We thank Dr. Alexandre Benmerah (Institut Imagine Necker, Paris, France) for initial discussions on the experimental approach and Dr. Jamil Jubrail for reading the manuscript. Nad&#232;ge Kambou and Susanna Borreill are acknowledged for performing experiments with the method in our laboratory. This work was supported by grants from CNRS (ATIP Program), Ville de Paris and Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche M&#233;dicale (FRM INE20041102865, FRM DEQ20130326518 including a doctoral fellowship for FMA) to FN, and Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les h&#233;patites virales" (ANRS) including a doctoral fellowship for JM.

Hinweis: Das verwendete Plasmid LifeAct-mCherry ist ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17. 1. Zellen und Transfektion Anmerkung: RAW264.7 Makrophagen sind sub Konfluenz in komplettem Medium gezüchtet (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-Medium, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10% FCS ( Kalbsfetusserum)) in einer 100-mm-Platte. Sie werden mit Plasmiden transfiziert durch Elektroporation fluoreszent markierte Proteine ​​kodieren. Routinemßig etwa 5 - 6 x 10 6 Zellen mit 20 ug oder 10 ug Plasmid für jede Transfektion oder Co-Transfektion bzw. transfiziert sind. Man beachte, dass andere Mittel zur Transfektion beruhen auf Elektroporation oder Lipofektion als alternative Ansätze verwendet werden. <ol><li> Abkratzen der Zellen mit einem Zellheber und resuspendieren sie in 10 ml Kulturmedium durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. </li><li> zentrifugieren Sie dieZellsuspension 300 · g, 5 min bei RT in Schwenkwinkel Rotor. </li><li> Vorwärmtemperatur 10 ml komplettem Medium mit 10 &amp; mgr; g / ml Gentamicin bei 37 ° C ergänzt. </li><li> Nach der Zentrifugation der Überstand verworfen und das Pellet in 3 ml &quot;Waschpuffer A&quot; aus der Elektroporation Kit. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension 300 · g, 5 min bei Raumtemperatur in Schwenkwinkel Rotor. </li><li> In der Zwischenzeit die DNA - Mischung bei Raumtemperatur hergestellt: 120 ul 2x Puffer B, 20 ug Plasmid - DNA , codierend für das Protein von Interesse, qsp 240 &amp; mgr; l H 2 O. </li><li> Nach der Zentrifugation verwerfen die gesamte Überstand. </li><li> Zellpellet in der DNA-Mischung und Transfer in 4 mm Elektroporationsküvetten. </li><li> 3 min bei RT inkubieren. </li><li> Elektroporation bei 250 V, 900 uF. </li><li> Resuspendieren sofort die Zellen in der vorgewärmten (37 ° C) komplettes Medium mit Gentamicin ergänzt und die Platte derm in einer 100 mm-Schale. </li><li> Inkubieren der transfizierten Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Morgen, ersetzen Sie das komplette Medium mit 10 ml Serum-freien Mikroskopie Medium (RPMI 1640 ohne Phenolrot, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 &amp; mgr; M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin). </li></ol> 2. Opsonisierung von roten Blutkörperchen Hinweis: Als Modell der Partikel Ziel für Makrophagen, rote Blutkörperchen vom Schaf (SRBCs) verwendet werden. Normalerweise etwa 7 x 10 6 SRBCs pro 35 mm Glasbodenschale verwendet. <ol><li> Waschen Sie die SRBCs mit 100 ul 1x PBS (phosphate buffered saline) /0.1% BSA (Rinderserumalbumin) und Zentrifuge (600 · g, 4 min). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und Resuspendieren der SRBCs in 100 ul 1x PBS / 0,1% BSA und Zentrifuge (600 × g, 4 min). </li><li> Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und resuspendieren SRBCs in 1x PBS / 0,1% BSA mit Kaninchen-IgG-anti-SRBCsbei Unter agglutinierende Konzentration. Verwenden Sie 500 ul einer Lösung, die Antikörper / 5 ul SRBCs. Anmerkung: Die Teil agglutinierende Konzentration von Antikörpern gegen die niedrigste Konzentration entspricht, die keine Agglutination als Bildung eines Netzwerks erkannt induzierte. Im Allgemeinen ist die Unter agglutinierende Konzentration beträgt 8,2 &amp; mgr; g / ml. <ol><li> Bestimmen Sie die Konzentration von IgG-Anti-SRBCs erforderlich, um die SRBCs durch einen Hämagglutinations-Test opsonisieren. Serienmäßig wird die IgG verdünnen anti-SRBCs (Lager bei 13,1 mg / ml) zwischen 1/50 - 1 / 25.600 in einer Mikrotiterplatte. Fügen Sie 2 x 10 6 SRBCs in jeder Vertiefung. Die Platte im Dunkeln bei RT für mehrere Stunden. </li></ol></li><li> bei RT inkubieren 30 Minuten mit langsamer Rotation. </li><li> Nach zweimaligem Waschen in 1x PBS / 0,1% BSA wie oben beschrieben, Resuspendieren der IgG-opsonisiertes SRBCs (IgG-SRBCs) in vorgewärmten serumfreien Mikroskopie Medium (2 ml / Schale). </li></ol> 3. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläser <ol><li> In der Zwischenzeitbehandeln, 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml 0,01% Poly-L-Lysin für 30 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Waschen Sie die Teller zweimal mit 2 ml 1x PBS. </li></ol> 4. Nicht-kovalente Fixierung von SRBCs auf Glasboden Geschirr <ol><li> Gießen 2 ml SRBCs Suspension pro 35 mm Glasbodenschale. </li><li> Zentrifuge mit einem schwingend Rotor bei 500 · g während 2 min auf 35 mm Glasbodenschalen. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und wäscht einmal mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA. </li><li> Inkubieren der Teilchen für 30 min mit 2 ml 1x PBS / 10% BSA pro Schale. </li><li> Waschen Sie die Teller dreimal mit 2 ml 1x PBS. </li><li> Ersetzen 1x PBS mit 2 ml vorgewärmtes (37 ° C) serumfreien Medium Mikroskopie. </li></ol> 5. Phagozytose Visualisierte von TIRFM <ol><li> Mikroskop Hinweis: TIRFM wurde durchgeführt unter Verwendung eines Mikroskops ausgestattet mit einer Öl-Immersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), einer Heizkammer mit CO 2, und zwei singenle Photonenerfassungskameras EMCCD (Elektronenvervielfachungs Charge Coupled Device), gekoppelt mit einer Linse 1,5X. <ol><li> Am Tag vor der TIRF-Mikroskop-Sitzung, schalten Sie die Heizkammer bei 37 ° C eine homogene Erwärmung des Mikroskoptisch zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Kritische Winkelbestimmung Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird. <ol><li> Legen Sie eine 35 mm Glasbodenschale mit opsonisierter SRBC mit Serum-freiem Medium Mikroskopie unter dem Mikroskop. </li><li> Abkratzen der Zellen und Resuspendieren sie in dem Medium vor ihnen Zugabe (100-500 ul) in die Schüssel. </li><li> Verwenden Sie die &quot;Live Acquisition&quot; Software, um das Mikroskop steuern und durchführen Anregung mit einem 491 nm und / oder einem 561-nm-Laser zu identifizieren Zellen fluoreszenz markierte Proteine ​​exprimiert. </li><li> Identifizieren Sie eine Zelle, die die fluoreszenz markierte Proteine ​​exprimiert. </li><li> Legen Sie es in der Mitte des Feldes und erwerben 500 imAlter bei einer Anregungswellenlänge, mit verschiedenen Winkeln von 0 ° bis 5 °, mit einer Zunahme von 0,01 ° (2A) zu starten. Die Winkel werden automatisch durch das Mikroskopsystem verändert. </li><li> Bestimmen den kritischen Winkel so dass das einfallende Licht vollständig an der Glas / Medium-Schnittstelle und Erzeugen der abklingenden Welle reflektiert zu werden. Mit ImageJ Color Profiler Software, öffnen Sie die Bildsequenz, indem Sie auf &quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und wählen Sie die Datei. </li><li> Wählen Sie eine Region of Interest (ROI), mit dem rechteckigen Werkzeug, in der Zelle mit einer einheitlichen Fluoreszenz (2B gelb 1). </li><li> Zeichnen Sie die &quot;Z - Achse - Profil&quot; mittlere Fluoreszenzintensität in der ROI mit der Funktion der Winkel auf der x - Achse gemessen , indem Sie auf Registerkarte &quot;Bild&quot;, &quot;Stapel&quot; in der Drop - Down - Menü und &quot;Plot Z-Achse Profile&quot; (2B rot 2). Hinweis: Der kritische Winkel ist der Winkel zur ma führendenxim Fluoreszenz vor einer scharfen Abnahme der Fluoreszenz. </li><li> Verwenden einen beliebigen Wert des Winkels auf der x-Achse überlegen dem kritischen Winkel während der Mikroskopie Sitzung ein TIRF - Signal als Beispiel 2.00 (2C) zu erhalten. </li></ol></li><li> Acquisitions <ol><li> Verwendung von Live - Acquisition - Software, die Parameter des Erwerbs mit dem Modul &quot;Protocol Editor&quot; (3A) auf. <ol><li> Erstellen Sie ein Protokoll mit einer &quot;Schleife&quot; umfassend &quot;Multi Channels&quot; Erwerb Fluoreszenzsignal von Proteinen von Interesse in der TIRF Region zu erwerben. Geben Sie den TIRF Winkel (zum Beispiel 2,00), die Belichtungszeit (beispielsweise 50 msec) und die Laserintensität (beispielsweise 50%) (3B 1). </li><li> Einführung eines &quot;Z move&quot; des Objektivs 3 &amp; mgr; m über dem TIRF Bereich Signalerfassung in Epifluoreszenz mit dem &quot;Multi Channels&quot; Werkzeug zu erhalten. Geben Sie einen Winkel unter ter kritischen Winkel (wie beispielsweise 1,00), die Zeit der Exposition (50 msec) und die Laserintensität (50%) (3B, 2 und 3). </li><li> Als nächstes fügen unten , um ein &quot;z move&quot; des Objektivs 3 &amp; mgr; m, in der TIRF - Bereich (3B 4) zurückzukehren. Fügen Sie einen &quot;Schnappschuss&quot; der Zelle , in helles Licht LED (Light-Emitting Diode) (3B 5). </li></ol></li><li> Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einem moderaten Niveau von fluoreszenz markierte Protein-Expression, die durch die Verlängerung der Plasmamembran um das Teilchen Phagozytose von SRBC initiiert. </li><li> Legen Sie es in der Mitte des Feldes. </li><li> Starten Sie Streaming-Akquisition von 500 - 1.000 Frames. In der &quot;Schleifenzählung&quot;, geben Sie &quot;750 Frames&quot; (3B 1). Hinweis: ImageJ Color Profiler Software TIRF Bildströme zu verarbeiten, verwendet wird. </li><li> Öffnen Sie die Sequenz Bilder in Bild J-Software, indem Sie auf&quot;Datei&quot;, &quot;Öffnen&quot; und die Datei auswählen. </li><li> Trennen Sie die Kanäle durch einen Klick auf die Registerkarte &quot;Bild&quot;, &quot;Hyperstacks&quot; Drop-Down-Menü und auf &quot;Stack zu Hyperstack&quot; -Funktion. Füllen Sie das Fenster erschienen: Bestellen: xyctz; Channel (c): Anzahl der Kanäle (ex: &quot;2&quot;, wenn Sie zwei Fluorochrome); Scheiben (z): Anzahl der Schichten in der Z-Achse (ex: &quot;1&quot;, wenn es keine Bewegung in der Z-Achse); Frames (t): Anzahl der Bilder pro Anzahl der Kanäle geteilt; Anzeigemodus: Graustufen. Anmerkung: Zwei getrennte Bildsequenzen erzeugt werden, entsprechend den zwei verschiedenen Kanälen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

The experimental protocol described here proposes an unprecedented method to follow in real time and in living cells, with high-resolution, the formation of a phagosome and in particular its closure. Several technical aspects have to be discussed. Firstly, the assay is very sensitive to temperature. It is very important to check that the heating chamber is at 37 &#176;C and that all media, devices or cells are kept within the chamber to avoid temperature changes that could impair the efficiency of phagocytosis. We noticed that subtle temperature changes were sufficient to prevent phagosome formation. Secondly, the protocol described here allows a precise determination of the TIRF angle that will be used throughout the experiment. We believe that this constitutes a substantial advantage when performing TIRF experiments, allowing us to be confident when concluding about events near the plasma membrane. Thirdly, when working with transiently transfected cells, it is important to choose cells with moderate levels of expression of the proteins of interest. With the revolution of the genome-editing technology, it will be feasible to work with cells expressing proteins at native levels. Thus, quantitative fluorescence microscopy will be possible to explore the dynamics of major functions in living cells. 
With this assay, it is now possible to analyze precisely in time and space the different players involved in pseudopod extension and fusion. The forced orientation of the target to engulf allows better monitoring of extending pseudopods and the closure site, compared with phagosome formation imaging using a confocal microscope and a different experimental set up. The only caveat is the low output. Not all cells chosen on the basis of their fluorescence will phagocytose during the acquisition time. A potential improvement would be to have a patterned surface coated with target particles to increase the number of concomitant acquisitions. Using this method, we have dissected the spatio-temporal organization of F-actin dynamics and recruitment of recycling (VAMP3-positive) vesicles during phagosome formation 13. We observed recruitment of F-actin at the very tips of closing pseudopods, but no VAMP3-positive vesicles in this closing zone of the phagocytic cup. VAMP3 was only detected as a plasmalemmal diffuse signal. In contrast, VAMP3-positive vesicles were detected at the base of the forming phagosome, as visualized in the epifluorescence images. These results showed that F-actin polymerization occurs in the extending pseudopods and in their tips, while there is depolymerization at the base where the vesicular traffic is concentrated. This spatio-temporal dynamic of F-actin polymerization was proposed in seminal work reviewed in 2 and recently also confirmed in 12. 
Using the same experimental model, we recently showed that dynamin-2, which mediates the scission of endocytic vesicles, was recruited early and concomitantly with actin during phagosome formation and pseudopod extension. Dynamin-2 then accumulates at the site of phagosome scission. Acute treatment of cells with pharmacological inhibitors clearly showed that dynamin-2 plays a crucial role in phagosome scission 18. The unique possibility to monitor with high precision the closure step in phagosome formation allowed us to conclude the possible role of dynamin-2 in phagosome scission. 
The phagosome closure assay can be in principle adapted to any other phagocytic cell (dendritic cells, neutrophils), provided that they express fluorescently tagged proteins of interest. In addition, the method can be extended to other target particles like beads or bacteria. The size and shape of the different targets could also be varied to get further insight into the mechanism of phagosome formation and in particular the forces involved in phagosome closure. Following the localization of different molecular players in living phagocytosing cells using the phagosome closure assay described here opens avenues for better definition of the molecular mechanisms and machineries important for phagosome formation and closure.

Phagozytose ist eine wichtige Zellfunktionen, die mit der Erkennungs beginnt und die Bindung von Material an Oberflächenrezeptoren, die dann führt zur Internalisierung und Degradation des aufgenommenen Materials. Während einzelliger Eukaryonten, wie die Form Dictyostelium discoideum und Amöben für Fütterung auf Bakterien Phagozytose verwenden, haben höhere Organismen mit professionellen Zellen entwickelt. Makrophagen oder dendritischen Zellen sind die erste Verteidigungslinie gegen Krankheitserreger in verschiedenen Geweben und Organen und sind entscheidend für die adaptive Immunsystem durch Antigenpräsentation und Zytokin - Produktion 1-4 zu aktivieren. Unter bestimmten Umständen können die Phagozytose von nicht-professionellen Phagozyten durchgeführt werden, zum Beispiel Endothel- und Epithelzellen. Dieser Prozess ist wichtig für die normale Gewebeumsatz und Umbau Homöostase während der Entwicklung und im Erwachsenenalter zu halten. Schließlich spezialisierte Fresszellen wie Sertoli-Zellen in den Hoden oder retinalenPigment - Epithelzellen sind extrem potente Phagozyten 5. Die Bildung eines phagosome wo Abbau von Mikroorganismen oder Zellabfall auftritt beginnt mit der Clusterung von phagozytischen Rezeptoren auf der Oberfläche der phagozytischen Zelle. Downstream Signalereignisse folgende Häufung von opsonischen Rezeptoren wie Fc-Rezeptoren (FcR) oder Komplement-Rezeptoren (CRs) wurden gut charakterisiert. Allerdings gibt es auch zahlreiche nicht-opsonischen Rezeptoren, einschließlich Toll-like Rezeptoren (TLR), Lektine, Mannose-Rezeptoren und Scavenger-Rezeptoren. Diese Rezeptoren erkennen Determinanten auf der Partikeloberfläche , wie beispielsweise Mannose oder Fucose - Reste, Phosphatidylserin und Lipopolysaccharide 1,6-9. Pathogen oder Zelltrümmer Anerkennung beinhaltet die Bindung an und Clustering von mehreren Arten von phagozytischen Rezeptor, der dann zu intensiv und vorübergehende Aktin-Umbildung führen. Parallel dazu Brenn Exozytose von intrazellulären ABTEILUNGts trägt zur Freisetzung von Membranspannung und ist für eine effiziente Phagozytose von großen Teilchen wichtig. Die Signalereignisse zu Aktin-Polymerisation und Membranverformung führen, wurden in experimentellen Modellen seziert, die einen einzelnen phagozytischen Rezeptor ausgelöst. Während FcR-vermittelte Phagozytose, gibt es intensive Aktin-Polymerisation, die von kleinen GTPasen (Rac, Cdc42) geregelt wird. Unter ihren nachgeschalteten Effektoren führt das Wiskott-Aldrich - Syndrom - Protein (WASP) zur Aktivierung des Actin-Related Protein 2/3 Komplex (Arp2 / 3) , die Aktinfilamente 1,2,4,10 nukleiert. Die lokale Produktion von Phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphat (PI (4,5) P 2) ist von entscheidender Bedeutung für die anfängliche Aktin - Polymerisation , die pseudopod Bildung antreibt. Die Umstellung auf PI (3,4,5) P 3 ist für pseudopod Verlängerung und phagosome Verschluss 11 erforderlich. Mehrere Wege beitragen 2 zum Verschwinden von PI (4,5) P. Zum einen Ablösung von Phosphatidylinositol Phosphat Kinases (PIPKIs) von der phagosome Verhaftungen PI (4,5) P2 - Synthese. Zweitens kann es nach Klasse phosphoryliert und verbraucht werden , ich PI3K - Kinasen (PI3K) und in PI (3,4,5) P 3 12 umgewandelt. Eine Rolle für Phosphatasen und Phospholipasen hat auch in PI (4,5) P 2 Hydrolyse und F-Actin - Entfernung während der Phagozytose in Säugerzellen und in Dictyostelium 13,14 angedeutet worden. Die Phospholipase C (PLC) δ hydrolisiert PI (4,5) P 2 in Diacylglycerin und Inositol-1,4,5- Tris - Phosphat. Die PI (4,5) P2 und PI (3,4,5) P 3 Phosphatase OCRL (Lowe-Syndrom Lowe) wurde ebenfalls in phagosome Bildung in Verbindung gebracht. Präzise lokale Bildung von F-Actin und seine Depolymerisation fest in Raum und Zeit geregelt wird, und wir haben gezeigt, dass die Rekrutierung von intrazellulären Kompartimenten gezeigt ist wichtig, lokal die OCRL Phosphatase zu liefern, was zu einer lokalen Aktin Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse beitragen <sup&gt; 13,15. Dazu verwendeten wir die Versuchsanordnung hier beschrieben. Der Mechanismus und die molekularen Spieler für phagosome Schließung und Membran scission erforderlich bleiben schlecht wegen der Schwierigkeiten, definiert bei der Visualisierung und Überwachung der Website von phagosome Schließung. Bis vor kurzem wurde die Phagozytose auf festen oder lebenden Zellen beobachtet, die Teilchen auf ihrer Rückenfläche internalisieren oder auf ihren Seiten, so dass die rechtzeitige Visualisierung des Standortes von phagosome Schließung schwierig. Darüber hinaus Befestigungsmethoden könnten Rückzug von Membranen und Vorspannung bewirken, dass die Ergebnisse auf Pseudopodien Erweiterung und Schließung. Dagegen ist der Test, den wir eingerichtet haben und beschreiben hier können wir pseudopod Erweiterung und die Schließung Schritt der Phagozytose in lebenden Zellen 13, bezogen auf die gesamte interne Reflexion Mikroskopie (TIRFM) 16 sichtbar zu machen. Diese optische Technik verwendet eine abklingende Welle Fluorophore in einem dünnen Bereich zwischen einer transparenten an der Grenzfläche anzuregen, soDeckel (Deckglas) und eine Flüssigkeit (Zellkulturmedium). Die Dicke der Anregungstiefe beträgt etwa 100 nm von der festen Oberfläche, so dass die Visualisierung von molekularen Ereignissen nahe an der Plasmamembran. TIRFM ermöglicht ein hohes Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis, und begrenzt die out-of-focus-Fluoreszenz und die Cytotoxizität aufgrund Beleuchtung der Zellen. Ausnutzend TIRFM, entwickelten wir das &quot;phagosome Verschluss assay&quot; in dem Deckgläschen mit Poly-Lysin aktiviert werden und dann beschichtet mit IgG-opsonisiertes roten Blutzellen (IgG-SRBCs). Makrophagen transient fluoreszierend markierten Proteine ​​von Interesse exprimieren, werden dann die IgG-SRBCs zu versenken erlaubt. Während Zellen, die die Zielpartikel lösen, die nicht-kovalent an die Glasoberfläche sind, können die Spitzen der Pseudopodien beobachtet und in den TIRF-Modus aufgezeichnet werden. TIRF Akquisitionen mit Akquisitionen im Epifluoreszenz-Modus kombiniert, nach der Stufe 3 um oben verlagert, was die vis erlaubtualization der Basis des phagozytischen Tasse. Zugabe von pharmakologischen Wirkstoffen wie diejenigen, Actin oder dynamin während des Prozesses Hemmen ist auch möglich, das Verfahren weiter auf molekularer Ebene zu sezieren. Das Protokoll im Detail hier beschrieben ist, für eine RAW264.7 murine Makrophagenzelllinie und opsonierten Partikel, aber praktisch kann es auf andere phagozytische Zelle und mit anderen Zielen, wie beispielsweise Kügelchen angepasst werden. Diese Methode wird eine bessere Charakterisierung der Regelung in Zeit und Raum der molekularen Spieler in pseudopod Erweiterung und phagosome Schließung während verschiedener phagozytischen Prozessen beteiligt zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Anti-sheep red blood cells IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin heat shock fraction, pH 7, &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes 4 mm</td><td>Cell project</td><td>EP104</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-094</td><td>Room temperature</td></tr><tr><td>Electrobuffer kit</td><td>Cell project</td><td>EB110</td><td></td></tr><tr><td>100 mm TC-Treated Cell Culture Dish</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Gene X-cell pulser</td><td>Biorad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes 35 mm uncoated 1.5</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C Case</td><td></td></tr><tr><td>iMIC</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td>Oil-immersion objective (N 100X, NA1.49), heating chamber with CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, a camera single photon detection EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) and a 1.5X lens</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Solution 0.1%</td><td>Sigma</td><td>P8920-100ml</td><td>Dilution at 0.01% in water&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium GLUTAMAX&amp;nbsp; Supplement</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, no phenol red (10 x 500 ml)</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Sheep red blood cells (SRBCs)</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>Conserved in Alsever buffer at 4 &amp;deg;C before use</td></tr></tbody></table>

"phagosome closure assay" to visualize phagosome formation in three dimensions using total internal reflection fluorescent microscopy (tirfm)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

Das experimentelle System in diesem Manuskript beschrieben ist, ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Transfizierte RAW264.7 Makrophagen , die Proteine ​​von Interesse zu einem fluoreszierenden Tag fusioniert exprimiert in Kontakt gebracht werden mit IgG-opsonisiertes roten Schafsblutzellen (SRBCs) , die waren nicht-kovalent fixierten auf dem Deckglas. Die Makrophagen können die SRBC aus dem Deckglas lösen sie zu verschlingen. Das Mikroskop verwendet TIRF ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von Signalen aus dem Bereich TIRF zu den Spitzen der Pseudopodien und Signale in dem Epifluoreszenz-Modus entspricht, nach einer Verschiebung Z 3 um oben. Es ist wesentlich , den kritischen Winkel für innere Totalreflexion Fluoreszenz zu bestimmen , wie in Abbildung 2 beschrieben Dies gewährleistet eine saubere TIRF - Signal von einem 100 nm Bereich unter der Plasmamembran. 3 stellt die Entwicklung der acquisitiauf Parameter durch ein Modul &quot;Protocol Editor&quot;, die in der Live-Acquisition-Software genannt. Dieses Modul ermöglicht es Benutzern, Workflows zu erstellen und zu verwalten, bevor sie an das Mikroskop gesendet werden, die den Prozess ausgeführt wird. Am Ende des Erfassungs sammelt der Benutzer eine TIFF-Stream. Abbildung 4 zeigt eine repräsentative Live-Zelle TIRFM Film eines &quot;phagosome Verschlusstest&quot; in RAW264.7 Makrophagen , die mit dem Plasmid transfiziert (zB LifeAct-mCherry, ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17) an die Aktin - Polymerisation folgen. Makrophagen transient exprimierenden Plasmid wurden erlaubt IgG-SRBCs auf das Deckglas gebunden zu verschlingen. Da die Spitzen der Pseudopodien zu dem Deckglas um ein SRBC apposed wurden, ein F-Actin-Ring wurde in der TIRF-Bereich (oben), die schrittweise verengt erkannt, bis es geschlossen. Parallel dazu die verschwommen F-ActinSignal durch Epifluoreszenz erkannt, nachdem die Stufe 3 um oben (unten) entsprach Depolymerisation an der Basis des phagozytischen Tasse verschieben. Nach 3 min des Erwerbs wurde die SRBC völlig verinnerlicht, wie mit Durchlicht (Panel auf der rechten Seite) bestätigt. Daher kann dieses Verfahren verwendet werden, um richtig die molekularen Ereignisse unterscheiden, die stattfinden an den äußersten Enden der Pseudopodien und die molekularen Ereignisse an der Basis des phagozytischen Tasse auftritt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54470/54470fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der &quot;Phagosomen Closure Assay&quot; Analysierte durch TIRFM. Der phagosome Schließung Assay wird Makrophagen transient unter Verwendung exprimieren ein oder zwei fluoreszierend markiert-Protein. Makrophagen sind auf IgG-opsonisierter SRBCs nicht-kovalent fixiert auf Poly-Lysin coa hinterlegtted Deckgläser. Die Bilder werden in TIRF - Modus aufgenommen wurden die Website von phagosome Schließung und in Epifluoreszenz - Modus zu erfassen , die Basis des phagozytischen Tasse zu erkennen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54470/54470fig2.jpg" /> Abbildung 2: Bestimmung des kritischen Winkels für TIRFM. (A) Mit &quot;Live Erwerb&quot;, eine Zelle fluoreszierend markierten Proteine ​​exprimiert , wird in der Mitte des Feldes (Region 1 in rot) platziert. Mit der TIRF Stapel Option Bilder wurden bei einer Anregungswellenlänge erfasst, mit verschiedenen Winkeln von 0 ° bis 5 beginnend ° mit einer Schrittweite von 0,01 ° (Bereich 2 in rot). (B) Die Sequenz von Bildern geöffnet wird mit ImageJ Color Profiler Software und die mittlere Fluoreszenzintensität von aregion of Interest (ROI) mit Funktion der Winkel auf der x - Achse mit &quot;Stacks&quot; und &quot;Plötz Achsprofil&quot; (Region 1 in rot) dargestellt. (C) Die x - Position der Spitze der Fluoreszenz auf dem Grundstück entspricht der kritische Winkel: 1.98 ° (schwarz gestrichelte Linie). Jeder Wert nach diesem Winkel verwendet werden. Als Beispiel können 2,00 ° (rote Linie) gewählt werden. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54470/54470fig3.jpg" /> Abbildung 3. Workflow - Prozess unter Verwendung von Live - Acquisition - Modul: &quot;Protocol Editor&quot;. (A) Im &quot;Protokoll - Editor&quot; Fenster, ein Workflow - Leinwand erzeugt wird. (B) Dieses Protokoll umfasst einen &quot;Loop&quot; von Aktionen, die das Mikroskop die Anzahl der Male wiederholen wird entschiedendurch den Benutzer. Als Beispiel: 750 (1). Eine Schleife eingeschlossen: &quot;Multi-Kanäle&quot; Erfassung mit Laseranregung von fluoreszierenden Proteine ​​von Interesse in TIRF-Modus. Als Beispiel: Laser 491 nm Intensität 50% -TIRF Winkel 2.00 (2); &quot;Z move&quot; des Objektivs 3 &amp; mgr; m (3); &quot;Multi Channels&quot; Akquisition im Epifluoreszenz-Modus (4); &quot;Z move&quot; von dem Ziel zurück zu dem TIRF Bereich (5) und einen &quot;Snapshot&quot; im Durchlicht (6). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig3large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54470/54470fig4.jpg" /> Abbildung 4. F-Actin als ein Punkt an der Stelle der Phagosomen Kumulierte Verschluss. Phagosomen Schließung Assay wurde unter Verwendung von RAW264.7 Makrophagen vorübergehend das Plasmid LifeAct-mCherry (ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Mo ausdrückenntagnac, Institut Curie, Paris, erzeugt nach 17). Das Plasmid-Signal wurde in TIRF-Bereich (oben) und in Epifluoreszenz-Modus (unten) erworben. Die rote Pfeilspitze zeigt die Aktin-Anreicherung in der TIRF-Region. Durchlichtbild bei 3 min vorgestellt, die einen inneren SRBC anzeigt. Maßstabsbalken, 10 &amp; mgr; m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/54470fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Film 1" src="/files/ftp_upload/54470/54470mov1.jpg" /> Film 1: F-Actin in den Spitzen der Pseudopodien und an der Stelle der Phagosomen Closure Kumulierte, während es von der Basis des Phagozytische Cup Phagosomen Verschlusstest wurde durchgeführt , Gelöscht wird unter Verwendung von RAW264.7 Makrophagen exprimiert vorübergehend das Plasmid.. Plasmid-Bildgebung in TIRF-Bereich (oben) und in Epifluoreszenz-Modus (unten) mit der TIRFM wurde Alternative durchgeführtly alle 50 ms während 3 Minuten bei 37 ° C. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/Movie1.mp4" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54470/Movie1.mp4" target="_blank">dieses Video anzusehen.</a>

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"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;Phagosomen Closure Assay&quot; zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

6.4K Aufrufe.  Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité. We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

Serie: "Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome maturation is the complex and tightly regulated process during which a nascent phagosome undergoes drastic transformation through well-orchestrated interactions with various cellular organelles and compartments in the cytoplasm. This process, which is essential for the physiological function of phagocytic cells by endowing phagosomes with their lytic and bactericidal properties, culminates in fusion of phagosomes with lysosomes and biogenesis of phagolysosomes which is considered to be the last and critical stage of maturation for phagosomes. In this report, we describe a live cell imaging based method for qualitative and quantitative analysis of the dynamic process of lysosome to phagosome content delivery, which is a hallmark of phagolysosome biogenesis. This approach uses IgG-coated microbeads as a model for phagocytosis and fluorophore-conjugated dextran molecules as a luminal lysosomal cargo probe, in order to follow the dynamic delivery of lysosmal content to the phagosomes in real time in live macrophages using time-lapse imaging and confocal laser scanning microscopy. Here we describe in detail the background, the preparation steps and the step-by-step experimental setup to enable easy and precise deployment of this method in other labs. Our described method is simple, robust, and most importantly, can be easily adapted to study phagosomal interactions and maturation in different systems and under various experimental settings such as use of various phagocytic cells types, loss-of-function experiments, different probes, and phagocytic particles.

Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

High Throughput Fluorometric Technique for Assessment of Macrophage Phagocytosis and Actin Polymerization

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular processes. This technique can be used on a variety of cell types, both adherent and non-adherent, to examine a variety of cellular properties. When studying phagocytosis, fluorometric technique utilizes phagocytic cell types such as macrophages, and fluorescently labeled opsonized particles whose fluorescence can be extinguished in the presence of trypan blue. Following plating of adherent macrophages in 96-well plates, fluorescent particles (green or red) are administered and cells are allowed to phagocytose for varied amounts of time. Following internalization of fluorescent particles, cells are washed with trypan blue, which facilitates extinction of fluorescent signal from bacteria which are not internalized, or are merely adhering to the cell surface. Following the trypan wash, cells are washed with PBS, fixed, and stained with DAPI (nuclear blue fluorescent label), which serves to label nuclei of cells. By a simple fluorometric quantification through plate reading of nuclear (blue) or particle (red/green) fluorescence we can examine the ratio of relative fluorescence units of green:blue and determine a phagocytic index indicative of amount of fluorescent bacteria internalized per cell. The duration of assay using a 96-well method and multichannel pipettes for washing, from end of phagocytosis to end of data acquisition, is less than 45 min. Flow cytometry could be used in a similar manner but the advantage of fluorometry is its high throughput, rapid method of assessment with minimal manipulation of samples and quick quantification of fluorescent intensity per cell. Similar strategies can be applied to non adherent cells, live labeled bacteria, actin polymerization, and essentially any process utilizing fluorescence. Therefore, fluorometry is a promising method for its low cost, high throughput capabilities in the study of cellular processes.

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation

The goal of fluorometric analysis is to serve as an efficient, cost effective, high throughput method of analyzing phagocytosis and other cellular ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Imaging the Neutrophil Phagosome and Cytoplasm Using a Ratiometric pH Indicator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular compartment where the killing and digestion of engulfed particles take place, is the main arena for neutrophil pathogen killing that requires tight regulation. Phagosomal pH is one aspect that is carefully controlled, in turn regulating antimicrobial protease activity. Many fluorescent pH-sensitive dyes have been used to visualize the phagosomal environment. S-1 has several advantages over other pH-sensitive dyes, including its dual emission spectra, its resistance to photo-bleaching, and its high pKa. Using this method, we have demonstrated that the neutrophil phagosome is unusually alkaline in comparison to other phagocytes. By using different biochemical conjugations of the dye, the phagosome can be delineated from the cytoplasm so that changes in the size and shape of the phagosome can be assessed. This allows for further monitoring of ionic movement.

This manuscript describes a simple method to measure the phagosomal pH and area as well as the cytoplasmic pH of human and mouse neutrophils using the ratiometric indicator seminaphthorhodafluor (SNARF)-1, or S-1. This is achieved using live-cell confocal fluorescence microscopy and image analysis.

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Neutrophils are crucial to host innate defense and, consequently, constitute an important area of medical research. The phagosome, the intracellular ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Visualizing Clathrin-mediated Endocytosis of G Protein-coupled Receptors at Single-event Resolution via TIRF Microscopy

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological assays, measuring global changes in endocytosis, have identified over 30 known components participating in CME, and biochemical studies have generated an interaction map of many of these components. It is becoming increasingly clear, however, that CME is a highly dynamic process whose regulation is complex and delicate. In this manuscript, we describe the use of Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize the dynamics of components of the clathrin-mediated endocytic machinery, in real time in living cells, at the level of individual events that mediate this process. This approach is essential to elucidate the subtle changes that can alter endocytosis without globally blocking it, as is seen with physiological regulation. We will focus on using this technique to analyze an area of emerging interest, the role of cargo composition in modulating the dynamics of distinct clathrin-coated pits (CCPs). This protocol is compatible with a variety of widely available fluorescence probes, and may be applied to visualizing the dynamics of many cargo molecules that are internalized from the cell surface.

Clathrin-mediated endocytosis, a rapid and highly dynamic process internalizes many proteins, including signaling receptors. The protocol described here directly visualizes the kinetics of individual endocytic events. This is essential for understanding how core members of the endocytic machinery coordinate with each other, and how protein cargo influence this process.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Many important signaling receptors are internalized through the well-studied process of clathrin-mediated endocytosis (CME). Traditional cell biological ...

Biologie

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

<meta charset="utf8"></head><body>Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

"Phagosomen Closure Assay" zu visualisieren Phagosomen Formation in drei Dimensionen Mit Total Internal Reflection Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM)

Zusammenfassung

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Mess Phagosomen pH durch ratiometrische Fluoreszenzmikroskopie

Abbilden der Neutrophilen Phagosomen und Zytoplasma Mit einem Ratiometrisch pH-Indikator

Time-Lapse 3D-Bildgebung der Phagozytose durch Makrophagen der Maus

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose

Live-Fluoreszenz, inverse Bildgebung von Zellkräuseln und Macropinozytose