This work was partly supported by NSF CBET 1227766, NSF CBET 1511759, and Byars-Tarnay Endowment. We gratefully acknowledge use of the West Virginia University Shared Research Facilities which are supported, in part, by NSF EPS-1003907.

1. Die Replikation von PDMS-Formen aus einer EBL Mold <ol><li> Fabrizieren Silikonform 29 <ol><li> Schleuderbeschichtungs 200 ul Polymethylmethacrylat (PMMA) -Lösung auf einem 1 × 1 cm Silizium (Si) -Substrat bei 2.500 rpm für 1 min um einen dünnen Film zu bilden. </li><li> Backen die PMMA-Film auf dem Si-Substrat bei 180 ° C für 2 min. </li><li> Schreiben die entworfen Nano auf der PMMA - Film durch einen fokussierten Elektronenstrahl bei einer Flächendosis von 300 &amp; mgr; C / cm 2. </li><li> Entwickeln Sie die PMMA-Nano in Entwickler für 80 Sekunden. </li><li> Hinterlegung der PMMA Nano mit einer Nickelschicht von 50 nm Dicke in eine E-beam Verdampfer bei einer Ausgangsspannung von 10 kV, Emissionsstrom von 0,5 mA und einer Abscheidungsrate von 0,5 Å / sec Verwendung. </li><li> Heben Sie den PMMA Teil in 20 ml-Entferner bei 80 ° C für 20 min ab. </li><li> Reaktives Ionenätzen (RIE) der Nano in das Si-Substrat eine Si Form der gewünschten Tiefe zu erhalten. HINWEIS: Gasgemisch aus TetRafluoromethane (CF 4) / Sauerstoff (O 2) (90% / 10%) bei einem induktiv gekoppelten Plasma (ICP) Leistung von 400 W und RIE Leistung von 150 W verwendet wird Si - Substrat zu einer Tiefe von 560 nm zu ätzen. </li></ol></li><li> Silanisieren Si Form <ol><li> Setzen Sie ein Deckglas und die Si-Form in einem 100 mm PS Petrischale und übertragen sie in einem Glas-Exsikkator in einer Abzugshaube. </li><li> Drop 10 ul 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane auf dem Deckglas. Achtung: 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane verursachen Haut Korrosion und schwere Augenschäden. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung (PSA). </li><li> Decken Sie die Petrischale teilweise. </li><li> Halten Sie den Exsikkator unter Vakuum für 5 Stunden in einem Abzug der Silanisierung der Si Form zu vervollständigen. </li></ol></li><li> Bereiten Sie PDMS-Präpolymer <ol><li> Man wiegt 10 g PDMS-Harz und 1,05 g Härter in einem Einweg-Wägeschiffchen. </li><li> Mischen Sie die PDMS-Präpolymer gründlich durch einen Plastiklöffel verwenden. </li><li> Entgasen Sie den PDMS-Präpolymer in einem Kunststoff-Exsikkator unter Vakuum etwa 20 min bis eine klare Mischung beobachtet wird. </li></ol></li><li> Replizieren PDMS Formen <ol><li> Setzen Sie die silanisierten Si Form in einer 60 mm Petrischale. </li><li> Gießen Sie die PDMS-Präpolymer auf der Si-Form in der Petrischale. </li><li> Legen Sie die Petrischale in einem Kunststoff-Exsikkator und Entgasen für etwa 10 Minuten, bis alle Blasen verschwinden. </li><li> Übertragen Sie die Petrischale auf einer Heizplatte und Härten des PDMS-Präpolymer bei 70 ° C für 4 Stunden. </li><li> Ziehen Sie die PDMS-Form von der Si-Form aus sorgfältig von einer Pinzette. HINWEIS: PDMS Formen können für bis zu einer Woche bei Umgebungsbedingungen gelagert werden. Nach dem Aushärten gibt es einige nicht vernetzten PDMS Harzmoleküle und restlichem Vernetzungsmittel in den PDMS Formen 30. Die niedermolekularen Molekülen allmählich diffundieren und sammeln sich an der Oberfläche über die Zeit. Dies wirkt sich auf die topographischen und mechanischen Eigenschaften der PDMS - Oberfläche 31. Die difFusion ist nicht signifikant innerhalb einer Woche. </li></ol></li></ol> 2. Nähen von PDMS-Formen in einem großen, einzigen Form <ol><li> Bereiten Sie mehrere PDMS Formen für Schritt 1.4 wiederholen. HINWEIS: Wiegen gleiche Menge an PDMS-Mischung jedesmal PDMS Formen von gleicher Dicke zu erhalten. </li><li> Bestimmen Sie die Ausrichtung der anisotropen PDMS Nano wie nanogratings unter einem optischen Mikroskop und markieren Sie ihn auf der Rückseite der PDMS-Formen mit einem Filzstift. HINWEIS: Es ist nicht notwendig, die Orientierung der isotropen Nanotopographie, wie beispielsweise Nanosäulen zu markieren. </li><li> Reinigen Sie ein Si-Substrat mit Ethanol in einer Abzugshaube und trocknen Sie sie mit Druckluft. </li><li> Schneiden Sie die nicht gemusterten Flächen jedes PDMS-Form mit einem Messer. HINWEIS: Für die PDMS Formen, die an der Peripherie der genähten Form gelegt wird, werden nur die ungemusterten Bereiche in Kontakt mit anderen abgeschnitten werden sollten. </li><li> Legen Sie die getrimmten PDMS-Form mit dem Nano Gesicht nach unten aufdie Spiegelseite des Si-Substrats und dann auszurichten andere Formen der Nähe von, aber nicht die umgebende Form (en) zu berühren. </li><li> Bereiten Sie eine PDMS Klebeschicht <ol><li> PDMS-Präpolymer (PDMS Harz und Härter-Verhältnis: 10: 1,05) gegossen 1 g entgastes auf einem sauberen Objektträger aus Glas (7,5 cm × 2,5 cm), um eine 0,5 mm dicke Schicht zu bilden. </li><li> Backen Sie die PDMS-Schicht bei 100 ° C auf einer Heizplatte für 3-5 min. Verwenden Sie eine Nadel, um die Schicht zu berühren und zu gewährleisten, dass die Schicht teilweise, aber nicht vollständig geheilt. HINWEIS: teilweise gehärtete PDMS kann nicht wie nicht gehärtete PDMS-Präpolymer fließen, aber es ist klebrig, verglichen mit geheilt PDMS. </li></ol></li><li> Legen Sie die PDMS-Schicht auf der Rückseite ausgerichtet PDMS Formen und schnell diese Baugruppe invertieren und übertragen sie auf der Heizplatte. </li><li> Übernehmen einer Druckkraft (5 kPa) unter Verwendung eines Metallblock auf der Oberseite des Montage einen guten Kontakt zwischen dem PDMS Haftschicht und der Rückseite des PDMS Formen zu gewährleisten, und härten die PDMS Klebstoffschicht bei 100 ° C für 1 Std. &lt;br /&gt; Hinweis: Sie sorgfältig die Position des Metallblocks stellen Sie die Neigung der Anordnung zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie den Metallblock und ziehen Sie die einzelnen, genäht PDMS-Form aus dem Si-Substrat ab. </li></ol> 3. Erzeugung eines Master-Form auf PS Substrate Hinweis: Die genähte PDMS-Form auf einem Glasträger immobilisiert kann verwendet werden, eine Mutterform auf einer PS-Platte oder eine PS-Dünnfilm zu erzeugen, aus dem Arbeitsnanostrukturierten Substrate hergestellt werden können. <ol><li> Generieren Sie eine Masterform auf einer PS-Platte <ol><li> Bereiten Sie eine PS-Platte <ol><li> Trocknen Sie die PS-Pellets in einem Vakuumofen bei 80 ° C für zwei Tage. </li><li> Vorheizen eine Pressmaschine bei 230 ° C. </li><li> Bauen Sie eine Aluminiumplatte, eine Polytetrafluorethylen (PTFE) Blatt und das Aluminium-Abstandhalter in einer Reihenfolge von unten nach oben. </li><li> Belastung 3,5 g PS-Pellets in der Aluminiumabstandshalter mit einer quadratischen Öffnung von 3 cm (L) · 3 cm (W) × 0,3 cm (H). HINWEIS: Der Abstandhalter ist etwa 0.1 cm dicker als die PDMS Formen, und somit die endgültige nanostrukturierten PS Substrat beträgt etwa 0,1 cm dick. </li><li> Legen Sie eine andere PTFE-Folie und dann eine andere Aluminiumplatte auf dem Aluminium-Abstandhalter. </li><li> Legen Sie die Montage in der Pressmaschine. </li><li> Vorwärmen der PS-Pellets bei 230ºC für 30 min. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck (0,1 MPa) auf der Baugruppe für 5 min. </li><li> Lassen Sie den Druck und dann einen Kompressionsdruck von 0,5 MPa auf die Montage erneut anwenden. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.1.1.9 mit einem Druckanstieg von 0,5 MPa bis der erwünschte Druck von 1,5 MPa erreicht ist. </li><li> Schalten Sie die Heizung der Pressmaschine ab und kühlen es bei einem konstanten Druck von 1,5 MPa unter 70 ° C nach unten. </li><li> Nehmen Sie die Baugruppe aus und speichern Sie die PS-Platte in einem Vakuumofen bei 80 ° C Feuchtigkeit zu verhindern, dass der PS-Platte erneut eingeben. </li></ol></li><li> Nanoimprint die genähte PDMS-Form in PS-Platte <ol><li> Legen Sie die PS-Platte in einem Aluminium-AbstandhalterAuf einem 3-Zoll-Si-Wafer. HINWEIS: Die Innenabmessungen des Abstandhalters sind die gleichen wie diejenigen der PS-Platte, so dass die PS-Platte passt genau in den Abstandshalter. </li><li> Erhitzen Sie die PS-Platte auf einer Heizplatte bei 250 ° C für 30 min. </li><li> Legen Sie die genäht PDMS-Form mit Nano Gesicht nach unten auf dem geschmolzenen PS-Platte. HINWEIS: Eine Seite der PDMS-Form wird in Kontakt mit der Oberfläche der PS-Platte gelegt erste und eine andere Seite abgesenkt wird allmählich in Kontakt mit der PS Oberfläche die Bildung von Luftblasen an der Grenzfläche zu vermeiden. Achtung: Die Oberfläche der Heizplatte ist heiß. Tragen Sie thermogloves während Nanoimprint Prozess. </li><li> Legen Sie eine Aluminiumplatte auf dem Glasträger der genähten PDMS-Form. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck (12,5 kPa) durch Metallblöcke auf der Aluminiumplatte verwendet und für 3 Minuten warten. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Aluminiumplatte nicht gekippt wird. </li><li> Heben und den Metallblock von der Aluminiumplatte ersetzen und increase den Kompressionsdruck auf 25 kPa. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.1.2.6 mit dem Druck stieg auf 50 kPa. HINWEIS: Dieser Schritt ist die Luft zwischen der PDMS-Form und PS-Platte gefangen zu entfernen. </li><li> Aufrechterhaltung der Temperatur der Heizplatte zwischen 240 und 250 ° C unter ständiger Druck von 50 kPa für 15 min. </li><li> Schalten Sie die Kochstelle aus und abkühlen die gesamte Einrichtung. HINWEIS: Ein Lüfter kann dazu verwendet werden, um den Kühlprozess zu beschleunigen. </li><li> Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 ° C liegt, und schälen sorgfältig die genähte PDMS-Form aus der PS-Platte. HINWEIS: Die PS-Substrat hat die Reverse-Nano und kann als Master-Form verwendet werden, arbeiten PDMS-Substrate herzustellen. </li></ol></li></ol></li><li> Generieren Sie eine Masterform auf einem PS-Dünnfilm <ol><li> Bereiten Sie eine PS-Dünnschicht <ol><li> Man löst 1 g PS in 10 ml Toluol in einem Abzug. Vorsicht: Toluol kann Haut irritatio verursachenn und schwere Augenschäden und kann die Organe schädigen bei längerer oder wiederholter Exposition. Tragen Sie geeignete PSA. </li><li> Spin-coat 1 ml PS-Lösung auf einem 2-in-Wafer bei 2500 Upm für 1 min ~ 1 &amp; mgr; m dicken PS-Dünnfilm zu bilden. </li><li> Verdunsten Toluol aus dem Film durch die PS-Film auf Si-Wafer in einer Abzugshaube Einstellung für 3 Tage. </li><li> Einbrennlackieren PS-Dünnfilm in einem Vakuumofen über Nacht bei 80 ° C. </li></ol></li><li> Nanoimprint die PDMS-Form auf einem PS-Dünnfilm <ol><li> Legen Sie die genäht PDMS-Form mit Nanotopographie der Vorderseite nach unten auf der PS-Dünnfilm, der auf einer Heizplatte eingestellt ist. </li><li> Tragen Sie einen Kompressionsdruck von 12 kPa auf der PDMS-Form von Metallblöcke auf der Glasseite der PDMS-Form verwendet wird. </li><li> Erhöhen Sie die Temperatur der Heizplatte auf 180 ° C und halten es für 15 min. Achtung: Das geschmolzene PS Film kann als Schmiermittel wirken. Achten Sie darauf, die Metallblöcke ein Abrutschen zu verhindern. </li><li> Schalten Sie die Kochplatteund kühlen das gesamte Setup nach unten. HINWEIS: Ein Lüfter kann dazu verwendet werden, um den Kühlprozess zu beschleunigen. </li><li> Entfernen Sie die Metallblöcke, nachdem die Temperatur unter 50 ° C sinkt, und schälen sorgfältig die genäht PDMS-Form aus dem PS-Film. HINWEIS: Die nano PS Film wird als Masterform dienen Arbeits PDMS-Substrate herzustellen. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens Hinweis: Human-Epithelzellen kultiviert werden auf die repräsentativen Nanotopographien nanotopographical Modulation von Zellausbreitung zu demonstrieren. <ol><li> Cast PDMS Arbeits Substrate aus der Masterform erzeugt entweder von Schritt 3.1 oder 3.2, je nach Anwendung. </li><li> Mit Hilfe eines hohlen Stahlbogenschlag, schneiden Sie die nanostrukturierten PDMS - Substrate in Scheiben , die die Konfiguration einer bestimmten Multi-Well - Platte (zB 24-Well - Platte) zu passen. </li><li> Verwenden einer Pinzette die PDMS-Discs in die Vertiefungen zu platzieren ofa Multi-Well-Platte. </li><li> Sterilisieren der PDMS-Substrate durch 70% Ethanol und dann UV-Exposition, die jeweils für 30 min. </li><li> Waschen Sie die PDMS-Substrate mit 1x steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) dreimal. </li><li> Beschichtung der Substrate PDMS mit extrazellulären Matrixproteins (dh 20 ug / ml Fibronektin) für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die PDMS-Substrate dreimal mit sterilem PBS für jeweils 5 min. </li><li> Suspend menschlichen Lungenkrebszelle A549 in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und die Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers zählen. </li><li> Platte die Zellen bei einer Aussaatdichte von 2.000 Zellen / cm 2 auf den PDMS Substrate und Kultur sie bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 für einen Tag. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS dreimal. </li><li> Fixieren Sie die Zellen in einer Mischung aus 4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in PBS für 4 Stunden und entwässern Zellen eine CO 2 kritischen po Verwendungint Trockner für das Scannen von elektronischen mikroskopischen Beobachtung 29. Achtung: Paraformaldehyd und Glutaraldehyd kann zu schweren Verätzungen der Haut und Augenschäden. Betreiben Sie in einer chemischen Haube und geeignete PSA tragen. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+Compatibility+of+Poly(dimethylsiloxane)-Based+Microfluidic+Devices.">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75 (23), 6544-6554 (2003).</li><li>Yang, Y., Kulangara, K., Lam, R. T. S., Dharmawan, R., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Topographical+and+Mechanical+Property+Alterations+Induced+by+Oxygen+Plasma+Modification+on+Stem+Cell+Behavior.">Effects of Topographical and Mechanical Property Alterations Induced by Oxygen Plasma Modification on Stem Cell Behavior.</a> ACS Nano. 6 (10), 8591-8598 (2012).</li><li>Hua, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Imprint+Lithography+with+Molecular-Scale+Resolution.">Polymer Imprint Lithography with Molecular-Scale Resolution.</a> Nano Lett. 4 (12), 2467-2471 (2004).</li><li>Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Biebuyck, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+molded+polydimethylsiloxane+microstructures.">Stability of molded polydimethylsiloxane microstructures.</a> Adv. Mater. 9 (9), 741-746 (1997).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Wir präsentieren Ihnen eine einfache, kostengünstige und dennoch vielseitige Methode einen großen Bereich von nanostrukturierten Substrat zu erzeugen. Um treu hochdefinierte Nano, große Aufmerksamkeit erweitern sollte auf mehrere kritische Schritte bezahlt werden. Die erste ist die mehrere PDMS Formen zu trimmen. Ungemusterten Bereiche der PDMS Formen entfernt werden müssen. Zusätzlich sollten die Seitenwände der Formen geschnitten werden vertikal so perfekt wie möglich, die Lücken zwischen den Formen zu minimieren. Zusammenfassend kann der Teil des ungemusterten Bereiche im letzten Stich Form reduziert werden. Zweitens muss die nanostrukturierten Oberfläche dieser PDMS Formen ohne jede Verzerrung auf dem Siliziumsubstrat ausgerichtet werden. Da die PDMS-Nanostrukturen neigen zu verformen sind, ist es entscheidend, um die nanostrukturierten Oberflächen gegen eine Spiegelseite des Siliziumsubstrats leicht und gleichmäßig zu platzieren (vermeiden Luft zwischen der PDMS-Form und Siliziumoberfläche Trapping). Die PDMS Formen werden so nahe wie möglich ausgerichtet werden, aber nicht die nei Berührungghboring Formen weiter zu der unstrukturierten Teil der letzten Stich Form zu minimieren. Andernfalls werden die berührt Nanostrukturen während der Nanoimprint verformen. Drittens kann die Dicke der PDMS Formen von Charge zu Charge variieren, und daher ist es wichtig, die Dicke einheitlich zusätzlich zu machen, die Dicke jeder Form gleichmäßig zu machen, indem die kleinen Si Form perfekt vor PDMS Gießen Nivellierung. Obwohl die Unterschiede zwischen den PDMS Formen in der Dicke kann durch Einstellen der Dicke des PDMS-Präpolymer (Klebstoff) kompensiert werden Schicht auf einem Glasobjektträger gegossen, könnte eine dicke Schicht Prepolymers problematisch sein. Das Präpolymer kann durch die Zwischenräume zwischen den PDMS Formen auf die strukturierte Oberfläche durch die Kapillarkraft und folglich Beschädigung der Nano gezogen werden. Die Dickenänderung kann durch die Herstellung der gleichen Menge an PDMS-Gemisch minimiert werden, wenn aus der EBL Gießform. Als Ergebnis kann eine dünne PDMS-Präpolymer Schicht verwendet werden. Alternativ Härten teilweise die prepolymer Schicht erhöht sich seine Viskosität und damit seine Gehaltserhöhung reduzieren und schließlich den möglichen Schaden von nanostrukturierten Oberflächen beseitigen. Die Stich Technik wird von elastomeren Natur des PDMS beschränkt. Obwohl Softlithographie angewendet wurde Strukturgrößen so klein wie 2 nm 32 und im Prinzip zu replizieren, mit einer Auflösung von weniger als 0,5 nm 18 erreichen, können die nanoskaligen PDMS Funktionen , die nicht einwandfrei repliziert werden , wenn das Seitenverhältnis von Höhe zu Breite zu ist hoch (&gt; 2) oder zu niedrig (&lt;0,2). Die nanofeatures kann zusammenbrechen , wenn das Seitenverhältnis zu hoch ist, oder zu einer unzureichenden Erleichterung führen , wenn der PDMS - Stempel eines &lt;0,2 Verhältnis 33 verwendet wird. Außerdem können mehrere PDMS Formen nicht nahtlos genäht werden, weil der Zwischenräume und unvollständiger Beschneiden der PDMS Formen, und somit gibt es unstrukturierte und fehlausgerichteten Bereiche (insbesondere für die kontinuierliche Nano wie nanogratings). Der geringe Anteil des Defected gegebenenBereich über die gesamte Fläche, die Stichtechnik bietet immer noch eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, einen großen Bereich der nanostrukturierten Substrate herzustellen. Zusätzlich wird , wenn das Nähgut Form in dem Polymersubstrat nanoimprinted wird, kann geschmolzenes Polymer in den Zwischenraum fließen kann , was zu einer unebenen Oberfläche (Abbildung 1a). Die unebene Oberfläche macht es schwierig, Proben für die zelluläre oder molekularbiologische Analysen zu sammeln. In mikrofluidischen Anwendungen bewirkt die Erhöhung auch eine unvollständige Abdichtung, wenn Mikro gegen das strukturierte Substrat abgedichtet sind. Die unebene Oberfläche Problem kann leicht durch Aufbringen Dünnfilmtechnik Polymer gelöst werden , um die Erhöhung durch Abstimmung der Foliendicke (1b) zu minimieren. Obwohl die Stichtechnik eine definierte Master-Form für die Erweiterung benötigt, ist es einfach und erschwinglich im Vergleich zu anderen Techniken wie Step-and-Flash-Lithographie und einem Rolle-zu-Rolle Nanoimprint lithograPHY. Die Stichtechnik erfordert nur Kochplatten und eine Art und Weise Druckkräfte beim Sticken und Nanoimprint Prozesse auszuüben, aber keine teure Ausrüstung. Darüber hinaus kann die Stichprozeß in einer sauberen Umgebung durchgeführt werden, aber nicht notwendigerweise in einem Reinraum. Die Stich Technik ist auch vielseitig. Zusätzlich eine identische Nano zu einem großen Bereich zu erweitern, kann die Stichtechnik für die Formen aufgebracht werden, bestehend aus Mikro- und / oder Nanoskala Merkmale verschiedener Formen, Abmessungen und Anordnungen. Zu dieser Hinsicht eine kombinatorische Bibliothek von Mikro- / Nanotopographien gebaut werden Hochdurchsatz-Plattform für die Zell-Topographie-Wechselwirkungen zu untersuchen. Diese einfache, kostengünstige und vielseitige Stichtechnik kann potenziell erweitert werden Mikro- / Nanometer-Bauteilen mit Hybrid-Komponenten zu erstellen.

A number of recent findings reveal that substrate nanotopography has pronounced influence on cell behavior, from cell adhesion, spreading and migration, to proliferation and differentiation1-6. For instance, a smaller cell size and lower proliferation rate have been observed in cells cultured on deep nanogratings, even leading to apoptosis although the cell alignment, elongation and migration were enhanced, compared with the flat controls2,7-10. Moreover, nanotopography has been shown to facilitate the differentiation of stem cells into certain lineages such as neuron2,11,12, muscle13, and bone3,4. In addition, because of increasing concerns on the toxicity of engineered nanomaterials14,15, there is a need to incorporate nanotopography into physiologically relevant in vitro models for accurate risk assessment of nanomaterials. To fulfil the biochemical and molecular biology analyses, enough cells are needed to be grown on a large area of nanopatterned substrate. However, conventional nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area.
Self-assembly including colloid lithography16 and polymer demixing17 can readily generate large-area nanostructures at low costs. Because self-assembly relies on interactions between the assembling elements such as colloidal particles and macromolecules, and possible interactions between these elements and substrate, it cannot be a stand-alone method of producing nanostructures with precise spatial positioning and arbitrary shapes18. The accompanied high density of defects is also a drawback. Precise spatial control of nanopatterns can be achieved by employing templated self-assembly, which uses top-down lithographic approaches to provide the topographical and/or chemical template to guide the bottom-up assembly of the assembling elements19-21. Alternative nanofabrication techniques such as step-and-flash lithography22 and a roll-to-roll nanoimprinting lithography23 have been developed but have limited use because of their sophisticated process or the requirement of specialized equipment. Nevertheless, a template or a master mold with defined nanoscale patterns is needed for templated or alternative nanofabrication techniques. 
Such templates and master molds are conventionally generated by using focused electron, ion, or photon beam lithography. For instance, electron beam lithography (EBL)24 and focused ion beam lithography25 can generate defined patterns with a sub-5 nm resolution. Two-photon lithography has demonstrated a feature size as small as 30 nm26. Although the focused beam lithography techniques enable generation of well-defined nanoscale structures, the capital investment and the time-consuming, costly process restrict their widespread use in academic research27. Therefore, it is highly desirable to develop enabling yet affordable techniques to produce a large area of nanopatterned surfaces with high fidelity.
We have reported a simple, cost-effective stitch technique for generating a large area of nanopatterned surface from a small well-defined mold28. This protocol provides step-by-step procedure from replication of poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds using an EBL-written pattern, to assembly of multiple PDMS molds into a single large mold, to generation of a master mold on polymeric such as polystyrene (PS) substrates, to production of working substrates. With the expanded nanopatterned substrates, we demonstrated nanotopographical modulation of cell spreading.

<table><tbody><tr><td>JEOL field emission SEM</td><td>JEOL</td><td>JSM-7600F</td><td>EBL</td></tr><tr><td>E-beam evaporator</td><td>Kurt J. Lesker</td><td>Model: LAB 18 e-beam evaporator</td><td>nickel deposition</td></tr><tr><td>Trion Minilock III ICP/RIE</td><td>Trion technology</td><td>Model: Minilock-phantom III</td><td></td></tr><tr><td>Press machine</td><td>PHI Hydraulic Press</td><td>Molde: SQ-230H</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>Modle: WS-400A-6NPP-LITE</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; critical dryer</td><td>Tousimis</td><td>Modle: Autosamdri-815</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>University Wafer</td><td>1080</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum plates</td><td>McMaster-carr</td><td>9057K123</td><td></td></tr><tr><td>Teflon sheets</td><td>McMaster-carr</td><td>8711K92</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Petri dish</td><td>FALCON</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>Glass slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-34</td><td></td></tr><tr><td>Disposable weighing boats</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>Glass desiccator</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-913-360</td><td></td></tr><tr><td>Plastic desiccator</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42025-000</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Fisher Scientific</td><td>1110049SH</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer</td><td>Ted Pella, inc.</td><td>5726</td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr><tr><td>Metal blocks</td><td>McMaster-carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punch</td><td>Brettuns Village Leather Craft Supplies</td><td>Arch punch</td><td></td></tr><tr><td>Poly(methyl methacrylate)</td><td>MicroChem</td><td>495 PMMA A4</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184 kit</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene</td><td>Dow Chemical</td><td>Styron 685D</td><td></td></tr><tr><td>1H,1H,2H,2H-perfluorooctylmethyldichlorosilane</td><td>Oakwood Chemical</td><td>7142</td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem</td><td>MIBK/IPA at 1: 3 ratio</td><td></td></tr><tr><td>Remover</td><td>MicroChem</td><td>Remover PG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher Scientific</td><td>T324-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified eagle medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microsopy Science</td><td>15712-S</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde&amp;nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>G151-1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>A549 cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-185</td><td></td></tr></tbody></table>

expanding nanopatterned substrates using stitch technique for nanotopographical modulation of cell behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

<html> Die Stichtechnik kann einen großen Bereich von nanostrukturierten Substrate mit hoher Genauigkeit erzeugen. Figur 1a und 1b die große Fläche von Nanostrukturen aus dem genähten PDMS - Form zu PS - Platte und PS - Dünnfilm auf einem Si - Substrat bzw. übertragen anzuzeigen. Der Vergleich zwischen dem ursprünglichen EBL geschriebene Form (Abbildung 1c) und die endgültigen PDMS Arbeitssubstrat (Abbildung 1d) bestätigt , dass die EBL-geschrieben Nano getreu an das Arbeitssubstrat übertragen werden. Nanotopographie unterschiedlicher Geometrie und Abmessungen können verwendet werden, um Zellverhalten zu modulieren. Wie in Figur 2 gezeigt , mit A549 ein adenocarcinomic basalen Epithel - Zelllinie als Modellzellen können die anisotropen nanogratings die Zellen entlang der nanograting Richtung länglich gegenüber dem mehrpoligen Morphologie , die A549 - Zellen auf den isotropen Nanosäulen anzuzeigen. nt &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54840/54840fig1.jpg" /> Abbildung 1. Die Erzeugung einer großen Fläche der nanostrukturierten Substrate Stichtechnik. (A, b) optische Bilder der transferierten Nano zu PS - Platte und PS - Dünnfilm, respectively. Die Pfeile zeigen die Polymer Erhöhung in den Zwischenräumen der genähten PDMS Schimmelpilzen. (C, d) REM - Aufnahmen der Nano auf EBL Form und letzte PDMS Substrat arbeitet, respectively. Die Maßstabsbalken sind 1 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54840/54840fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54840/54840fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54840/54840fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nanotopographical modulierte Zelle von A549 - Zellen zu verbreiten. </strong&gt; A549 Zellen auf (a) nanogratings von 500 nm in Linienbreite 500 nm in Abstand und 560 nm in der Höhe und (b) Nanosäulen von 500 nm im Durchmesser, 450 nm in Kante-zu-Kante Abstand gezüchtet und 560 nm in der Höhe , beziehungsweise. Die Maßstabsbalken sind 10 &amp; mgr; m. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54840/54840fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54840/54840fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Der Ausbau nano Substraten Stichtechnik für Nanotopographical Modulation des Zellverhaltens

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

expanding-nanopatterned-substrates-using-stitch-technique-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.5K Aufrufe.  West Virginia University. A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Serie: Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Stencil Micropatterning of Human Pluripotent Stem Cells for Probing Spatial Organization of Differentiation Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the intrinsic ability to differentiate and self-organize into distinct tissue patterns; although this requires the presentation of spatial environmental gradients. We present stencil micropatterning as a simple and robust method to generate biochemical and mechanical gradients for controlling hPSC differentiation patterns.

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical discoveries with the aims of developing functional tissues for cardiac regeneration as well as in vitro screening assays. However, the ability to create high-fidelity models of heart tissue has proven difficult. The heart&#8217;s extracellular matrix (ECM) is a complex structure consisting of both biochemical and biomechanical signals ranging from the micro- to the nanometer scale2. Local mechanical loading conditions and cell-ECM interactions have recently been recognized as vital components in cardiac tissue engineering3-5.
A large portion of the cardiac ECM is composed of aligned collagen fibers with nano-scale diameters that significantly influences tissue architecture and electromechanical coupling2. Unfortunately, few methods have been able to mimic the organization of ECM fibers down to the nanometer scale. Recent advancements in nanofabrication techniques, however, have enabled the design and fabrication of scalable scaffolds that mimic the in vivo structural and substrate stiffness cues of the ECM in the heart6-9.
Here we present the development of two reproducible, cost-effective, and scalable nanopatterning processes for the functional alignment of cardiac cells using the biocompatible polymer poly(lactide-co-glycolide) (PLGA)8 and a polyurethane (PU) based polymer. These anisotropically nanofabricated substrata (ANFS) mimic the underlying ECM of well-organized, aligned tissues and can be used to investigate the role of nanotopography on cell morphology and function10-14.
Using a nanopatterned (NP) silicon master as a template, a polyurethane acrylate (PUA) mold is fabricated. This PUA mold is then used to pattern the PU or PLGA hydrogel via UV-assisted or solvent-mediated capillary force lithography (CFL), respectively15,16. Briefly, PU or PLGA pre-polymer is drop dispensed onto a glass coverslip and the PUA mold is placed on top. For UV-assisted CFL, the PU is then exposed to UV radiation (&#955; = 250-400 nm) for curing. For solvent-mediated CFL, the PLGA is embossed using heat (120 &#176;C) and pressure (100 kPa). After curing, the PUA mold is peeled off, leaving behind an ANFS for cell culture. Primary cells, such as neonatal rat ventricular myocytes, as well as human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, can be maintained on the ANFS2.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of biomimetic cardiac cell culture substrata made from two distinct polymeric materials using capillary force lithography. The described methods provide a scalable, cost-effective technique to engineer the structure and function of macroscopic cardiac tissues for in vitro and in vivo applications.

Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

Biotechnik

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, biomedical device coatings, and drug delivery tools. Nanoporous gold (np-Au), produced by a nano-scale self-assembly process, is a relatively new material that exhibits large effective surface area, high electrical conductivity, and catalytic activity. These properties have made np-Au an attractive material to scientific community. Most studies on np-Au employ macro-scale specimens and focus on fundamental science of the material and its catalytic and sensor applications. The macro-scale specimens limit np-Au's potential in miniaturized systems, including biomedical devices. In order to address these issues, we initially describe two different methods to micropattern np-Au thin films on rigid substrates. The first method employs manually-produced stencil masks for creating millimeter-scale np-Au patterns, while the second method uses lift-off photolithography to pattern sub-millimeter-scale patterns. As the np-Au thin films are obtained by sputter-deposition process, they are compatible with conventional microfabrication techniques, thereby amenable to facile integration into microsystems. These systems include electrically-addressable biosensor platforms that benefit from high effective surface area, electrical conductivity, and gold-thiol-based surface bioconjugation. We describe cell culture, immunostaining, and image processing techniques to quantify np-Au's interaction with mammalian cells, which is an important performance parameter for some biosensors. We expect that the techniques illustrated here will assist the integration of np-Au in platforms at various length-scales and in numerous applications, including biosensors, energy storage systems, and catalysts.

We report on techniques to micropattern nanoporous gold thin films via stencil printing and photolithography, as well as methods to culture cells on the microfabricated patterns. In addition, we describe image analysis methods to characterize morphology of the material and the cultured cells using scanning electron and fluorescence microscopy techniques.

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain central aspects of cellular physiology. To easily combine cell patterning with Multi-Electrode Arrays (MEAs) and silicon-based &#8216;lab on a chip&#8217; technologies, a microfabrication-compatible protocol is required. We describe a method that utilizes deposition of the polymer parylene-C on SiO2&#160;wafers. Photolithography enables accurate and reliable patterning of parylene-C at micron-level resolution. Subsequent activation by immersion in fetal bovine serum (or another specific activation solution) results in a substrate in which cultured cells adhere to, or are repulsed by, parylene or SiO2 regions respectively. This technique has allowed patterning of a broad range of cell types (including primary murine hippocampal cells, HEK 293 cell line, human neuron-like teratocarcinoma cell line, primary murine cerebellar granule cells, and primary human glioma-derived stem-like cells). Interestingly, however, the platform is not universal; reflecting the importance of cell-specific adhesion molecules. This cell patterning process is cost effective, reliable, and importantly can be incorporated into standard microfabrication (chip manufacturing) protocols, paving the way for integration of microelectronic technology.

Cell Patterning on Photolithographically Defined 
Parylene-C: SiO2 Substrates

This protocol describes a microfabrication-compatible method for cell patterning on SiO2. A predefined parylene-C design is photolithographically printed on SiO2 wafers. Following incubation with serum (or other activation solution) cells adhere specifically to (and grow according to the conformity of) underlying parylene-C, whilst being repulsed by SiO2 regions.

Musterbildung auf Photolithographische Definierte Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrate

Cell patterning platforms support broad research goals, such as construction of predefined in vitro neuronal networks and the exploration of certain ...

Stretching Micropatterned Cells on a PDMS Membrane

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch cells plated on a PolyDiMethylSiloxane (PDMS) membrane, compatible with imaging. This technique is reproducible and versatile. The PDMS membrane can be micropatterned in order to confine cells or tissues to a specific geometry. The first step is to print micropatterns onto the PDMS membrane with a deep UV technique. The PDMS membrane is then mounted on a mechanical stretcher. A chamber is bound on top of the membrane with biocompatible grease to allow gliding during the stretch. The cells are seeded and allowed to spread for several hours on the micropatterns. The sample can be stretched and unstretched multiple times with the use of a micrometric screw. It takes less than a minute to apply the stretch to its full extent (around 30%). The technique presented here does not include a motorized device, which is necessary for applying repeated stretch cycles quickly and/or computer controlled stretching, but this can be implemented. Stretching of cells or tissue can be of interest for questions related to cell forces, cell response to mechanical stress or tissue morphogenesis. This video presentation will show how to avoid typical problems that might arise when doing this type of seemingly simple experiment.

This manuscript presents a technique to apply or release forces on adherent cells or tissues using unidirectional stretching.

Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Mechanical forces exerted on cells and/or tissues  play a major role in numerous processes. We have developed a device to stretch  cells plated on a ...

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single cell resolution. Current state-of-the-art single cell micropatterning techniques involve soft lithography and micro-contact printing, which is a powerful technology, but requires trained engineering skills and certain facility support in microfabrication. These limitations require a more accessible technique. Here, we describe a simple alternative lithography-free method: stencil-based single cell patterning. We provide step-by-step procedures including stencil design, polyacrylamide hydrogel fabrication, stencil-based protein incorporation, and cell plating and culture. This simple method can be used to pattern an array of as many as 2,000 cells. We demonstrate the patterning of cardiomyocytes derived from single human induced pluripotent stem cells (hiPSC) with distinct cell shapes, from a 1:1 square to a 7:1 adult cardiomyocyte-like rectangle. This stencil-based single cell patterning is lithography-free, technically robust, convenient, inexpensive, and most importantly accessible to those with a limited bioengineering background.

This protocol introduces a lithography-free micropatterning method that is simple and accessible to those with a limited bioengineering background. This method utilizes customized laser-cut stencils to micropattern extracellular matrix proteins in a shape of interest for modulating cell morphologies. The procedure for micropatterning is demonstrated using induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes.

Einfache Lithographie-freie Einzelzell-Mikromusterung mit Laser-Cut Schablonen

Micropatterning techniques have been widely used in cell biology to study effects of controlling cell shape and size on cell fate determination at single ...

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning techniques work well only with simple shapes, small areas and selected bio-materials. This article describes a method to distribute cell suspensions as well as substrate solutions into complex, long, closed (dead-end) polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels using negative pressure. This method enables researchers to pattern multiple substrates including fibronectin, collagen, antibodies (Sal-1), poly-D-lysine (PDL), and laminin. Patterning of substrates allows one to indirectly pattern a variety of cells. We have tested C2C12 myoblasts, the PC12 neuronal cell line, embryonic rat cortical neurons, and amphibian retinal neurons. In addition, we demonstrate that this technique can directly pattern fibroblasts in microfluidic channels via brief application of a low vacuum on cell suspensions. The low vacuum does not significantly decrease cell viability as shown by cell viability assays. Modifications are discussed for application of the method to different cell and substrate types. This technique allows researchers to pattern cells and proteins in specific patterns without the need for exotic materials or equipment and can be done in any laboratory with a vacuum.

This report describes a simple, easy to perform technique, using low pressure vacuum, to fill microfluidic channels with cells and substrates for biological research.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

Fabrication of Gradient Nanopattern by Thermal Nanoimprinting Technique and Screening of the Response of Human Endothelial Colony-forming Cells

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular reactions. However, it is difficult to determine the relation between the size of a nanostructure and the responses of cells owing to the lack of proper screening tools. Here, we show the development of reproducible and cost-effective gradient nanopattern plates for the manipulation of cellular responses. Using anodic aluminum oxide (AAO) as a master mold, gradient nanopattern plates with nanopillars of increasing diameter ranges [120-200&#8239;nm (GP 120/200), 200-280&#8239;nm (GP 200/280), and 280-360&#8239;nm (GP 280/360)] were fabricated by a thermal imprinting technique. These gradient nanopattern plates were designed to mimic the various sizes of nanotopography in the ECM and were used to screen the responses of human endothelial colony-forming cells (hECFCs). In this protocol, we describe the step-by-step procedure of fabricating gradient nanopattern plates for cell engineering, techniques of cultivating hECFCs from human peripheral blood, and culturing hECFCs on nanopattern plates.

Here, we present a protocol for the fabrication of gradient nanopattern plates via thermal nanoimprinting and the method of screening responses of human endothelial progenitor cells to the nanostructures. By using the described technology, it is possible to produce a scaffold that can manipulate cell behavior by physical stimuli.

Herstellung von Gradient Nanopattern durch thermische Nanoimprinting Technik und Screening der Reaktion des menschlichen koloniebildenden Endothelzellen

Nanotopography can be found in various extracellular matrices (ECMs) around the body and is known to have important regulatory actions upon cellular ...

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular compartments while circumventing complications arising from natural cell-to-cell variations. To standardize cell shape, cells are either confined in 3D molds or controlled for adhesive geometry through adhesive islands. However, traditional micropatterning techniques based on photolithography and deep UV etching heavily depend on clean rooms or specialized equipment. Here we present an infrared laser assisted micropatterning technique (microphotopatterning) modified from Doyle et al. that can be conveniently set up with commercially available imaging systems. In this protocol, we use a Nikon A1R MP+ imaging system to generate micropatterns with micron precision through an infrared (IR) laser that ablates preset regions on poly-vinyl alcohol coated coverslips. We employ a custom script to enable automated pattern fabrication with high efficiency and accuracy in systems not equipped with a hardware autofocus. We show that this IR laser assisted micropatterning (microphotopatterning) protocol results in defined patterns to which cells attach exclusively and take on the desired shape. Furthermore, data from a large number of cells can be averaged due to the standardization of cell shape. Patterns generated with this protocol, combined with high resolution imaging and quantitative analysis, can be used for relatively high throughput screens to identify molecular players mediating the link between form and function.

The protocol presented here enables automated fabrication of micropatterns that standardizes cell shape to study cytoskeletal structures within mammalian cells. This user-friendly technique can be set up with commercially available imaging systems and does not require specialized equipment inaccessible to standard cell biology laboratories.

Kontrolle der Zellgeometrie durch Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mustergenerierung für die Mikromuster-Traktionsmikroskopie

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...