Name: dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis
Uploaded: 2017-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
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The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Alle Tierverfahren in dieser Studie durchgeführt werden, von der Keio University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt (IACUC - Zulassungsnummer: 09221) und die Richtlinien des Instituts für Tierversuche an der Keio-Universität für den Einsatz von Tieren in der Forschung folgen. Menschliche Proben wurden von einem kadaver in der Abteilung für Anatomie, Keio University School of Medicine gespendet isoliert und wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Regelungen verwendet. 1. Isolierung von Auditory Bulla und Kapsel <ol><li> Euthanize Mäuse in einem Glas eine Plattform über Papiertücher getränkt in Isofluran oder Sevofluran bis respiratorischen Beatmung nicht mehr länger als eine Minute enthält, und dann Zervikaldislokation durchführen. Achten Sie darauf, den direkten Kontakt von Mäusen mit dem getränkten Papiertüchern zu vermeiden. </li><li> Machen Sie einen kleinen Quereinschnitt an der dorsalen Seite des Halses und ziehen die Haut auseinander in Richtung Kopf und Schwanz mit beiden Händen zugrunde liegenden Hals mu aussetzenscle Gewebe. </li><li> Enthaupten Mäuse im Halsbereich mit 14 cm scharf chirurgische Scheren. </li><li> Peel Haut vollständig gegen die Nase. Schneiden Sie alle Haut zusammen mit der Schnauze und Schneidezähne ab. </li><li> Legen einer Schere in den Mund und Kaumuskeln auf beiden Seiten geschnitten. </li><li> Öffnen Sie den Kiefer vorsichtig und entfernen Sie die Zunge und Unterkiefer zusammen. </li><li> Mit einer scharfen Schere, Split Schädel und Schädelbasis in zwei Hälften entlang der Midsagittalebene (1A, B). </li><li> Mit einer Pinzette entfernen Sie die zerebrale und zerebelläre Hemisphären und den Hirnstamm. Die auditorische Bulla und Kapsel befinden sich lateral des Kleinhirns und des Hirnstamms. Beachten Sie, dass der Gehör Bulla zum Gehörkapsel weiter lateral ist (1C, D). </li><li> Präparieren aus der Bulla und Kapsel mit dem umgebenden Schädelknochen (Abbildung 1E). </li><li> Die Probe wird auf eine Schale mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) pH 7,4 bei RT. </li><li> Under ein Binokular Binokular, verwenden Pinzette die umliegenden Knochen und Schere auseinander zu ziehen , die gelockert Grenze um der Bulla und Kapsel (1F) zu schneiden. Die umliegenden Knochen entfernt sind die Basioccipitale (ventralen Rand), exoccipital (ventro-posteriore Grenze), Supraoccipitale (posterior Grenze), interparietal, parietalen (dorsalen Rand), Squamosum (dorso-anterioren Grenze), alisphenoid (vordere Grenze) und Basisphenoid (antero- ventralen Rand) Knochen. Beachten Sie, dass die styliform Prozess (Sp), die das Trommelfell Öffnung der Eustachischen Röhre unterstützt 41, von der Griffelfortsatz des Schläfenbeins unterscheidet. </li></ol> 2. Isolierung von Gehörknöchelchen: Malleus, Amboß und Steigbügel <ol><li> Hammer <ol><li> Verwendung von sowohl einer kleinen Schere und Pinzette, entfernen Sie den Teil des äußeren Gehörgangs lateral des Sulcus tympanicus so dass das Trommelfell sichtbar ist (2A, B). </li><li> Entfernen Sie Teil des Trommelfells und Pauken Knochen in der Nähe des malleal Processus brevis (orbicular apophysis, siehe Diskussion), die beide an der ventralen (gepunktet) und posterioren (#) Wände (2C). Der Malleus und Tensor tympani sollte nun ausgesetzt (2D, E) werden. </li><li> Heben Sie den Malleus (2F) und schneiden Sie den Tensor tympani mit der abgeschrägten Kante einer 27 G - Nadel (2G). Beachten Sie, dass die malleal Manubrium an das Trommelfell fest befestigt, wie es in anderen Säugetieren zu sehen ist. </li><li> Nehmen Sie das Trommelfell vorsichtig aus dem Manubrium, die zerbrechlich ist. Entfernen Sie das Trommelfell Knochen die drei Gehörknöchelchen zu offenbaren. </li><li> Verrücken die Malleus aus dem Ambos am Gehörknöchelchen Gelenk (Abbildung 2H). </li><li> Isolieren Sie die Hammers durch den vorderen Prozess am goniale Fracturing. </li></ol></li><li> Amboß und Steigbügel <ol><li> Isolieren ter incus durch den hinteren Ligamentum des Incus am kurzen crus (3A) abschneidet. </li><li> Isolieren Sie die Steigbügel durch die Steigbügel Arterie in der Nähe der Steigbügel mit der abgeschrägten Kante einer 27 G - Nadel (3B, C) abschneidet. Falls erforderlich, schneiden die Sehne des M. stapedius am Muskelprozess der Steigbügel mit der Nadel. </li><li> Legen Sie eine Nähnadel (oder einen Markierungsstift) in die Hüftbeinloch des Steigbügels und heben Sie die Steigbügel nach oben. Nach dem Steigbügel zu entfernen, sollte die ovalen Fensteröffnung deutlich sichtbar (Abbildung 3D) sein. </li></ol></li></ol> 3. Embedding von Auditory Bulla und Kapsel <ol><li> Vorbereitung für die in Paraffinblöcken Einbetten <ol><li> Isolieren Sie die Bulla und Kapsel, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie das vordere Ende des Bulla (der styliform Prozess) aus mit einer Schere, tauchen Sie die Bulla und Kapsel in 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS bei 4 °C und erlauben Fixiermittel in die Bulla einzugeben. Wenn die Luft in der Bulla eingeschlossen wird, entfernen Sie sie mit einer Nadel und Spritze. Lassen Sie das Bulla und Kapsel in dem Fixiermittel bei 4 ° CO / N an einem Rohr Rotator. Achtung: PFA ist giftig und sollte sorgfältig behandelt werden. </li><li> Wasche einmal mit PBS. </li><li> Entkalken Bulla und Kapsel für eine Woche bei 4 ° C in 10% Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (EDTA-2Na), 100 mM Tris-Base, pH 7,0, in einem 2-ml-Röhrchen. Ändern Sie den Puffer jeden zweiten Tag. </li><li> Wasche einmal mit PBS. Proben können in 70% Ethanol in Wasser bei 4 ° C gelagert werden. Wahlweise Übertragung auf 70% Ethanol durch eine abgestufte Alkoholserie (30%, 50%, 70% in Wasser). </li><li> Auf einem Gewebeprozessor, dehydrieren Proben in einer abgestuften Reihe von Ethanollösungen (70%, 2 x 95%, 3 x 100%, jeweils 1 h), klar in Xylol (4x, jeweils 1 h bei 40 ° C) und infiltrieren Proben mit geschmolzene Paraffinwachs 42. Optional Ersatz Xylol mit kommerziellen Gewebe clearing Lösung (zB Histo-Clear). </li><li> Unload Proben aus dem Prozessor, und entfernen Sie sie aus ihren Kassetten. </li><li> Auf einem Konsolensystem Gewebeein, Ort Proben in Formen mit geschmolzenem Paraffinwachs gefüllt. Gehen Sie zur Einbettung (Abschnitt 4). </li></ol></li><li> Vorbereitung für die in gefrorenen Blöcken (Kawamoto Film - Methode) das Einbetten 43 <ol><li> Isolieren Sie die Bulla und Kapsel, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie das vordere Ende des Bulla (der styliform Prozess) aus mit einer Schere, tauchen Sie die Bulla und Kapsel in Fixierungsmittel (2% bzw. 1% PFA und nicht 4% in PBS Antigenität zu erhalten) bei 4 ° C. Wenn Luft in Bulla gefangen ist, entfernen Sie sie mit einer Nadel und Spritze. Lassen Sie das Bulla und Kapsel in dem Fixiermittel bei 4 ° CO / N an einem Rohr Rotator. </li><li> Waschen Sie Bulla und Kapsel schnell in PBS und sofort in flüssigem Kryo-Einbettmasse bei 4 ° C tauchen. </li><li> Wichtig: Entfernen Sie Luftblasen, wenn eine in der Mitteund Außenohr durch Aspiration durch eine Nadel, und durch die Einbettung Verbindung mit einer Pinzette hinzufügen. Gehen Sie zur Einbettung (Abschnitt 4). </li></ol></li></ol> 4. Probenorientierung und Embedding HINWEIS: Die gesamte Bulla und Kapsel muss beim Einbetten in einer bestimmten Ausrichtung angeordnet werden, um gewünschte Abschnitte zu schneiden. Die unten beschriebenen Verfahren werden in Abschnitt verwendet, um die Malleus in verschiedenen Ausrichtungen. <ol><li> Längs (parasagittal) Schnitte des Hammers <ol><li> Setzen Sie die Querseite des Bulla oder äußeren Gehörgang nach unten in warmen Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse). Passen Sie die Ausrichtung so , dass der Hals und Quer Lamina des Hammers auf den horizontalen Boden des Einbettungsschale parallel sind (4A - C). Man beachte , dass das Trommelfell in einem Winkel von etwa 30 ° zur Vertikalen in der Maus Kopf (4A geneigt ist, Figur 59 in Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Horizontale Schnitte des Hammers <ol><li> Platzieren Sie den Rückenkamm horizontal in warmem Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse). Stellen Sie die Ausrichtung der Bulla und Kapsel , so dass der Hals und transversal Lamina des Hammers auf die Unterseite des Einbettungsschale senkrecht sind (4D - F). </li></ol></li><li> Frontal Schnitte (Querschnitte) von manubrium und Trommelfell 5 <ol><li> Legen Sie die malleal manubrium in warmem Paraffin (oder Kryo-Einbettmasse), so dass es senkrecht zum Boden des Einbettungsschale. </li></ol></li><li> Kühlen Sie den Block auf Temperaturen geeignet Paraffinwachs auf einem Gewebeeinkonsolensystem härten (alternativ verwenden Kryo-Einbettmasse in einem Trockeneis / Hexan-Bad). </li><li> Prozessgewebeblock und Zuschnitten unter Verwendung von Routineverfahren. Beispielsweise stain Paraffinschnitte mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; #38; E), Safranin O (für Knorpel) oder zur Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Aktivität (für Osteoklasten) 3, oder durch Immunhistochemie. Unentkalkte Kryoabschnitte eignen sich für die Kennzeichnung Knochen Fluorochrome 14, Alizarin - Rot - Färbung für Kalzium verwendet und Immunofluoreszenz 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Hier präsentieren wir eine Methode nützlich, um die Gehör Bulla und Kapsel in der postnatalen Mäusen zu isolieren. Vor dem P12 sind Gewebe zerbrechlich und kann während der Isolierung beschädigt werden. Nach P12 kann der auditorischen Bulla und Kapsel leicht aus den umliegenden Gewebe isoliert werden. die Bulla vom Kopf Dissecting vor sectioning hat mehrere Vorteile. Als erstes postnatale Kavitation und das Wachstum des auditorischen Bulla treten am aktivsten von P6 ab und sind vollständig von P14 50. Die mesenchymalen Gewebe zwischen dem Trommelfell und Cochlea-Wand wird durch Luft, die durch die Kavitation ersetzt. Die sich ergebende Luft in der Paukenhöhle kann Kontakt zwischen Gewebe und Flüssigkeiten während der Fixierung, Entkalkung und Einbettung behindern. Es ist einfacher, Luft aus dem isolierten auditorischen Bulla zu entfernen, indem das vordere Ende (styliform Prozess) das Abschneiden anstatt zu versuchen, so in der unisolierten Bulla zu tun. Zweitens Ausrichtung des Hammers (und das Trommelfell) nicht vertikalim Kopf. Es ist daher leichter zu Abschnitt der Malleus in gewünschten Ebenen, die durch die isolierte auditorischen Bulla und Kapsel in einer bestimmten Orientierung Einbettung. Einmal isoliert, auditiv Bulla und Kapseln sind für zahlreiche Analysen nützlich. Zum Beispiel, hochauflösende Röntgen Mikro-CT kann Knochenmikrostruktur Morphologie wie osteogene Kapillaren in der Malleus 14 offenbaren. Die die Stereo Präpariermikroskop ist ein leistungsfähiges Werkzeug Strukturen zu visualisieren reporter Mäuse bei der Bewertung 33 fluoreszierende Proteine in der Mittel- oder Innenohr exprimiert. Darüber hinaus könnten verschiedene in vivo oder ex vivo Fluoreszenz - Markierungsverfahren und whole mount Immunfluoreszenz - Nachweis durchgeführt werden. Lichtbogenfluoreszenzmikroskopie ist auch nützlich für die dreidimensionale Analyse 51. Obwohl hier nicht beschrieben, diverse anatomische Strukturen mit auditorischen Bulla und Kapsel verbunden sind, wie periphere Nerven, Blutgefäßen, unddas Trommelfell in das Mittelohr können auch unter Verwendung dieses Protokolls ausgewertet werden. Beachten Sie, dass Paraffin Schneide Entkalkung von Knochengewebe erfordert vor dem Einbetten und daher nicht Analyse der Mineralisierung nicht gestattet. Im Gegensatz dazu 43 der Kawamoto Filmverfahren verwendet , um Gefrierschnitten zubereiten können ohne Entkalkung durchgeführt werden und ist geeignet für Studien Mineralisierung in vivo Knochen-Markierungstechniken oder spezielle Färbung wie Alizarin - Färbung verwendet wird . Cryo-Schneidebedingungen sollten entsprechend auf Maus Alter optimiert basiert. Beispielsweise wird eine weniger kühle Temperatur im Inneren der Kryostatkammer für ältere Maus Proben empfohlen Beschädigung Abschnitte zu minimieren. In der Maus ist die korrekte Bezeichnung für den prominenten halbkugelförmigen Vorsprung des Hammers &quot;orbicular apophysis&quot;. Dennoch wurde der verwendete Begriff &quot;Processus brevis&quot; weit die orbicular apophysis für mehr th, um anzuzeigen,ein zwei Jahrzehnte, vor allem bei der Maus Entwicklungsbiologen 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot; ursprünglich auf den seitlichen Prozess bezeichnet (Processus lateralis), die von der orbicular apophysis unterscheidet. Beim Menschen bildet eine seitliche Prozess der allgemeinen Linie der Bindung an das Trommelfell einen leichten konischen Vorsprung ähnelt, von der manubrium erstreckt (nicht in 6B, Ansicht von medial gesehen). In Mäusen ist die laterale Verfahren auch ein Vorsprung des Manubrium am entgegengesetzten Ende mit dem Umbo 48. Die Pars flaccida des Trommelfells über dem seitlichen Prozess des Hammers. Orbicular apophysis ist im menschlichen Malleus nicht ersichtlich.

Die drei Gehörknöchelchen des Mittelohrs, nämlich die Hammer, Amboß und Steigbügel, bilden eine Säugetierspezifischen auditorischen Kette , die Schall vom Trommelfell zum Innenohr überträgt, oder Cochlea 1,2. Gehörfunktion kann durch Messung Hirnstammaudiometrie (ABR) Schwellen 3-6, und die Schwingung des Hammers hinter dem Trommelfell in Mäusen bewertet werden kann unter Verwendung von Laser - Doppler - Vibrometer überwacht werden (LDV) 7. Durch die Kombination von ABR, LDV und Verzerrungsprodukt otoakustischer Emission (DPOAE) Messungen kann Leitungsschwerhörigkeit von sensorineuralen Beeinträchtigung 8 unterschieden werden. Tiermodelle von Ohr Bedingungen benötigt werden, angesichts der Bedeutung des Hörens und Ohr Gesundheit das Wohlbefinden von Patienten aller Altersgruppen. Zum Beispiel ist Otitis media eine extrem häufige Ohr-Infektion in menschlichen Säuglingen und Kindern gesehen, und schwere, akute Otitis media und ihre Komplikationen, wenn die Bedin auftreten kanntion nicht mit geeigneten antimikrobiellen Mitteln 9 behandelt. Mausmodelle von Otitis media konnte die Pathogenese beim Verständnis und bei der Entwicklung von Behandlungen 10,11 nützlich erweisen. Murine Gehörknöchelchen, die ( mit Ausnahme des goniale Teil des Malleus) durch endochondrale Ossifikation gebildet werden 12,13 sind von großer Bedeutung für die Untersuchung des Knochenstoffwechsels und Morphogenese. Erstens, ihre geringe Größe ermöglicht hochauflösende Analyse von Knochen mit einem intakten Periost 14 Röntgen- oder Fluoreszenzmikroskopie. Zweitens anomale Knochenmetabolismus, wie übermäßige oder mangelhafte Knochenresorption oder beeinträchtigter Wechselwirkungen zwischen Knochenzellen 15 kann als potenzieller Beitrag zum Hörverlust 3,4,7 analysiert werden. Drittens abnormal Gehörknöchelchen Morphogenese in mehreren Gen-defizienten Mäusen, wie Tiere berichtet Hoxa2 fehlt 16-19, Msx1 20-22, Prrx1 23, goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, Fgfr1 29, Schilddrüsenhormon - Rezeptoren (Thra, Thrb) 5, Bcl - 2 30 und andere 1,31 oder bei Mäusen überexprimiert , Hoxa2 32. Schließlich trotz ihrer geringen Größe mit Gehörknöchelchen verbunden sind Strukturen wie Muskeln 33 und Gelenke 34,35 sind zugänglich. Maus Gehörknöchelchen sind kleiner als menschliche Gehörknöchelchen, aber es ist bemerkenswert, dass die Maus Mittelohr ist nicht eine Miniaturversion der weibliche Körper. Zum Beispiel bei Mäusen, die Steigbügel Arterie, die durch den Ring der Steigbügel geht, bleibt während des gesamten Lebens 36, während bei Menschen, die embryonale Steigbügel Arterie während der Schwangerschaft verschwindet. Darüber hinaus unterscheidet sich die Morphologie der Maus malleus von der the menschlichen Knochen (siehe Abbildung 6). Bei Mäusen umschließt die auditorische (Pauken) Bulla die luftgefüllten Mittelohrhöhle, während beim Menschen, von trabekulären Knochen zusammengesetzt mastoid Luftzellen im Schläfenbein die Gehörknöchelchen und nicht als Bulla 37 untergebracht ist . Bei beiden Arten, die Gehörkapsel (Ohrkapsel, knöcherne Labyrinth) umschließt die Cochlea und Bogengänge des Innenohrs. Vergleichende und Evolutionsbiologie des Mittelohrs wurde 38-40 ausführlich überprüft. Das Protokoll unten zuerst bereitgestellt wird beschrieben, wie die auditorischen Bulla und Kapsel zu sezieren aus, die vor allem aus dem Mittelohr und Innenohr bestehen jeweils. Dieses Protokoll zeigt auch, wie die Hammer, Amboß und Steigbügel aus dem Gehör Bulla zu isolieren. Schließlich zeigt es, wie die auditorischen Bulla und Kapsel in der Vorbereitung für die Einbettung für die Gewebeschnittplan der Gehörknöchelchen zu orientieren.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Bei den meisten Säugetieren, Gehörknöchelchen im Mittelohr, einschließlich der Hammer, Amboß und Steigbügel, sind die kleinsten Knochen. Bei Mäusen, die so genannte eine knöcherne Struktur der auditorischen Bulla die Gehörknöchelchen beherbergt, während die Gehörkapsel das Innenohr umschließt, nämlich die Cochlea und Bogengänge. Murine Gehörknöchelchen sind von wesentlicher Bedeutung für das Hören und somit von großem Interesse für Forscher auf dem Gebiet der HNO-Heilkunde, sondern ihren Stoffwechsel, Entwicklung und Evolution sind auf anderen Gebieten sehr relevant. Veränderte Knochenstoffwechsel kann zu Gehörfunktion in erwachsenen Mäusen beeinflussen und verschiedene Gen-defiziente Mäuse zeigen Veränderungen in der Morphogenese von Gehörknöchelchen in utero. Obwohl murine Gehörknöchelchen klein sind, ist ihre Handhabung möglich ist, wenn man ihre anatomischen Orientierung und 3D-Struktur versteht. Hier beschreiben wir, wie die auditorischen Bulla und Kapsel von postnatalen Mäusen zu sezieren und dann einzelne Gehörknöchelchen isolieren, indem ein Teil der Bulla zu entfernen. Wir diskutieren auch, wie emBett der Bulla und Kapsel in unterschiedlichen Ausrichtungen geeignet zur Herstellung von longitudinal, horizontal oder frontalen Abschnitte des Malleus Paraffin oder Gefrierschnitten zu erzeugen. Schließlich aufzuzählen wir anatomischen Unterschiede zwischen Maus und Mensch Gehörknöchelchen. Diese Verfahren wäre nützlich bei der Analyse von pathologischen, Entwicklungs- und evolutionäre Aspekte der Gehörknöchelchen und das Mittelohr bei Mäusen.

Dieses Protokoll stellt eine Methode Gehörknöchelchen aus der auditorische Bulla zu isolieren. Zuerst werden die Bulla und Kapsel herauspräpariert als ein einzelnes Stück aus dem Schädel (Abbildung 1). Die sezierten Bulla wird dann verwendet , um den Malleus (Abbildung 2) und dem Amboß und Steigbügel (Abbildung 3) herzustellen. Sehenswürdigkeiten des auditorischen Bulla und Kapsel sind die styliform Prozess am vorderen Ende des Bulla, der Rückenkamm, vorderen Bogengangs und der subarcuate Fossa (1F). Microcomputed - Tomographie (CT) Bildgebungs zeigt Gehörknöchelchen im auditorischen Bulla sowie die optimale Ausrichtung für Längs- und horizontale Schnitte dieser Gehörknöchelchen (Abbildung 4). Für Längs Paraffin Schneide des Hammers wurden die Bulla und Kapsel bei 4 ° C in EDTA entkalkt für eine Woche in einem pa eingebettetraffin Block bei der gezeigten Ausrichtung in Figur 4 A - C, bei 4 &amp; mgr; m, geschnitten und dann H &amp; E gefärbt werden. Der Malleus an das Trommelfell im auditorischen Bulla angebracht enthüllt laufenden endochondral Verknöcherung bei P14 (5A). Um neue Knochenbildung sichtbar zu machen, Calcein (30 ug / g Körpergewicht) wurde peritoneal in eine P20-Maus injiziert, und Bulla und Kapsel wurden 24 Stunden später bei P21 isoliert. Die Probe ohne Entkalkung wurde gefroren eingebettet und dann bei 6 um gefriergeschnitten einen Klebefilm unter Verwendung basierend auf dem Verfahren von Kawamoto 43. Nach Kernfärbung mit DAPI (4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol), wurde der Abschnitt unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Calcein - Signale (grün) zeigte neue Knochenbildung in der Malleus (m), Bulla und Kapsel (5B). Für horizontale Schnitte des Hammers, die auditorischen Bulla von einem 5-Wochen alten Maus isoliert wurde ohne Entkalkung gefroren eingebettet (für denOrientierung siehe Abbildung 4D - F), gefriergeschnitten bei 6 um die Kawamoto - Methode und unter Verwendung von H &amp; E gefärbt. Horizontale Schnitte des malleal Processus brevis (mPB) zeigt auch die Cochlea (5C). Eine mediale Ansicht der rechten Gehörknöchelchen aus einer P31 - Maus isoliert zeigt typische Merkmale der Maus Malleus, nämlich die &quot;Gleit-Möwe-Flügel-like&quot; (oder persischer schwertartigen 45) manubrium, ein prominentes Processus brevis (orbicular apophysis siehe Diskussion), und die transversale Lamina (Abbildung 6). Beachten Sie, dass der vordere Prozess (Processus anterior) in der Dissektion Verfahren um die goniale gebrochen wurde und aus der Paukenring (ectotympanic) getrennt. Diese repräsentative Stichprobe zeigt eine intakte incudomalleolar Verbindung zwischen dem Hammer und Amboß, während die incudostapedial Gelenk verrenkt wird. Sehnenansätze in die malleal undSteigbügelmuskel Prozesse sind nachweisbar (6A, Sternchen). 6B vergleicht Maus und Mensch Gehörknöchelchen bei gleicher Vergrößerung. Speziesunterschiede, andere als Größe, sind die folgenden. Der malleal manubrium ist flügelartig in Mäusen, aber Club-beim Menschen. Der Winkel zwischen der anatomischen Achse (oder der Drehachse, die Linie, die durch den vorderen Prozess des Hammers und dem kurzen Fortsatz des Amboß) und dem Manubrium ist viel kleiner in Mäusen und die beiden sind fast parallel, hinsichtlich nahezu senkrecht Gegensatz beim Menschen 6,46-48. In der menschlichen Gehörknöchelchen, offenbaren vibrometric Studien , dass die incudo-malleolar Gelenk beweglich ist und nicht funktional 49 fixiert. Die Maus Malleus zeigt eine breite, dünne und flache transversale Lamina nicht offensichtlich beim Menschen 47. Bei Mäusen, Sicherungen der Processus anterior membranösen Knochen, nämlich die goniale und der tympanic Ring, während beim Menschen die processus anterior zu einem kleinen spicule Knochen 41 reduziert. Der Steigbügel von Mäusen und Menschen unterscheidet sich auch: bei Mäusen, die vordere Crus gekrümmt ist und der hintere Crus ist gerade während bei Menschen, die vordere Crus ist gerade als die hintere Crus. Es ist erwähnenswert, dass der Malleus Kopf relativ zur Körpergröße massiv in Arten wie der Goldmulle vergrößert wird, 48 erhebliche Variabilität in allometric Beziehungen von &quot;kleinsten&quot; Knochen zu demonstrieren. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection des Auditory Bulla und Kapsel. (A) Der Schädel eines P31 - Maus ist in rechte und linke Hälften geteilt. A, vordere; P, posterior; L, links; R, rechts. (B) Medial Oberfläche der rechten Hälfte des halbierten, gehäutet Kopf. Cx, Hirnrinde; Cb, Cerebellum; Bs, brainstem. D, dorsale; V, ventralen. (C) Entfernung des Gehirns mit einer Pinzette. (D) Medial Ansicht des auditorischen Kapsel im rechten Schädel. Der Rückenkamm (Pfeilspitzen) liegt zwischen der mittleren Schädelgrube (mcf) und hinteren Schädelgrube (PCF) und trennt dorso-anterioren und ventro- hinteren Oberflächen der Gehörkapsel. Maßstabsbalken, 2 mm. (E) Eine stärkere Vergrößerung der auditorischen Bulla und Kapsel (medial). Co, Cochlea; VII, Gesichtsnerven; VIII, N. vestibulocochlearis; AC, vordere (superior) Bogengang; Sf, subarcuate Fossa, die die Kleinhirns paraflocculus beherbergt. Maßstabsbalken, 1 mm. (F) Mikroskopische Aufnahme von isolierten auditorischen Bulla und Kapsel (medial). Sp, styliform Prozess. Maßstabsbalken, 1 mm. (A - E), P31 Maus. (F), P33 Maus. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dissektion der Malleus. (A) Ventrolateral Ansicht eines rechten Gehör Bulla und Kapsel. Der Sulcus tympanicus (ST, gestrichelte Pfeil) ist die Bindungsstelle des Trommelfells. Der Knochen lateral der ST ist ein Teil des äußeren Ohrs und der Knochen medial der ST bildet den Boden der Mittelohrhöhle. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. (B) Ansicht nach Entfernung des äußeren Gehörgangs zu offenbaren das Trommelfell (TM) einschließlich der Pars flaccida (Pf) und Pars tensa (Pt). (C) Entfernung von Teilen des Trommelfells Knochen (gestrichelte Linien und #) in der Nähe des malleal Processus brevis (mPB). m, Malleus; mM, malleal manubrium. Pfeil, Luftblase in der Paukenhöhle durch das Trommelfell gesehen. (D) Exposed Malleus. Malleus Kopf angezeigt. GepunkteteLinie zeigt die Gelenkfläche des Ambos. (E) Tendon des Tensor tympani (TT) mit dem Malleus befestigt. (F) Der Tensor tympani gezogen wird , wenn der Hammer angehoben wird. *, Muskel Prozess. (G) Tensor tympani geschnitten , um eine Nadel. (H) drei Gehörknöchelchen nach Entfernung des Trommelfells. Die incudo-malleolar Gelenk verrenkt. m, Malleus; i, Amboß; s, Steigbügel; Gehen, goniale (fusioniert mit dem Malleus und Paukenring, TR). Alle Maßstabsbalken, 0,5 mm. (A, H), P33 Maus. (B - G), P31 Maus. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Abbildung 3. Dissektion der Amboß und Steigbügel. (A) Incus undSteigbügel nach Entfernung des Hammers. Die Steigbügel Arterie (SA) durch den Steigbügel (s). Die gestrichelte Linie zeigt die Gelenkfläche des Ambos. Beachten Sie, dass die kurze crus (ICB, crus breve) des Amboß (i) durch das hintere Band befestigt ist (nicht gezeigt). Asterisk, Muskel Prozess der Steigbügel. (B) Steigbügels nach Entfernen des Incus. Nadelspitze wird verwendet, um die Steigbügel Arterie zu schneiden (SA). Pfeil, Richtung des Blutflusses. Die gestrichelte Linie zeigt Gelenkfläche des Steigbügels. (C) Die Steigbügel Arterie aus dem Steigbügel entfernt. X zeigt die abgeschnittene Ende des Steigbügel Arterie (SA). (D) Das ovale Fenster (Ow, ovalen Fenster oder fenestra vestibuli) sichtbar ist nach dem Entfernen der Steigbügel. Rw, runde Fenster (runden Fensters oder fenestra Cochlea). Maßstabsbalken, 0,5 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen</a>Zahl. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ausrichten der Auditory Bulla und Kapsel während der Einbettung für Longitudinal (parasagittal, A - C) und horizontale (D - E) Sectioning des Malleus. (A - C) Der Hals und Quer Lamina des Hammers angeordnet sind parallel zum Boden des Tellers einzubetten. (A) Seitenansicht: Mikro-CT - Bild zu zeigen Einbettung des rechten Malleus in der Bulla (pseudocolored blau). Der Hammer und Amboß sind pseudocolored grün. Eine gestrichelte Linie, die gewünschte Schnittebene. Durchgezogene Linie, Schalenboden eingebettet ist. m, Malleus; Pfeilspitzen, Rückenkamm. M, medial; L, lateral; D, dorsale; V, ventralen. (B) Draufsicht: Micro-CT - Bild. Beachten Sie, dass das vordere Ende des Bulla (styliform Prozess) entfernt wurde. i, Amboß. (C) Draufsicht: Aufnahme (mit AAFarbfilter). AC, vordere (superior) Bogengang; Sf, subarcuate Fossa; Sp, styliform Prozess. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. (D - F) Der Processus brevis des Hammers senkrecht Schale der Einbettung auf den Boden gelegt. (D) Seitenansicht: Micro-CT - Bild Einbettung des rechten Malleus zu zeigen. Eine gestrichelte Linie, die gewünschte Schnittebene. Durchgezogene Linie, Schalenboden eingebettet ist. (E) Draufsicht: Micro-CT - Bild. mM, malleal manubrium. (F) Draufsicht: Aufnahme (mit einem Farbfilter aufgenommen). Maßstabsbalken, 1 mm. Micro-CT - Bilder wurden in einem Voxel Auflösung von 5 um, erhalten wie zuvor beschrieben 7. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> Fild 5. Histologie. (A) H &amp; E - Färbung. Längs (parasagittal) Abschnitt der in Paraffin eingebetteten rechts Malleus (m) im auditorischen Bulla (gepunktete Linie) bei P14. TM, Trommelfell. (B) Calcein Knochen Kennzeichnung. Längsschnitt des gefrorenen, unentkalkte links Malleus (m) im auditorischen Bulla bei P21. Counterstain, DAPI. (C) H &amp; E - Färbung. Horizontalschnitt des gefrorenen, unentkalkte links malleal Processus brevis (mPB) im auditorischen Bulla und Kapsel (5 Wochen alten Maus). Co, Cochlea. Maßstabsbalken, 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Abbildung 6. Mediale Ansicht der Gehörknöchelchen. (A) rechts Gehörknöchelchen von P31 Maus. A, vordere; P, posterior; D, dorsale; V, ventralen. Maßstabsbalken, 1 mm. Malleus Kopf (Caput mallei, Capitulum mallei); Hals (Collum mallei); Lamina (transversal Lamina); mM (Manubrium mallei); schwarzer Stern (muskuläre Prozess des Hammers); MPa (Processus anterior Processus gracilis); mPB (Processus brevis); incus Körper (Corpus incudis); ICB (Crus breve, kurz Crus, kurze Prozess); iCL (Crus longum, lange Crus, langer Prozess); IPL (Processus lenticularis, Lentikular-Prozess, Sylvian apophysis); Steigbügelkopf (Caput stapedis); weiß Sternchen (muskuläre Prozess des Steigbügels); sCA (Crus anterius, vordere Crus); scp (Crus posterius, posterior Crus); Basis (Basis stapedis, Fußplatte); SOF (Hüftbeinloch, intercrural Foramen). (B) Recht Gehörknöchelchen eines 76-jährigen weiblichen Menschen ( mit freundlicher Genehmigung von Institut für Anatomie, Keio University School of Medicine). Die Gehörknöchelchen der P31-Maus (unten rechts) in der gleichen Vergrößerung abgebildet wird, wie es für die menschliche Gehörknöchelchen verwendet. Curved Pfeile zeigen den Winkel zwischen der anatomischen Achse und dem Manubrium (gepunktete Linien). Maßstabsbalken, 2 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

30.0K Aufrufe.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Serie: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Forschung

Biotechnik

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neurowissenschaften

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medizin

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Entwicklungsbiologie

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

Dissektion der Auditory Bulla in postnatale Mäuse: Die Isolierung der Gehörknöchelchen und histologische Analyse

Zusammenfassung

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Ein Protokoll für einem Maus Cochleae für das Innenohr Tissue Engineering

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Bewertung der Planar-Cell-Polarity Phänotypen in Ziliopathie Maus-Mutanten-Cochlea

Kryosektion und Immunfärbung von Innenohrgewebe von Mäusen: vom Embryonalstadium bis zum Erwachsenenstadium

Cochlea-Implantat-Chirurgie und elektrisch evozierten Auditory Brainstem Response Aufnahmen bei C57BL/6 Mäusen

Morphologische und funktionelle Bewertung von Bandsynapsen an bestimmten Frequenzregionen der Maus cochlea

Cochlea-Oberflächenvorbereitung in der Erwachsenenmaus

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen

Dissektion des endolymphatischen Sacks von Mäusen