s recommendations</td></tr><tr><td>Middlebrook OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>Prepare 20% stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>D-Pantothenic acid hemicalcium salt</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>Prepare 24 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>Prepare 50 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>Prepare 200 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG media bottle</td><td>Thermo Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Corning</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 plate reader</td><td>Biotek</td><td></td><td>Interchangable with any fluorescent plate reader and microscope</td></tr><tr><td>Gen5 Software</td><td>Biotek</td><td></td><td>Recording and analysis of rezasurin coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>Prepare 10 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Moxifloxacin Hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>Prepare 10 mg/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Resazurin Sodium Salt</td><td>Sigma</td><td>R7017</td><td>Prepare 800 &amp;mu;g/mL stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>Prepare 20% stock solution in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O; filter sterilize</td></tr></tbody></table>

a high-throughput compatible assay to evaluate drug efficacy against macrophage passaged mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

Um die Robustheit der Anpassung dieser Infektionsmodell auf 96-Well - Plattenformat bestätigen, untersuchten wir hier die Wirkstoffansprechverhaltens von Mtb abgeleitet aus unserer 96-Well angepasst Infektionsmodell Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) nach der Vorlage in Abbildung 1A. Wir zeigen , dass die Erzeugung von Mtb / Makrophagen Aggregatstrukturen Schlüssel zu diesem Assay kann zuverlässig in einer 96-Well - Plattenformat (Figur 2), wodurch der Durchsatz Kompatibilität (1B) ermöglicht , hergestellt werden. Makrophagen- agiert Mtb auf diese Weise erzeugt wird, kann direkt für die Arzneimittelwirksamkeitstests verwendet werden , unter Verwendung des gut charakterisierten Resazurin Mikrotiter - Assay (Abbildung 3). Da der Resazurin - Assay beruht auf den oxidativen Spezies von metabolisch aktiven Mtb produziert das blaue Resazurin zur fluor zu konvertierenrosa zier Resorufin, die Änderung in der Farbe und Fluoreszenz kann als Ersatzmarker verwendet werden, um die Menge des Bakterienwachstums zu bestimmen. In 3A zeigen wir , dass es genügend Empfindlichkeit innerhalb des Resazurin - Tests ist tragfähige Mtb Bakterien in Abwesenheit von Arzneimitteln replizierender bereits nach 3 Tagen Inkubation der Lage, zuverlässig zu detektieren. Während eine visuelle Bestätigung des Endpunkts Farbänderung nur eine annähernde Bewertung des Wachstums ist, können wir dies genau quantifizieren , durch kinetisch die Umwandlung von Resazurin in seine fluoreszierende Metabolit Messen eines Plattenlesegerät (3B) Resorufin werden. Mit Hilfe dieser Daten an die positiven Wachstumskontrolle (ohne Medikamente) Normalisierung ermöglicht die Berechnung der Anfälligkeit zu töten Kurven Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen-agierten Mtb (Abbildung 4) sichtbar zu machen. Hierbei ist die repräsentativen Ergebnisse in den 3 </strong&gt; Und 4 zeigen , daß die minimale Hemmkonzentration (MIC), die niedrigste Konzentration des Antibiotikums definiert , bei der 90% Wachstumshemmung beobachtet wird , größer als 2 &amp; mgr; g / ml für beide Rifampicin und Moxifloxacin gegen Mtb aus unserem Infektionsmodell abgeleitet ist. Dies zeigt , dass unsere Infektionsmodell Wirksamkeit von Anti - Mtb Medikamente vorhersagt , die mehr im Einklang mit den MHK - Werten bestimmt gegen intrazelluläre Mtb 8, und somit spiegelt die Diffusionsbarriereeigenschaften , die in den meisten Mtb Sensibilitätstests unter Verwendung von Brühe gezüchtet Bakterienzellen vernachlässigt werden. Wichtig ist , dass die erhaltenen Daten den beschriebenen Assay in 96-Well - Format unter Verwendung zeigten sehr vergleichbare Ergebnisse zu denen , die wir früher für Rifampicin und Moxifloxacin gegen Makrophagen- passagierten Mtb 16 bestimmt war. Abbildung 1: Drug Plattenlayout. (A) Beispiel Vorlage der Platte Arzneimittel Herausforderung in Schritt 4. Dies ermöglicht die parallele Untersuchung von zwei Arzneimitteln in jeweils drei Wells bei 8 definierten Konzentrationen. Als ein repräsentatives Experiment verwendeten wir Rifampicin (RIF) und Moxifloxacin (Moxi) bei 2 &amp; mgr; M und 2,5 &amp; mgr; M ausgehend, respectively. (B) Eine alternative Vorlage für throughput screening wird auch bei einer einzigen Konzentration , die Möglichkeit des Testens von 58 Verbindungen zu zeigen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55453/55453fig2.jpg" /> Abbildung 2: Erzeugung von Mtb / Makrophagen - Aggregatstrukturen in 96-Well - PlatteFormat. (A) Repräsentative Hellfeld und GFP fusionierten Bilder von Mtb -macrophage Aggregaten an Tag 9 nach der Infektion. Die Bilder wurden mit einem 4X Ziel unter Verwendung eines automatisierten Cell-Imaging-Programm erfasst, die durch Nähen eine Montage von 3 x 3 einzeln aufgenommenen Bilder die gesamte gut dokumentiert. (B) ein einzelne nicht-genähte Bild aus dem Gesichtsfeld in (A) gezeigt. (C) ein Vertreter fusionierte Hellfeld- und GFP Bild eines Mtb / Makrophagen - Aggregat - Struktur mit einem 10X - Objektiv eingefangen. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55453/55453fig3.jpg" /> Abbildung 3: Unter Verwendung der Resazurin Mikrotitertest Mtb Lebensfähigkeit zu messen. (A) Die Anwesenheit von viable Mtb Zellen können einfach durch die Umwandlung des blauen Resazurin Farbstoff auf seine rosa, reduzierte Form bestimmt werden. Repräsentative Ergebnisse sind hier gezeigten Rifampicin (RIF) und unter Verwendung von Moxifloxacin (Moxi) entsprechend der Schablone in 1A. (B) Zur Messung der quantitativen Bestimmung der Umwandlung von Resazurin, Fluoreszenz von einzelnen Vertiefungen (entsprechend auf 3A) wurde 24 h kinetisch kontrolliert , wie in Schritt 5. Repräsentative Mini-Diagramme zeigen relative Fluoreszenzeinheiten (y-Achse) gegen die Zeit beschrieben (x -Achse). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55453/55453fig4.jpg" /> Abbildung 4: Wirkstoffansprechverhaltens Bestimmung Kurven von REMA Daten zu töten. Relative Fluoreszenzeinheiten zum Zeitpunkt der maximalen resazurin Signal in (A) und Rifampicin (B) Moxifloxacin behandelten Vertiefungen (von 3B) wurden normalisiert auf die kein Medikament Steuerung (maximale Wachstums Mtb) als 100% Überleben. Hintergrund Steuerung (Blank) Signale wurden von jeder Probe gut abgezogen. Die prozentuale Überleben wurde für jede einzelne Konzentration der medikamentösen Behandlung aufgetragen, um eine Tötung Kurve zu erzeugen. Daten in dieser Figur repräsentieren die Mittelwerte ± SD von drei unabhängigen Experimenten. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55453/55453fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

7.8K Aufrufe.  University of Alabama at Birmingham. New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening. 

Serie: A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Wachstum von Mycobacterium tuberculosis Biofilme

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualisierung des Charcoal Agar Resazurin-Assay für Semi-quantitative, Mitteldurch Auszählung von Mykobakterien

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Hochdurchsatz-Screening-Assay für Mycobacterium abscessus mit Dual-Reportern

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Skalierbares Wirkstoff-Screening-Protokoll für die effiziente Entdeckung von M. abscessus-Behandlungen

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1

The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic strains and genetically engineered cells. Here, an alternative method to detect biochemical interaction between the macrophage microbial sensor SLAMF1 and Mycobacterium tuberculosis is described. Two technical approaches employing flow cytometry and fluorescence microscopy were developed. Total cell protein extracts from human macrophages were generated, then incubated with whole cells of M. tuberculosis (WCMtb)&#160;or M. tuberculosis antigens (Mtb Ags) overnight at 4 &#176;C and finally cross-linked using formaldehyde/glycine/ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) treatment. SLAMF1 interaction with WCMtb by flow cytometry was detected with a PE-specific anti-SLAMF1 antibody. The existence of interaction by fluorescence microscopy was performed by attaching Rhodamine-PE stained Mtb Ags to poly-D-lysine coated slides, which were incubated with the total protein extract from monocyte-derived macrophages. After cross-linking treatment, SLAMF1 was visualized using primary (anti-SLAMF1) and secondary (Alexa Fluor 488) antibodies. The assays provided a strong biochemical tool to measure pathogen-immunoreceptor interactions, overcoming the difficulties associated with transgenic cell lines and protein gene expression modulation experiments.

This study provides a protocol for evaluating the interaction of Mycobacterium tuberculosis with the SLAMF1 microbial sensor. The assays were conducted on human monocyte-derived macrophages using flow cytometry and fluorescence microscopy. The described tools are relevant for studying interactions between pathogens and immunoreceptors.

Fluoreszenz-Assays zur Untersuchung der Interaktion von Mycobacterium tuberculosis mit dem Immunrezeptor SLAMF1

The evaluation of direct interaction between pathogens and immune receptors usually involves sophisticated techniques or implies the use of transgenic ...

Beschleunigung der Tuberkulosebestimmung mit der Mikro-KBE-Methode

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der KBE-Bestimmung für eine effiziente Bewertung der Wirksamkeit von TB-Impfstoffen und der Analyse der Antigenpräsentation 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Ein Hochdurchsatz-Assay unterstützte Wirksamkeit von Medikamenten gegen Makrophagen agierten zur Bewertung

Zusammenfassung

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System zur Wirksamkeit und Zytotoxizität Screening von Inhibitoren Targeting intrazellulärer

Ein automatisiertes Kultursystem zur präklinischen Erprobung wirtsgerichteter Therapien für Tuberkulose

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

Assay-Entwicklung für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening gegen Mykobakterien

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Fluoreszenz-Assays zur Untersuchung der Interaktion von Mycobacterium tuberculosis mit dem Immunrezeptor SLAMF1

Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose