The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Pe&#241;a for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.

<ol>
	<li>Motz, G. T., Coukos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+and+reversing+tumor+immune+suppression.">Deciphering and reversing tumor immune suppression.</a> Immunity. 39 (1), 61-73 (2013).</li><li>Akkaya, M., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+pathogens+drive+the+evolution+of+paired+receptors?.">How do pathogens drive the evolution of paired receptors?.</a> Eur J Immunol. 43 (2), 303-313 (2013).</li><li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+activation.">T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 27, 591-619 (2009).</li><li>Dinarello, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+cytokines.">Proinflammatory cytokines.</a> Chest. 118 (2), 503-508 (2000).</li><li>Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+B+cells.">Memory B cells.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fueling+immunity:+insights+into+metabolism+and+lymphocyte+function.">Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function.</a> Science. 342 (6155), 1242454 (2013).</li><li>Gerriets, V. A., Rathmell, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+pathways+in+T+cell+fate+and+function.">Metabolic pathways in T cell fate and function.</a> Trends Immunol. 33 (4), 168-173 (2012).</li><li>Doughty, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+receptor-mediated+changes+in+glucose+metabolism+in+B+lymphocytes:+role+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling+in+the+glycolytic+control+of+growth.">Antigen receptor-mediated changes in glucose metabolism in B lymphocytes: role of phosphatidylinositol 3-kinase signaling in the glycolytic control of growth.</a> Blood. 107 (11), 4458-4465 (2006).</li><li>Caro-Maldonado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+reprogramming+is+required+for+antibody+production+that+is+suppressed+in+anergic+but+exaggerated+in+chronically+BAFF-exposed+B+cells.">Metabolic reprogramming is required for antibody production that is suppressed in anergic but exaggerated in chronically BAFF-exposed B cells.</a> J Immunol. 192 (8), 3626-3636 (2014).</li><li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption.">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods Enzymol. 542, 125-149 (2014).</li><li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate.">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> J Vis Exp. (106), e53464 (2015).</li><li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets,+lymphocytes,+monocytes,+and+neutrophils,+and+the+oxidative+burst+from+human+blood.">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li><li>Klein, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+different+cell+isolation+techniques+on+lymphocyte+viability+and+function.">Impact of different cell isolation techniques on lymphocyte viability and function.</a> J Immunoassay Immunochem. 27 (1), 61-76 (2006).</li><li>Hsueh, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Splenic+B+Lymphocytes.">Purification and Characterization of Mouse Splenic B Lymphocytes.</a> AfCS Research Reports. 1 (1), 1-11 (2012).</li><li>Zambrano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+ex+vivo+expansion+and+differentiation+of+naive+murine+CD43+B+splenocytes.">Prolonged ex vivo expansion and differentiation of naive murine CD43 B splenocytes.</a> Biotechnol Prog. , (2016).</li><li>Costa, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+rare+populations+of+murine+antigen-specific+T+lymphocytes+by+retroviral+transduction+for+potential+application+in+gene+therapy+for+autoimmune+disease.">Targeting rare populations of murine antigen-specific T lymphocytes by retroviral transduction for potential application in gene therapy for autoimmune disease.</a> J Immunol. 164 (7), 3581-3590 (2000).</li><li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers.">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li><li>Schneider, D. F., Glenn, C. H., Faunce, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+lymphocyte+subsets+and+their+immunoregulatory+roles+in+burn+injury+and+sepsis.">Innate lymphocyte subsets and their immunoregulatory roles in burn injury and sepsis.</a> J Burn Care Res. 28 (3), 365-379 (2007).</li><li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+lymphoid+organs.">Removal of lymphoid organs.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 1, Unit 1 9 (2001).</li><li>Akkaya, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple,+Versatile+Antibody-Based+Barcoding+Method+for+Flow+Cytometry.">A Simple, Versatile Antibody-Based Barcoding Method for Flow Cytometry.</a> J Immunol. 197 (5), 2027-2038 (2016).</li><li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects.">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> J. Clin. Invest. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li><li>Wick, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+Primary+Metabolic+Block+Produced+by+2-Deoxyglucose.">Localization of the Primary Metabolic Block Produced by 2-Deoxyglucose.</a> J. Biol. Chem. 224 (2), 963-969 (1957).</li><li>Linnett, P. E., Beechey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+the+ATP+synthetase+system.">Inhibitors of the ATP synthetase system.</a> Methods Enzymol. 55, 472-518 (1979).</li><li>Terada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncouplers+of+oxidative+phosphorylation.">Uncouplers of oxidative phosphorylation.</a> Environmental Health Perspectives. 87, 213-218 (1990).</li><li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements.">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PLOS ONE. 11 (3), e0152016 (2016).</li><li>Lai, L., Alaverdi, N., Maltais, L., Morse, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cell+surface+antigens:+nomenclature+and+immunophenotyping.">Mouse cell surface antigens: nomenclature and immunophenotyping.</a> J Immunol. 160 (8), 3861-3868 (1998).</li><li>Gerberick, G. F., Cruse, L. W., Miller, C. M., Sikorski, E. E., Ridder, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+modulation+of+T+cell+memory+markers+CD62L+and+CD44+on+murine+draining+lymph+node+cells+following+allergen+and+irritant+treatment.">Selective modulation of T cell memory markers CD62L and CD44 on murine draining lymph node cells following allergen and irritant treatment.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 146 (1), 1-10 (1997).</li><li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production.">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochim. Biophys. Acta - Bioenergetics. 1847 (2), 171-181 (2015).</li><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+metabolism+drives+immunity.">T cell metabolism drives immunity.</a> J Exp Med. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests. Open Access fees for this article were provided by Agilent Technologies.

Das Protokoll, entwickelten wir für die effiziente Isolierung von reinem und tragfähige Lymphozytensubpopulationen erlaubt, die anschließend bei verschiedenen Konzentrationen in extrazellulären Flussanalyse wurden verwendet, um die Unterschiede in der Glykolyse und der mitochondrialen Atmungsleistung zu bewerten. Dieses Protokoll ist speziell für Lymphozyten und adressiert die spezielle Überlegungen zu dieser Zelltypen im Zusammenhang, wie niedrige basale metabolische Aktivität, Zerbrechlichkeit, niedrige Frequenz, und ihre Unfähigkeit zu Testplatten haften. Daher kann im Vergleich zu bisher veröffentlichten Protokolle 11,12 unsere Methode bietet eine bequemere und besser optimierte Führung für Forscher auf dem Gebiet der Immunologie arbeiten. Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll, einschließlich der immer rein und lebensfähige Zellpopulationen, die Plattierung der Zellen bei optimalen Zusammen und Standardisierung der extrazellulären Flusstestmessungen an die Proteinkonzentration in jeder Vertiefung. Das initial Anzahl von Zellen plattiert konnte sowohl durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden und auch Proteinkonzentration Messungen quantifiziert werden. Die lineare Korrelation zwischen der Zellzahl und die Proteinkonzentration bestätigt, dass die Proteinkonzentration in der Tat als ein Weg verwendet werden kann, um die Auswirkungen von Veränderungen in der Zellzahlen zwischen verschiedenen Vertiefungen zu standardisieren. Durch die Standardisierung der ECAR und OCR - Ergebnisse zu den Proteinkonzentrationen, haben wir gezeigt , dass trotz geringerer Zellkonfluenz, so wenig wie 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in den meisten Assays verwendet werden, um die Qualität der Daten , ohne Kompromisse. Jedoch ist die untere Grenze von Zellen, die zwischen den Zelltypen und Assays verwendet werden, können variiert werden. Zum Beispiel, während so wenig wie 1,25 x 10 5 Zellen für die B - Zell - OCR - Messungen verwendet werden könnten, auch 2,5 x 10 5 Zellen / waren nicht gut genug , um die glykolytischen Leistung des gleichen Zelltyps zu bewerten. Daher, solange die Zellzahl ist kein begrenzender Faktor, Plattieren bei über90% Konfluenz, was etwa 5 entspricht x 10 5 Lymphozyten / Napf, bevorzugt. Eine weitere Optimierung kann erforderlich werden, wenn die Zellen in verschiedenen Größen-wie zuvor aktivierte und teilweise differenzierten Lymphozyten-Einsatz. Zusätzlich kann, wenn zuvor kultivierten primären Lymphozyten verwendet, könnte es eine Variation in der Zelllebensfähigkeit zwischen den verschiedenen Behandlungsbedingungen sein, was die Zuverlässigkeit der Proteinkonzentration als Maß für die Zellzahl seit toten oder sterbenden Zellen auf die gemessenen Proteinspiegel kann auch dazu beitragen, verringern würde . In solchen Fällen kann es hilfreich sein, lebende Zellen durch die Strömung zu sortieren Zytometrie, bevor die extrazellulären Fluss-Assays durchgeführt wird. In unseren Tests frisch isolierten und stark tragfähige Lymphozyten-Populationen verwenden, erhalten wir eine zuverlässige Funktionsdaten für beide OCR und ECAR Messungen. Während alle Zelltypen in ähnlicher Weise in der mitochondrialen Stresstest verhalten haben, ergaben sich deutliche Unterschiede zwischen Zelltypenin der Glykolyse Stresstest beobachtet. Zum Beispiel war die Glykolyse-Leistung von naiven T-Zellen gering im Vergleich zu Splenozyten oder B-Zellen, und es hat nicht mit dem Zusatz von Oligomycin ändern. Diese Beobachtung steht im Einklang mit den zuvor veröffentlichten Studien 7,30, die Gültigkeit unseres Protokolls bestätigt. Abschließend unser Verfahren bietet eine effiziente und bequeme Weise die Stoffwechselaktivität der Lymphozyten von Testen eines extrazellulären Fluss Analysator verwenden, und es kann in einem breiten Spektrum von immunologischen Studien Erforschung der metabolischen Veränderungen in Immunzellen bei Aktivierung, Zelldifferenzierung oder durch nützlich sein, zu Krankheitsphänotypen wie Infektionen, Autoimmun- und malignen hämatologischen Erkrankungen.

Die Immunantwort gegen Antigene ist ein streng reguliert Gleichgewicht zwischen Immunaktivierung und Immununterdrückung. Immunaktivierung treibt schnelle Zellproliferation und Migration sowie Produktion von Zytokinen, Antikörper Sekretion und erhöhte Phagocytose in Reaktion auf das Stimulans, während Immunsuppression einfach diese Ereignisse hemmt und daher ist wichtig in 1-6 unnötige Immunreaktionen zu verhindern. Jüngste Studien haben gezeigt , dass eine direkte Verbindung zwischen dem Aktivierungsstatus von Immunzellen und die Aktivität verschiedener Stoffwechselwege 7 existiert. Immunzellen können durch Umschalten Energie erzeugenden Wege ein- und ausgeschaltet zwischen ruhenden und aktivierten Zustände verschieben. Weiterhin wurde beobachtet, dass verschiedene Immunzelltypen verschiedene Stoffwechselstrategien verwenden kann ihre erhöhte Energiebedarf während der Aktivierung Kraftstoff. Während zum Beispiel die Aktivierung von T - Lymphozyten richtet Zellen in einem fast vollständig glykolytischen Zustand 8 </sup&gt;, aktivierte B - Lymphozyten verwenden , um ein Gleichgewicht der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung 9,10. Diese Studien weisen darauf hin, wie wichtig die Auswirkungen der Immunzellaktivierung auf den Zellstoffwechsel zu untersuchen. Echtzeit, gleichzeitige Messungen der Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und der extrazellulären Ansäuerungsrate (ECAR), als Indikatoren für oxidativen Phosphorylierung und der Glycolyse, ist eine gemeinsame Strategie , um die Zustände der Energieerzeugungspfade 11-13 zu adressieren. Um diese 96, eine extrazelluläre Fluss-Analysator, wie beispielsweise die Seahorse XF zu erreichen, wird routinemäßig eingesetzt. Ein solches Instrument kann Veränderungen in der OCR und ECAR über Zelltypen oder auf verschiedenen Stimulationsbedingungen schnell zu vergleichen. Bisher sind verschiedene Zelltypen, einschließlich Immunzellen wurden unter Verwendung dieser Vorrichtungen untersucht. Jedoch speziell ein optimiertes Protokoll für Immunzellen ausgelegt ist nicht verfügbar. Immunzellen, insbesondere von Lymphozyten, unterscheiden sich von otihre Zelltypen in mehrere kritische Weise. Lymphozyten sind fragile Zellen , die 14 bis 16 für längere Zeit in ex vivo Bedingungen nicht überleben. Dies ist ein noch größeres Problem, wenn sie kultiviert werden in suboptimalen Wachstumsmedien essentielle Nährstoffe fehlen, wie sie in der extrazellulären Flussanalyse verwendet. Im Gegensatz zu vielen Makrophagen und Zelllinien, Lymphozyten haften nicht an Kunststoffoberflächen; Daher ist es wichtig, sie auf die Analyseplatte zu befestigen, ohne Stress zu erzeugen. Schließlich können einige Lymphozytensubpopulationen extrem selten sein und sie bei den erforderlichen, optimalen Mengen Ernte könnte eine Herausforderung sein 17-19. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll, das speziell für Lymphozyten entwickelt wird. Mit Splenozyten, B - Lymphozyten und naive CD4 + T - Lymphozyten isoliert aus Maus - Milz und Lymphknoten 20 zeigen wir die Eigenschaften ihrer Ruhezustand Glykolyse und oxidative Phosphorylierung an different Zelldichten. Daten wurden normalisiert für die Unterschiede in der anfänglichen Zellzahlen zu berücksichtigen und für jeden durch das Ende Assay Zellysat-Protein-Konzentrationen, die zu den Zellzahlen direkt proportional waren. Unser Protokoll bietet nicht nur Richtlinien für die schnelle Isolierung von lebensfähigen Lymphozyten für extrazellulären Fluss-Assays, sondern erlaubt es auch für bei suboptimalen Zellkonzentrationen arbeiten, ohne dass die Datenqualität zu beeinträchtigen.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7.2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>To make MACS buffer</td></tr><tr><td>autoMACS rinsing solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contains phenol red and L-glutamine</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 &amp;deg;C water bath and then inactivate at 56 &amp;deg;C for 30 min. Aliquot heat-inactivated serum for storage (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, in 50 ml conical tubes) and freeze at -20 &amp;deg;C until needed.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500 ml media, make a total of 12 ml Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 &amp;deg;C until ready to make media.</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Component of RF10 and stress test media</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Component of RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Monoject 3 ml Syringe, Luer-Lock Tip</td><td>Covidien</td><td>8881513934</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tubes&amp;nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &amp;mu;m cell filter, sterile, single-packed</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>B Cell Isolation Kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>Na&amp;iuml;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T cell isolation kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>LS Column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Used in cell isolation</td></tr><tr><td>MidiMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnet for separation</td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Holder for magnets</td></tr><tr><td>autoMACS Rinsing Solution</td><td></td><td>130-091-222</td><td>Rinsing solution for autoMACS Pro Separator</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator Instrument</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Supplied as 100x cocktail, combine with RIPA to form 1x solution for lysis.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Follow manufacturer&#039;s instructions</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution.</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Used to prepare stress test media</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 &amp;mu;m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Used to sterile filter media.</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>Dissolved to 0.1 M and used to dilute Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

an optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes

Lymphocyten reagieren auf eine Vielzahl von Stimuli durch intrazelluläre Signalwege zu aktivieren, was zur schnellen Zellproliferation, Migration und Differenzierung wiederum führt und Zytokinproduktion. Alle diese Ereignisse sind eng mit dem Energiestatus der Zelle verbunden sind, und daher Hinweise auf die gesamte Funktionalität dieser Zellen geben kann, die Energie erzeugenden Wege zu studieren. Die extrazelluläre Flußmittel Analysator ist eine häufig verwendete Vorrichtung die Leistung der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in vielen Zelltypen zur Auswertung. Dieses System verwendet worden ist Immunzellen in einigen veröffentlichten Berichten zu studieren, noch ein umfassendes Protokoll optimiert besonders für Lymphozyten fehlt. Lymphozyten sind fragile Zellen , die schlecht in ex - vivo - Bedingungen zu überleben. Oft Lymphozytensubpopulationen sind selten, und die Arbeit mit niedrigen Zellzahlen ist unvermeidlich. Somit wird eine experimentelle Strategie, die diese Schwierigkeiten Adressen erforderlich. Hier bieten wir ein Protokolldass ermöglicht eine schnelle Isolation von lebensfähigen Lymphozyten aus lymphoiden Geweben und für die Analyse ihrer Stoffwechselzustände in den extrazellulären Flußmittel Analysators. Darüber hinaus stellen wir die Ergebnisse von Experimenten, in denen die Stoffwechselaktivitäten von mehreren Lymphozyten-Subtypen bei verschiedenen Zelldichten verglichen. Diese Beobachtungen legen nahe, dass unser Protokoll verwendet werden kann, konsistente und gut standardisierten Ergebnisse auch bei niedrigen Zellkonzentrationen zu erreichen, und somit kann sie haben breite Anwendungen in zukünftigen Studien zur Charakterisierung der metabolischen Ereignissen in Immunzellen konzentriert.

Eukaryotische Zellen verwenden, um ein integriertes Netzwerk von Glykolyse, die Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus, und die oxidative Phosphorylierung zu treffen, um die Mehrheit ihrer Energiebedarf und Zwischenprodukte für das Zellwachstum und die Proliferation erforderlich ist. Diese Wege beginnen mit dem intrazellulären Einfangen von freier Glucose in Form von Glucose-6-phosphat, die anschließend in Pyruvat verarbeitet wird. Pyruvat wird entweder reduziert zu Lactat oder in die Mitochondrien transportiert, wo es Acetyl-Coenzym A (CoA) bildet. Acetyl-CoA tritt dann in den TCA-Zyklus. Hochenergetische Zwischenprodukte des Citratzyklus die Bewegung von Elektronen in der Elektronentransportkette (ETC) antreiben, die wiederum H + aus der mitochondrialen Matrix ausstößt einen H + -Gradienten über die innere Mitochondrienmembran zu erzeugen. Sauerstoff wirkt als die endgültige Elektronenakzeptor und H + wieder zurück in die mitochondriale Matrix durch die F O / F &lt;sub&gt; 1 - Komplex, wo ihre potentielle Energie verwendet wird ATP (1A) zu erzeugen. Das Arbeitsprinzip der extrazellulären Fluss Assay hängt mit der Glykolyse und oxidative Phosphorylierung an spezifischen Punkten auf störende und Bewertung der daraus resultierenden Effekte. Zu diesem Zweck verwendeten wir Glucose Glykolyse in ausgehungert Zellen zu vermehren, und 2-Desoxyglucose (2-DG), die auf 2-Desoxyglucose-6-phosphat, einem kompetitiven Inhibitor von Phosphoglucoisomerase umgewandelt 23, Hexokinase, um zu blockieren , Glykolyse. Rotenon (komplexe I-spezifischer Inhibitor des ETC), Antimycin A (komplexe III-spezifischen Inhibitor des ETC), Oligomycin (Inhibitor der ATP - Synthase 24) und die Entkopplungsmittel 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 waren In den elektronen~~POS=TRUNC, Protonengradienten und ATP - Synthese (1A) im Zusammenhang verwendet , um spezifische Ereignisse zu intervenieren. Anstelle von 2,4-DNP, Carbonyl cyanid-4- (trifluormethoxy) phenylhydrazon (FCCP) kann auch verwendet werden, aber eine weitere Optimierung erforderlich. In jedem Fall ist die optimale Konzentration erforderlich, um zu bestimmen Entkuppler sollte immer vor der Verwendung für einen bestimmten Zelltyp titriert werden. Die Glykolyse Stresstest (Abbildung 1B) beginnt mit einer Baseline - Messung der extrazellulären Ansäuerung Rate (ECAR) in den zuvor ausgehungert Zellen. Da diese Zellen in ihrem basalen minimal sind, und kann daher praktisch als nicht glykolytischen betrachtet werden, die ECAR an dieser Stelle gemessen wird, als nicht-glykolytischen Ansäuerung bezeichnet. Diese Ansäuerung entspricht wahrscheinlich die Atmungs CO 2 in dem TCA - Zyklus erzeugt HCO umgewandelt wird 3 - und H +. Dies wird durch die Injektion von Glucose, gefolgt Glykolyse zu aktivieren, die als eine Zunahme in der extrazellulären Ansäuerung stellt aufgrund der Bildung von Lactat.Dieser Anstieg stellt die normale Rate der Glykolyse. blockier die Erzeugung von ATP durch oxidative Phosphorylierung Die Zellen werden dann mit der Injektion von Oligomycin, in Frage gestellt. Zellen reagieren auf diese dramatische Abnahme der ATP-Produktion durch Glykolyse auf seinen maximalen Pegel zu aktivieren, und das führt zu einer sekundären Erhöhung der ECAR Ebene (Glykolyse-Reserve). Der Test wird durch vollständige Hemmung der Glykolyse mit dem Glukose analogen 2-DG, beendet die die ECAR in seinen nicht glycolytic Niveau zurückkehrt. Interessanterweise ist vorgeschlagen worden , dass im Gegensatz zu den Empfehlungen des Herstellers wird maximal Glycolyse nicht notwendigerweise durch die Injektion von Oligomycin 26 erreicht. In Zellen mit einer hohen glykolytischen Kapazität, wenn kein signifikanter Anstieg in ATP Nachfrage ist, kann Glykolyse durchaus in der Lage sein, mit dem Verlust des mitochondrialen ATP zu bewältigen, ohne sie benötigen hochreguliert zu sein. Die Glykolyse-Rate mit Oligomycin konnte durch Zugabe von Atmungshemmer übertroffen werdenWie Rotenon und Myxothiazol, die einige Vorteile gegenüber Oligomycin bieten: 1) Sie erhöhen die ATP Nachfrage, da sie die Umkehrung der ATP - Synthase, mit der ATP - Hydrolyse verursachen, Protonen in einem Versuch zu pumpen das mitochondriale Membranpotential 26 zu erholen; 2) Sie verhindern, dass Atem Ansäuerung des Mediums, das die ECAR Ergebnisse durcheinander bringen können (siehe unten). Andere Wege ATP Nachfrage zu erhöhen , umfassen die Zugabe von Verbindungen, die die Hydrolyse von ATP durch die Plasmamembran ATPasen 26 stimulieren. All dies sollte sorgfältig von den Forschern in Betracht gezogen werden, wenn ein Glykolyse Stresstest zu planen. Die mitochondrialen Stresstest (1C) beginnt mit einer Baseline - Messung des Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) in nicht ausgehungert Zellen. Dies wird durch die Injektion von Oligomycin gefolgt, die die Rückkehr der Protonen durch die F O / F 1 - Komplex hemmt und somit schnell hyperpolarizes die Membran der Mitochondrien. Hyperpolarisation verhindert ein weiteres Proton durch Atmungskomplexe Pumpen, und die Atemfrequenz nimmt ab. Die verbleibende Atmung Protonenleck bezeichnet, die den Fluss der Protonen durch Lipide oder andere Kanäle darstellt. Diese hyperpolarisierten Zustand wird durch die Zugabe des Entkopplungsmittel 2,4-DNP, die als Protonen Ionophor wirkt schnell umgekehrt. Als Reaktion darauf versuchen Zellen das Membranpotential in einem vergeblichen Versuch, sich zu erholen, indem die Elektronentransportrate zu seiner maximalen Erhöhung und dies wiederum erhöht die OCR. Schließlich mit dem Zusatz von zwei ETC-Inhibitoren (Antimycin A und Rotenon) vollständig mitochondriale Atmung stoppt und OCR sinkt auf sein niedrigstes Niveau. Auf dieser Ebene ist der Sauerstoffverbrauch aufgrund mitochondriale Aktivität (nicht-mitochondriale). Der Unterschied in der durch diese Inhibitoren erzeugten OCR wird die maximale mitochondrialen Atmung, genannt, die die Summe der Basislinie der Atmung und der Reservekapazität. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; B und T - Zell - Isolationen Ausbeute sehr tragfähige reine Lymphozyten - Populationen. B - Zellen und naiven CD4 + T - Zellen wurden wie in Abschnitt 4 des Protokolls skizziert isoliert und Splenozyten wurden einfach durch Lysieren der roten Blutkörperchen erhalten , wie in Abschnitt 3.3 beschrieben. Die Empfindlichkeit der Zelltyp-spezifischen metabolischen Assays hängt von der Lebensfähigkeit und der Reinheit der Ausgangszellpopulation. Daher ist , um die Lebensfähigkeit der isolierten Maus - T - Zellen zu überprüfen, Splenozyten und B - Zellen, und die Reinheit von T- und B - Zellen, kleine Aliquots der Zellen wurden für die durchflusszytometrische Analyse (Abbildung 2) gefärbt. In der Vorwärtsstreuung-Bereich vs. Seitenstreubereich (FSC-A vs. SSC-A) Plot wurden Lymphozyten gated, und innerhalb dieses Tor, die Bevölkerung entlang der Diagonale in der Vorwärtsstreuung-height (FSC-H) gegen FSC-A-Grundstück wurden als Singuletts bestimmt. Innerhalb der Singulettpopulation wurde Lebensfähigkeit gemessen , indem die Zellen Gating, die für die Live / Dead - Marker (2A) negativ gefärbt; T-Zell-Lebensfähigkeit betrug 97,9%, Splenozyten- Lebensfähigkeit betrug 92%, und B die Lebensfähigkeit der Zellen betrug 94%. B - Zell - Reinheit, gemessen durch den B220 + CD19 + -Population 26, betrug 99%, während die CD4 + T - Zell - Reinheit, wie durch das CD44 gemessen - CD4 + -Population 27, betrug 98,3% (2B). Die Proteinkonzentration des Zelllysats kann als direkter Indikator für plattierte Zellzahl verwendet werden. Isolierte Lymphozyten und Splenozyten wurden bei 5 x 10 5 Zellen / Vertiefung in einem Klebstoff beschichteten 96-Well - Assayplatte plattiert, 2,5 x 10 5 Zellen / Vertiefung, 1,25 x 10 5 Zellen / Vertiefung und 0,625 x 10 <sup&gt; 5 Zellen / Vertiefung. Der Zusammenfluss an jeder Plattierungsdichte der drei Zelltypen wurde unter dem Lichtmikroskop (3A) sichtbar gemacht . Wie erwartet, Einmündung in den anfänglichen Plattierung Dichten korreliert. Nach Abschluss der extrazellulären Fluss Assay wurden plattierten Zellen lysiert und deren Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Assay quantifiziert. Für alle Zelltypen wurden Lysat Proteinkonzentrationen gezeigt linear mit der anfänglichen Beschichtungsdichten (3B) korreliert werden, die die Konzentrationen Lysat - Protein bestätigt , kann als ein genaues Maß für die Normalisierung der Zellzahlen verwendet werden , wenn die extrazellulären Flussdaten zu interpretieren. Die Beschichtungsdichten in diesem Experiment verwendet wurden naive, unstimulierte Lymphozyten optimiert. Wenn stimuliert oder zuvor kultivierten Zellen verwendet werden sollen, kann eine weitere Optimierung erforderlich. Mitochondriale und glycolytic stress-Assays sind abhängig von plattierten Zellzahl. Die OCR wurde für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte in der extrazellulären Flußmittel gemessen. Wie erwartet, haben höhere Zellzahlen eine höhere Mess OCR sowie dramatischer Reaktionen auf Oligomycin, 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon (4A). OCR Standardisieren Messungen an einzelnen Proteinkonzentration der Probe zeigt, dass in der Regel eine größere Anzahl von Zellen führen zu genaueren OCR-Messungen. Plattierung bei 5 und 2,5 x 10 5 Zellen / resultierte auch in ähnlicher normalisierten OCR Messungen in den T - Zellen und Milzzellen und 5 und 1,25 x 10 5 Zellen / resultierte auch ähnliche normalisierten OCR Messungen in B - Zellen (4B). Die geringen Unterschiede in der normalisierten B - Zell - OCR Messungen könnte ein indirektes Anzeichen dafür sein , dass B - Zellen mit 2,5 × 10 5 Zellen bessere Leistung / well im Vergleich zu anderen Zelldichten. Mit allen Maßnahmen, 0,625 x 10 5 Zellen / Vertiefung gab suboptimalen Ergebnissen, die zeigen , dass diese Plattierungsdichte unzureichend ist. Baseline - Atmungs, Protonenleck, maximale mitochondrialen Atmung, nicht-mitochondrialen Atmung und ATP Produktion linear mit der Beschichtungsdichten für alle Zelltypen (4C) korreliert. Zusätzlich wird der größte Teil der Basislinie Atmung verwendet ATP zur Synthese, wie durch die geringe Protonenleck in den drei Zelltypen angegeben. Während der primäre Fokus des Experiments mitochondrialen Stress Veränderungen in OCR zu messen, ist die ECAR nützlich noch aufzuzeichnen, daß der Test, um sicherzustellen, wurde erfolgreich durchgeführt. Ähnlich wie bei der OCR, die beiden höheren Plattierung Dichten führte zu höheren ECAR und dramatischer Reaktionen auf Oligomycin, 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon (4D). Die dramatischen Veränderungen in ECAR bei der Zugabe von 2,4-DNP und Antimycin A / Rotenon kann bei der Atmung zusätzlich zu den Änderungen in g aufgrund von Änderungen seinlycolysis, da CO 2 in dem TCA - Zyklus erzeugt wird, HCO 3 umgewandelt - und H +. Dieses Problem wurde vor kurzem angesprochen, und es gibt eine einfache Methode für die gesamte extrazelluläre Ansäuerung Signal unter Verwendung von Sauerstoffverbrauchsdaten zu korrigieren, die reale glykolytischen Rate 12,29 zu erhalten. Die Glykolyse Stress - Test war am erfolgreichsten bei der höchsten Plattierungsdichte (5A, B). In allen Zelltypen, die 5 x 10 5 Zellen / well Proben hatten die größten Veränderungen in ECAR nach der Zugabe von Glucose, Oligomycin und 2-DG (5B). Darüber hinaus zeigte die Proteinkonzentration zu normalisieren , dass für alle Zelltypen, die 5 x 10 5 Zellen / Well Proben optimale Ergebnisse erzielt, während niedrigere Konzentrationen-insbesondere 0,625 x 10 5 Zellen / gut nicht eine robuste glycolytic Reservekapazität anzuzeigen. Nicht glycolytic Versauerung, Glykolyse, und die scheinbare glycolytic Kapazität linear mit Überzug Dichten für alle Zelltypen (5C) korreliert. Für die Glykolyse Stress Experiment zeigt die OCR Diagramm, das Glucose stimuliert leicht mitochondrialen Atmung, die dann durch Oligomycin Behandlung inhibiert wird; die Zugabe von 2-DG hatte keinen Einfluss auf die OCR (5D). Die OCR-Grafik kann als weiterer Indikator verwendet werden, dass die Glykolyse Stress Experiment erfolgreich durchgeführt wurde. Auch kann die OCR Graph verwendet werden , um die ECAR Graph zu korrigieren, falls erforderlich, wie oben im Falle des mitochondrialen Belastungstest 12,29 erläutert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Abb . 1: Übersicht über die extrazellulären Fluss - Assays (A) Abbildung der Glykolyse (links) und die oxidative Phosphorylierung (rechts) zeigt die Wirkung desmetabolische Medikamente in den extrazellulären Flussassays verwendet. (B) Schematische Darstellung der extrazellulären Ansäuerung Rate (ECAR) Graph; Schema des Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) Diagramm (C). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Abbildung 2: Stepwise Gating von T - Zellen, B - Zellen und Splenozyten Lebensfähigkeit und Reinheit zu bestimmen Durchflusszytometrie Plots der Lebensfähigkeit von T - Zellen, Splenozyten und B - Zellen (A) zeigt; und Reinheit von T- und B - Zellen (B). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version zu sehen th</a>Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Fig . 3: Die Zellkonfluenz korreliert mit dem Lysat Proteinkonzentrationen einer jeden Zelltyps bei verschiedenen plating Dichten (A) Lichtmikroskopische Aufnahmen von Zellen in Assayplatte Vertiefungen bei plating Dichten im Bereich von 5 x 10 5 Zellen / well bis 0,625 x 10 5 Zellen / Gut. Maßstabsbalken bezeichnen 50 &amp; mgr; m. (B) Lysate Proteinkonzentrationen bei verschiedenen Beschichtungsdichten, wie durch den BCA - Assay gemessen. Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Abbildung 4:<html> Mitochondriale Stress - Test. Raw (A) und standardisiert (B) OCR für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte gezeigt. (C) Zellzahl abhängige Änderungen in der Höhe der Grundlinie, die maximale mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Atmung, sowie die Sauerstoffverbräuche verbunden Protonenleck oder ATP - Produktion, werden für jede Zelltypen gezeigt. (D) Raw ECAR Werte aus den mitochondrialen Stresstests erhalten werden gezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 7-8 Vertiefungen mit Standardabweichung. Markierten Pfeile bezeichnen Injektionen von Oligomycin (O), 2,4-DNP (D) und Rotenon / Antimycin A (R / A). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5:. Glykolytische Stress - Test Raw (A) und standardisiert (B) ECAR für jeden Zelltyp und Plattierungsdichte gezeigt. (C) Zellzahl abhängige Änderungen in ECAR für nicht glykolytischen Ansäuerung, Glucose-induzierte Glykolyse und die Gesamtkapazität glykolytischen gezeigt. (D) Raw OCR - Werte aus den Glykolyse - Stresstests erhalten werden gezeigt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von 7-8 Vertiefungen mit Standardabweichung. Markierten Pfeile bezeichnen Injektionen von Glucose (G), Oligomycin (O) und 2-Desoxyglucose (2-DG). Die Ergebnisse sind von mindestens drei unabhängigen Experimenten repräsentativ. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Ein optimiertes Protokoll zur Analyse der Glykolyse und der mitochondrialen Atmung in Lymphozyten | Immunologie und Infektion | Video

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

Ein optimiertes Protokoll Glykolyse und die mitochondriale Atmung in Lymphozyten zu analysieren

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

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Serie: An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Analysis of Hematopoietic Stem Progenitor Cell Metabolism

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a differentiation state to sustain demands of the blood formation. However, it has been difficult to analyze the metabolic status (mitochondrial respiration and glycolysis) of HSPCs due to their limited numbers and lack of optimized protocols for non-adherent, fragile HSPCs. Here, we provide a set of clear, step-by-step instructions to measure metabolic respiration (oxygen consumption rate; OCR) and glycolysis (extracellular acidification rate; ECAR) of murine bone marrow-LineagenegSca1+c-Kit+ (LSK) HSPCs. This protocol provides a higher amount of LSK HSPCs from murine bone marrow, improves the viability of HSPCs during incubation, facilitates extracellular flux analyses of non-adherent HSPCs, and provides optimized injection protocols (concentration and time) for drugs targeting oxidative phosphorylation and glycolytic pathways. This method enables the prediction of the metabolic status and the health of HSPCs during blood development and diseases.

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) transition from a quiescent state to a differentiation state due to their metabolic plasticity during blood formation. Here, we present an optimized method for measuring mitochondrial respiration and glycolysis of HSPCs.

Analyse des hämatopoetischen Stamm-Vorläufer-Zellstoffwechsels

Hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) have distinct metabolic plasticity, which allows them to transition from their quiescent state to a ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Metabolische Charakterisierung Polarized M1 und M2-Knochenmark-Makrophagen über die Echtzeit-Extrazelluläre Flußanalyse

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Immunologie und Infektion

Measuring Yeast Mitochondrial Respiration While Maintaining Cellular Context

Mitochondrial Respiration Quantification in Yeast Whole Cells

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to different nutritional and environmental conditions give valuable information to elucidate molecular mechanisms. Oxidative phosphorylation is the primary source of ATP in most cells, and mitochondrial respiration activity is a key component of oxidative phosphorylation, maintaining mitochondrial membrane potential for ATP synthesis. Mitochondrial respiration is often studied in isolated mitochondria that are missing the cellular context. Here, we present a method for quantifying mitochondrial respiration in yeast-intact cells. This method applies to any yeast species, although it has been generally used for Saccharomyces cerevisiae cells. First, the yeast growth in specific conditions is tested. Then, cells are washed and resuspended in deionized water with a 1:1 ratio (w/v). Cells are then placed in an oximeter chamber with constant stirring, and a Clark electrode is used to quantify oxygen consumption. Some molecules are sequentially placed into the chamber and selected according to this effect on the electron transport chain or ATP synthesis. ATPase inhibitor oligomycin is first added to measure respiration coupled to ATP synthesis. Afterward, an uncoupler is used to measure the maximal respiratory capacity. Finally, a mix of electron transport chain inhibitors is added to discard oxygen consumption unrelated to mitochondrial respiration. Data are analyzed using a linear regression to obtain the slope, representing the oxygen consumption rate. The advantage of this method is that it is specific for yeast mitochondrial respiration, maintaining the cellular context. It is essential to highlight that inhibitors used in mitochondrial respiration quantification could vary between yeast species.

Mitochondrial respiration in yeast whole cells is a valuable indicator of cell bioenergetics. Here, we present a protocol to quantify this phenotype applicable to different yeast species.

Metabolism is mainly coordinated by cellular energy availability and environmental conditions. Assays for knowing how cells adapt energetic metabolism to ...

Biochemie

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to promote survival, cellular proliferation, production of cytokines such as interferon gamma (IFN&#947;) and/or cytotoxicity programs. NK cell activation by cytokine stimulation requires a substantial remodeling of metabolic pathways to support their bioenergetic and biosynthetic requirements. There is a large body of evidence that suggests that impaired NK cell metabolism is associated with a number of chronic diseases including obesity and cancer, which highlights the clinical importance of the availability of a method to determine NK cell metabolism. Here we describe the use of an extracellular flux analyzer, a platform that allows real-time measurements of glycolysis and mitochondrial oxygen consumption, as a tool to monitor changes in the energy metabolism of human NK cells. The method described here also allows for the monitoring of metabolic changes after stimulation of NK cells with cytokines such as IL-15, a system that is currently being investigated in a wide range of clinical trials.

In this paper, we describe a method to measure glycolysis and mitochondrial respiration in primary human Natural Killer (NK) cells isolated from peripheral blood, at rest or following IL15-induced activation. The protocol described could be easily extended to primary human NK cells activated by other cytokines or soluble stimuli.

Analyse des menschlichen natürlichen Killerzellstoffwechsels

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

A Comprehensive High-Efficiency Protocol for Isolation, Culture, Polarization, and Glycolytic Characterization of Bone Marrow-Derived Macrophages

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. Macrophages are commonly classified as M1-like (inflammatory) and M2-like (anti-inflammatory) subtypes. M1-like macrophages are pro-inflammatory macrophages that get activated by LPS and/or pro-inflammatory cytokines such as INF-&#947;, IL-12 &#38; IL-2. M1-like polarized macrophages are involved in various diseases by mediating the host&#39;s defense to a variety of bacteria and viruses. That is very important to study LPS induced M1-like macrophages and their metabolic states in inflammatory diseases. M2-like macrophages are considered anti-inflammatory macrophages, activated by anti-inflammatory cytokines and stimulators. Under the pro-inflammatory state, macrophages show increased glycolysis in glycolytic function. The glycolytic function has been actively investigated in the context of glycolysis, glycolytic capacity, glycolytic reserve, compensatory glycolysis, or non-glycolytic acidification using extracellular flux (XF) analyzers.
This paper demonstrates how to assess the glycolytic states in real-time with easy-to-follow steps when the bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are respiring, consuming, and producing energy. Using specific inhibitors and activators of glycolysis in this protocol, we show how to obtain a systemic and complete view of glycolytic metabolic processes in the cells and provide more accurate and realistic results. To be able to measure multiple glycolytic phenotypes, we provide an easy, sensitive, DNA-based normalization method for polarization assessment of BMDMs. Culturing, activation/polarization and identification of the phenotype and metabolic state of the BMDMs are crucial techniques that can help to investigate many different types of diseases.
In this paper, we polarized the na&#239;ve M0 macrophages to M1-like and M2-like macrophages with LPS and IL4, respectively, and measured a comprehensive set of glycolytic parameters in BMDMs in real-time and longitudinally over time, using extracellular flux analysis and glycolytic activators and inhibitors.

This protocol provides detailed and comprehensive methods for the isolation, culture, polarization, and measurement of the glycolytic metabolic state of live bone marrow-derived macrophages (BMDMs). This paper provides step-by-step instructions with realistic visual illustrations for workflow and glycolytic assessment of BMDMs in real-time.

Macrophages are among the most important antigen-presenting cells. Many subsets of macrophages have been identified with unique metabolic signatures. ...

Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is indispensable for T cell activation, and the survival of memory T cells is dependent on mitochondrial remodeling. Consequently, this affects the long-term clinical outcome of cancer immunotherapies. Changes in T cell quality are often studied by flow cytometry using well-known surface markers and not directly by their metabolic state. This is an optimized protocol for measuring real-time mitochondrial respiration of primary human T cells using an Extracellular Flux Analyzer and the cytokines IL-2 and IL-15, which differently affect T cell metabolism. It is shown that the metabolic state of T cells can clearly be distinguished by measuring the oxygen consumption when inhibiting key complexes in the metabolic pathway and that the accuracy of these measurements is highly dependent on optimal inhibitor concentration and inhibitor injection strategy. This standardized protocol will help implement mitochondrial respiration as a standard for T cell fitness in monitoring and studying cancer immunotherapies.

Metabolic adaptation is fundamental for T cells as it dictates differentiation, persistence, and cytotoxicity. Here, an optimized protocol for monitoring mitochondrial respiration in ex vivo cytokine-differentiated human primary T cells is presented.

Echtzeitüberwachung der mitochondrialen Atmung in zytokindifferenzierten humanen primären T-Zellen

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

Echtzeitmessung des mitochondrialen bioenergetischen Profils von Neutrophilen

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Biologie

Analyzing Ex Vivo Metabolic Flux in Splenic and Cardiac Macrophages and Bone Marrow Monocytes

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, pro-inflammatory (i.e., M1-like) monocytes/macrophages display more reliance on anaerobic glycolysis and less reliance on mitochondrial oxidative phosphorylation, whereas anti-inflammatory (M2-like) macrophages display more reliance on glucose and fatty acid oxidation in the mitochondria. Here, we describe in-depth protocols for extracting macrophages from the two major monocyte/macrophage reservoirs in the body, the spleen and bone marrow, as well as injured tissues such as the heart following myocardial infarction.
Macrophages or monocytes are extracted by immunomagnetic sorting by using antibody-tagged microbeads, which easily bind to cells without compromising their phenotypes. The extracted cells are then cultured in 96-well plates, followed by extracellular flux analysis using a metabolic flux analyzer. Both glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation can be measured simultaneously in small numbers of cells (as little as 2-3 &#215; 105 cells). This method can easily be performed in 1 day and produces reliable and repeatable results. Ultimately, these methods help to enhance our understanding of metabolic changes during immune and inflammatory responses to injury and disease, which could lead to the development of novel therapeutic targets for immunometabolic pathways.

Here, we describe in detail methods for extracting macrophages from the bone marrow, spleen, and infarcted heart, and subsequently assessing metabolic flux in live cells.

Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

Metabolic reprogramming is a hallmark of monocyte/macrophage activation and polarization between pro- and anti-inflammatory states. For example, ...

Measuring Mitochondrial Function of Na&#239;ve and Effector CD8 T Cells

Understanding how immunometabolism impacts the function, differentiation, and fate of lymphocytes has garnered significant interest and attention. Lymphocyte biology has been explored using bioenergetic analysis and has now become a critically import tool in the field. Thus, we sought to optimize a bioenergetic analysis assay that can be adapted with pretreatments and acute injection for receptor stimulations. Here, we evaluated CD8 T cell ex vivo metabolism using the Cell Mito Stress Test to assess rates of oxygen consumption and extracellular acidification in na&#239;ve and effector CD8 T cells. Antigen-specific effector CD8 T cells were derived via ex vivo stimulation, and na&#239;ve CD8 T cells harvested from splenocytes and isolated with magnetic bead column separation. 
Pretreatments are performed in microplates and we detail how to prepare sensor cartridges. We show how injection ports can loaded with drugs to indirectly measure metabolic capacities and with metabolic modulators, this protocol can be used to study specific enzyme activity. T-cell receptor stimulations can be studied in real time with acute injection and stimulation with anti-CD3/CD28 using the injection ports. Instrument analyzers are used for measurements and data collection and data visualization is done with software programs to interpret cellular metabolism. This strategy produces an extensive amount of data on immune cell biology and mitochondrial bioenergetics allowing researchers to customize the protocol in numerous ways to explore CD8 T cell metabolism.

CD8 T cell bioenergetics can be interrogated using the Mito Stress Test. This methodology can be used to study acute and chronic metabolic programming. This protocol describes approaches to examine the relationships between T cell receptor biology and bioenergetic analysis.