This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Library Construction <ol><li> Wählen Sie die Regionen unterworfen werden mit Hilfe von Computer - Algorithmen auf MORPHING basierend auf den verfügbaren Kristallstruktur oder Homologie - Modelle 18. <ol><li> Dabei zielen zwei Regionen AAO aus Pleurotus für zufällige Mutagenese und Rekombination (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), während Amplifizieren der Rest des Gens (844 bp) von High-Fidelity - PCR (Abbildung 1). Hinweis: Mehrere Segmente können durch MORPHING in einem unabhängigen oder kombinierten Weise 16 untersucht werden. </li></ol></li><li> Amplify die Zielgebiete durch mutagene PCR. Erstellen Sie überlappende Bereiche zwischen den Segmenten (~ 50 bp jeweils) durch Überlagerung PCR-Reaktionen der definierten Regionen. <ol><li> Vorbereitung mutagene PCR gezielte Segmente in einem Endvolumen von 50 ul, enthaltend DNA-Templat (0,92 ng / ul), 90 nM Oligo Sinn (RMLn für Segment MI und AAO-BP für das Segment M-II), 90 nM antisense Primer (AAO-92C für Segment MI und RmlC für das Segment M-II), 0,3 mM dNTPs (0,075 mM each), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,5 mM MgCl 2, 0,05 mM MnCl 2 und 0,05 U / &amp; mgr; l Taq DNA - Polymerase. Primer - Sequenzen sind in 1 beschrieben. </li><li> Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 95 ° C für 2 Minuten (1 Zyklus); 95 ° C für 45 sec, 50 ° C für 45 sec, 74 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 74 ° C für 10 min (1 Zyklus). </li></ol></li><li> Amplify die nicht mutagen Regionen mit ultra-High-Fidelity-Polymerase und umfassen die entsprechenden Bereiche der mutagenen Segmente überlappende und / oder linearisierte Vektor Auskragungen. <ol><li> Bereiten Reaktionsgemische in einem Endvolumen von 50 &amp; mgr; l, enthaltend: DNA-Matrize (0,2 ng / &amp; mgr; l), 250 nM Oligo Sinne HFF, 250 nM Oligo Antisense- HFR, 0,8 mM dNTPs (jeweils 0,2 mM), 3% (v / v) Dimethylsulfoxid (DMSO) und 0,02 U / &amp; mgr; l iProof DNA - Polymerase. Die Primer-Sequenzen sind in &lt;strong&gt; 1. </li><li> Verwenden Sie das folgende PCR-Programm: 98 ° C für 30 Sekunden (1 Zyklus); 98 ° C für 10 sec, 55 ° C für 25 sec, 72 ° C für 45 sec (28 Zyklen); und 72 ° C für 10 min (1 Zyklus). Hinweis: Bei Bedingungen , die in 1.2 und 1.3 Überlappungen von 43 bp (Plasmid-M1 - Region); 46 bp (M1-Region-HF-Bereich); 47 bp (HF-Bereich M2 region) und 61 bp (M2 regions Plasmid) sind so ausgelegt , (1) in vivo Spleißen in Hefe zu begünstigen. </li><li> Man reinige das alle PCR-Fragmente (mutagene und nicht-mutagene) mit einem handelsüblichen Kit Gel Extraction dem Protokoll des Herstellers entsprechend. </li></ol></li><li> Linearisieren des Vektors, so daß Bereiche von etwa 50 bp flankiert werden erstellt, die zu den 5&#39;- und 3&#39;-Enden des Zielgens homolog sind. <ol><li> Bereiten Sie eine Linearisierungsreaktionsmischung , die 2 ug DNA, 7,5 U Bam HALLO, 7,5 U XhoI, 20 &amp; mgr; g BSA und 2 ul Puffer Bam HALLO 10x in einem Endvolumen von 20 ul. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für 2 h und 40 min. Danach fahren Sie für 20 min bei 80 ° C mit Inaktivierung. </li></ol></li><li> Reinige den linearisierten Vektor durch Agarose - Gel Extraction Kontamination mit dem Rest zirkuläre Plasmid (Figur 2) zu vermeiden. <ol><li> Laden die Verdauung Reaktionsmischung in den Mega-Well einer semi-präparativen niedrigem Schmelzpunkt Agarosegel (0,75%, w: v) sowie ein Aliquot (5 ul) der Reaktionsmischung in dem benachbarten auch als Reporter. </li><li> Run DNA-Elektrophorese (5 V / cm zwischen den Elektroden, 4 ᵒC) und trennen Sie die Agarose-Gel auf die Mega-gut entspricht, und speichern Sie sie bei 4 ᵒC in 1x TAE. </li><li> Stain die Spur mit dem Molekulargewicht Leiter und dem Reporter. Visualisieren Sie die Bänder unter UV-Licht. Nick die Position, wo die linearisierte Vektor Plätze. Hinweis: Da die Qualität des gereinigten linearisierten Vektor a Criti istcal Faktor für eine erfolgreiche Rekombination und Montage in Hefe, Gel-Färbung für semi-präparative DNA-Elektrophorese zu vermeiden. Die Verwendung von Farbstoffen und UV - Belichtung für Gel Extraktion kann die Stabilität des DNA - Vektors beeinflussen, Beeinträchtigung der in vivo - Rekombination Effizienz. Als Alternative zu toxischen EtBr Farbstoffe, Gel Red und SYBR-Farbstoffe werden für Gel-Färbung verwendet. </li><li> In Abwesenheit von UV-Licht, identifizieren die linearisierte Vektor im Fragment mega-gut die Führung der Kerben in der gefärbten Reporter Spur mit, so dass es isoliert werden kann. </li><li> Extrahieren der linearisierte Vektor aus Agarose und reinige sie mit einem handelsüblichen Gel Extraction-Kit nach Herstellerprotokoll. Hinweis: Verwenden Sie High-Kopie episomalen Shuttle - Vektoren mit Antibiotika und Auxotrophie - Marker: In diesem Beispiel wird die Uracil unabhängig und Ampicillinresistenz pJRoC30 Vektor unter der Kontrolle des Hefe - GAL1 - Promotor eingesetzt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine äquimolare mixture der PCR-Fragmente und mit dem linearisierten Vektor mischen zu einem 2: 1-Verhältnis, mit nicht weniger als 100 ng linearisierter Plasmid (Test unterschiedliche Verhältnisse von äquimolaren Bibliothek / offener Vektor gute Transformation Ausbeuten zu erzielen). <ol><li> Messen der Extinktion der PCR-Fragmente und linearisierten Vektor bei 260 nm und 280 nm, ihre Konzentration und Reinheit zu bestimmen. </li></ol></li><li> Trans Hefe kompetente Zellen mit dem DNA - Gemisch eine kommerzielle Hefe Transformation Kit (siehe Tabelle für die Versorgung) gemäß den Anweisungen des Herstellers. <ol><li> Hier verwenden eine Protease - defizienten und URA3 - abhängig S. cerevisiae - Stamm, BJ5465. Transformation der Zellen mit dem parentalen Vektor zirkularisierten als interner Standard bei Screening (siehe unten). Darüber hinaus überprüfen Sie den Hintergrund durch das linearisierte Vektor in Abwesenheit von PCR-Fragmenten verwandeln. Hinweis: Bei der anfänglichen niedrigen Sekretionsmengen Erkennung verwenden S.cerevisiae - Protease - defiziente Stämme wie BJ5465 die Anhäufung von aktiven Protein in den Kulturüberständen zu fördern. Wenn das Zielenzym Hyperglykosylierung läuft, die Verwendung von Glykosylierungs-defizienten Stämmen (beispielsweise die Δ kre2 nur des Anbringens kleineren Mannose Oligomeren kann) kann eine geeignete Wahl sein. </li></ol></li><li> Platte die transformierten Zellen auf SC Drop-out-Platten und sie für drei Tage bei 30 ° C inkubiert. Teller (auf SC Drop-out - Platten , ergänzt mit Uracil) URA3 - S. cerevisiae - Zellen , die das Plasmid als negative Kontrolle für das Screening fehlt (siehe unten). </li></ol> 2. Hochdurchsatz-Screening-Assay (Abbildung 3) <ol><li> Füllen eine geeignete Anzahl von sterilen 96-Well-Platten (23 Platten mit einer Bibliothek von 2.000 Klonen zu analysieren) mit 50 &amp; mgr; l Minimalmedium pro Vertiefung mit Hilfe eines Pipettierroboters. </li><li> Wählen Sie einzelne Kolonien aus dem SC-Drop-out-Platten und sie auf den 96-Well-Platten. <ol><li> In jeder Platte Spaltennummer 6 mit dem Elterntyp als interner Standard inokulieren und gut mit URA3 H1 - S. cerevisiae - Zellen (in SC - Medium mit Uracil ergänzt) ohne Plasmid als negative Kontrolle. Hinweis: Nun H1 gefüllt ist speziell mit Drop-out mit Uracil Medien. Eine leere gut haltigen Medien ohne Zellen können auch als zusätzliche Sterilitätskontrolle hergestellt werden. </li></ol></li><li> Decken Sie die Platten mit ihren Deckeln und wickeln Sie sie in Parafilm. Inkubieren Platten für 48 Stunden bei 30 ° C, 225 rpm und 80% relativer Luftfeuchtigkeit in einem feuchten shaker. </li><li> Entfernen Sie die Parafilm, fügen Sie 160 ul Expressionsmedium zu jeder Vertiefung mit Hilfe des Pipettierroboter, wieder verschließen die Platten und inkubieren sie für weitere 24 Stunden. Hinweis: Minimal Medium und Expressionsmedium hergestellt werden , wie an anderer Stelle 19 berichtet. Sekretionsniveaus variieren kann auf dem Gen untersucht und dementsprechend abhängig, ter Inkubationszeiten jeweils optimiert werden müssen das Zellwachstum in allen Vertiefungen zu synchronisieren. </li><li> Zentrifuge die Platten (Masterplatten) bei 2.800 x g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Transfer 20 ul des Überstandes aus den Vertiefungen in der Master-Platte an der Replik Platte ein Liquid-Handling Roboter-Multistation verwendet wird. Hinweis: Um begünstigen Enzym - Sekretion ist es ratsam, das native Signalpeptid des Zielproteins durch Signalpeptide häufig für die heterologe Expression in Hefe verwendet zu ersetzen (zB die α - Faktor Präpro-Führer, der Führer der K 1 Killer - Toxin von S. cerevisiae oder auch chimäre Versionen der beiden Peptide 13). Alternativ kann das native Signalpeptid ausschließlich für die Sekretion in Hefe entwickelt werden. </li><li> Geben Sie 20 &amp; mgr; l von 2 mM p -methoxybenzylalcohol in 100 mM Natriumphosphatpuffer pH 6.0 mit Hilfe der Pipettierroboter. Rühren Sie die Platten kurz mit einem 96-wirll Tellermischer und brüten sie für 30 min bei RT. </li><li> Mit dem Pipettierroboter, fügen Sie 160 ul des FOX - Reagens zu jeder Replik Platte und rühren Sie kurz mit dem Mischer (Endkonzentration von FOX Mischung in den Brunnen: 100 &amp; mgr; M Xylenolorangelösung, 250 &amp; mgr; M Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 und 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Fügen mehrere Zusatzstoffe der Reagenz Empfindlichkeit zu erhöhen, wie organische Cosolventien (DMSO, Ethanol, Methanol) oder Sorbitol 17. Hier verstärken die Reaktion von Sorbitol zu einer Endkonzentration von 100 mM Zugabe (Abbildung 4). </li></ol></li><li> Lesen Sie die Platten (End-Point - Modus, t 0) bei 560 nm auf einem Plattenleser. </li><li> Die Inkubation bei RT , bis die Farbe wieder die Absorption entwickelt und messen (t 1). <ol><li> Berechnen Sie die relative Aktivität aus der Differenz zwischen dem ABS-Wert nach der Inkubation und der anfänglichen Messung normiert auf die parental Typ für jede Platte (At 1 - t 0). </li></ol></li><li> Betreff die besten Mutante Treffer zu zwei aufeinander folgenden Wieder Screenings Fehlalarme auszuschließen. Hinweis: In der Regel wieder Screenings Plasmidisolation von Hefe, Amplifikation und Reinigung in Escherichia coli umfassen, gefolgt von Transformation frische Hefe - Zellen mit dem Plasmid 19. Jeder ausgewählte Klon wird in pentaplicate erneut kontrolliert. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In diesem Artikel haben wir die meisten der Tipps und Tricks beschäftigt in unserem Labor zu konstruieren Enzyme durch gerichtete Evolution in S. zusammengefasst cerevisiae (unter Verwendung AAO als Beispiel) , so dass sie für die Verwendung mit vielen anderen eukaryotischen Enzymsysteme durch einfaches Folgenden werden die allgemeinen hier beschriebenen Ansatz angepasst werden kann. In Bezug auf die Bibliothek Schöpfung ist MORPHING eine schnelle Ein-Topf - Verfahren einzuführen und zufällige Mutationen in kleinen Protein erstreckt sich rekombinieren , während die restlichen Bereiche des Proteins unverändert 16 zu verlassen. Bibliotheken mit mehreren Mutations Lasten können leicht in vivo hergestellt und rekombiniert werden, zusammen mit dem linearisierten Plasmids, eine vollständige autonom replizierenden Vektor zu erzeugen. Es ist wichtig , daß überlappende Sequenzen jede Dehnung flankieren die Fragmente des vollständigen Gens zu ermöglichen , durch in vivo - Rekombination wieder aufgebaut zu werden, vermeidet zusätzliche PCR - Reaktionen und in vitro - Ligation Schritten. In diesem protocol, die Häufigkeit der Überkreuzungsereignisse zwischen PCR-Fragmente können durch eine Verringerung der Größe der überlappenden Bereiche erhöht werden, obwohl dies die Transformationseffizienz beeinträchtigen kann. Unabhängig von den DNA - Polymerasen verwendet für mutagene PCR, die Mutations Lasten können durch vorheriges Konstruktion und Analyse von kleinen Mutantenbibliothek Landschaften (5A) eingestellt werden. Wenn das GeneMorph II Kit verwendet wird, ist es immer noch ratsam , diesen Ansatz zu folgen , da in vivo DNA - Rekombination insbesondere die Mutations - Lasten geschätzt vom Hersteller ändern können. Allgemein ausgedrückt in mutant Landschaften, die 35 - 50% der gesamten Klone gescreent haben weniger als 10% der Elternaktivität eignen sich für die gerichtete Evolution Kampagnen, obwohl diese Zahl in Abhängigkeit des Zielproteins und seine Aktivität variiert. Typischerweise sind die Analyse von Mutanten-Bibliotheken Landschaften weiter durch DNA-Sequenzierung einer Stichprobe von Mutanten verifiziert. In dem aktuellen Beispiel die TaqDNA-Polymerase wurde aufgrund seiner hohen Fehlerrate verwendet, die der fehlenden 3&#39;→ 5&#39;proof Lese Exonukleaseaktivität verbunden ist. Die Mutations - Lasten in Taq - Bibliotheken wurden durch die Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von MnCl 2 modifiziert, aber die Verwendung von unsymmetrischen dNTPs und / oder der Reduktion in Genmatrize Konzentrationen sind ebenfalls geeignete Optionen. Inherent Einschränkungen von MORPHING aus der Anzahl der Segmente kommen rekombiniert werden. Nach unserer Erfahrung können bis zu vier Proteinbausteine ​​(fünf Kreuzungsereignisse die Rekombination Bereiche mit dem linearisierten Vektor gezählt) mit guten Ausbeuten Transformation (~ 10 5 Klone pro Transformationsreaktion) gespleißt werden. Dieses Verfahren kann leicht durchgeführt mehrere orts Sättigungsmutagenese modifiziert werden (zB mit NDT degenerierten Primern oder für 22 einzigartige Codons zu schaffen Entartung) mehrere Positionen gleichzeitig zu erkunden , während signifikant die Screening - Bemühungen 21,22 reduziert. &quot;blind&quot; Screening - Protokoll für AAO ist extrem empfindlich und zuverlässig (basierend auf dem direkten Nachweis von H 2 O 2 unabhängig von dem Substrat durch das Enzym verwendet), was einen komplementären Assay zu anderen gut indirekten etabliert Protokolle Peroxide zu erkennen (meist Kopplung Peroxidasen mit kolorimetrischen Substraten). Tatsächlich wurde die FOX - Test routinemäßig eingesetzten H 2 O 2 in biologischen Flüssigkeiten zu messen, und es kann nun leicht in Protokolle übersetzt werden AAO und andere H 2 O 2 produzieren Enzyme zu entwickeln (zB Glucose - Oxidasen, Cellobiose Dehydrogenasen, Glyoxal Oxidasen, Methanol-Oxidasen), insbesondere für Aktivitäten auf nicht-natürliche Substrate, wo Antworten sonst schwer zu erkennen sind. S. cerevisiae ist der am besten geeignete Wirt für die gerichtete Evolution von eukaryotischen Genen , da es eine hohe Transformationseffizienz bietet (bis zu 1 x 106 Transformanten / ug DNA), führt es komplexe post-translationale Prozessierung und Modifikationen (einschließlich N- und C-terminale Prozessierung und Glykosylierung) und exportiert Fremdproteine ​​in die Kulturbrühe über einen Sekretionsweg. Darüber hinaus sind gut etablierte Molekularbiologie Werkzeuge zur Verfügung, mit dieser Hefe zu arbeiten, einschließlich uni- oder bidirektionalen episomale (nicht integrativ) Shuttle-Vektoren unter der Kontrolle von Promotoren unterschiedlicher Stärke. Nicht zuletzt hat die hohe Frequenz der homologen DNA - Rekombination eine Reihe von Methoden erlaubt DNA Vielfalt zu erhalten , werden entwickelt , die derzeit verwendet werden einzelne Proteine ​​zu entwickeln, sowie komplexere Enzymwege 8, 12, 13, 23. die in - vivo - Lücke Reparatur und der Beweis-Lesegerät dieser Hefe kann auch Chimären verwendet werden , zu erstellen , wenn verschiedene Gene rekombiniert (mit ca.. 60% der DNA - Sequenzidentität), sowie beste Nachwuchs / Mutationen von einem directe zu mischend Evolution Kampagne oder zusammen zu bringen , in vitro und in vivo - Rekombination Methoden in einer Runde der Evolution, wodurch Mutantenbibliotheken in Bezug auf die Faltbarkeit und Funktion zu bereichern.

Regie molekulare Evolution ist eine robuste, schnelle und zuverlässige Methode zu entwerfen Enzyme 1, 2. Durch iterative Runden zufällige Mutation, Rekombination und Screening, verbesserte Versionen von Enzymen erzeugt werden können , die auf neue Substrate wirken, in neuartigen Reaktionen, in nicht-natürliche Umgebungen oder sogar um die Zelle zu unterstützen neue metabolische Ziele 3-5 zu erreichen. Unter den Wirten in der gerichteten Evolution verwendet, um die Hefe Saccharomyces cerevisiae Brau bietet ein Repertoire an Lösungen für die funktionelle Expression von komplexen eukaryotischen Proteine ​​, die 6,7 in den prokaryotischen sonst nicht verfügbar sind. Verwendet erschöpfend in der Biologie Studien Zelle dieses kleine eukaryotischen Modell hat viele Vorteile in Bezug auf die post-translationale Modifikationen, die einfache Handhabung und Transformationseffizienz, von denen alle wichtigen Merkmale sind Enzyme zu konstruieren , durch gerichtete Evolution 8. Darüber hinaus ist die Hochfrequenzvon homologen DNA - Rekombination in S. cerevisiae gekoppelt seiner effizienten proof-Lesevorrichtung eröffnet eine breite Palette von Möglichkeiten für die Bibliothekserstellung und Genanordnung in vivo, um die Entwicklung der verschiedenen Systeme von einzelnen Enzymen zur komplexen künstlichen Wege 9-12 fördern. Unser Labor hat die letzten zehn Jahre verbrachte Tools und Strategien für die molekulare Evolution verschiedener Ligninasen in Hefe (Oxidoreduktasen beteiligt in den Abbau von Lignin während der natürlichen Holzzersetzung) 13-14 entwerfen. In dieser Mitteilung stellen wir ein detailliertes Protokoll und Bildschirm Mutantenbibliotheken in S. vorzubereiten cerevisiae für ein Modell flavooxidase, Aryl-Alkohol - Oxidase (AAO 15) -, die leicht auf viele andere Enzyme , übersetzt werden können. Das Protokoll beinhaltet eine fokussierte gerichtete Evolution - Methode (MORPHING: mutagene Organized Rekombinationsprozeß durch homologe in vivo - Gruppierung) von der Hefezelle Gerät 16 unterstützt wird , einda sehr empfindlich Screening - Test auf der Grundlage der Fenton - Reaktion , um AAO - Aktivität nachzuweisen in der Kulturbrühe sezerniert 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae bietet viele attraktive Vorteile , wenn Enzyme für biotechnologische Anwendungen entwerfen, ein Prozess, der Konstruktion, Klonierung und Expression von mutanten Bibliotheken, die mit Hochfrequenz - homologe DNA - Rekombination in vivo beinhaltet. Hier stellen wir ein Protokoll zu erstellen und Bildschirmmutantenbibliotheken in Hefe am Beispiel eines Pilz Aryl-Alkohol-Oxidase (AAO) seine Gesamtaktivität zu verbessern. Zwei Proteinsegmente wurden einer fokussierten gerichteten Evolution durch zufällige Mutagenese und in - vivo - DNA - Rekombination. Auskragungen von ~ 50 bp jedes Segment flankieren, erlaubt die korrekte Zusammenbau der AAO-Fusionsgens in linearisierter Vektor zu einem vollen autonom replizierenden Plasmid führt. Mutant Bibliotheken angereichert mit funktionellen AAO - Varianten wurden in S. gescreent cerevisiae Überstand mit einem empfindlichen Assay mit hohem Durchsatz auf die Fenton - Reaktion basiert. Der allgemeine Prozess derBibliothekskonstruktion in S. cerevisiae beschrieben hier leicht zu entwickeln viele andere eukaryotischen Genen angewandt werden, die Vermeidung zusätzliche PCR - Reaktionen, in vitro - DNA - Rekombination und Ligatur Schritte.

AAO von P. eryngii ist eine extrazelluläre flavooxidase die Pilz-Peroxidasen mit H 2 O 2 liefert Lignin zu starten angreifen. Zwei Segmente der AAO wurden fokussierte gerichtete Evolution unterworfen , indem MORPHING, um ihre Aktivität und ihre Expression zu verstärken in S. cerevisiae 19. Unabhängig von den ausländischen von S. beherbergte Enzyme cerevisiae, die kritischste Problem , wenn Mutantenbibliotheken in Hefe Konstruktion der Konstruktion von spezifischen überlappenden Regionen bezieht sich auf das Spleißen zwischen Fragmenten und deren Klonierung in den linearisierten Vektor zu begünstigen. In dem aktuellen Beispiel wird für jede PCR - Reaktion wurden alle Fragmente hatten Auskragungen von etwa 50 bp in vivo Spleißen in Hefe zu fördern. Die Anzahl der Rekombinationsereignisse abhängig ist von der Anzahl der Segmente mit dem linearisierten Vektor (dh zwei Crossover - Ereignisse zwischen dem nahm montiert und geklont werdendrei PCR Segmente -die zwei mutagenen Segmente der nicht-mutagenisierten segment- plus zwei zusätzliche Übergänge mit dem linearisierten Vektor flankieren; Abbildung 1). Nach unserer Erfahrung, überlappende Sequenzen, die länger als 50 bp, die Wahrscheinlichkeit von internen Rekombination verringern, während sie keine Transformationseffizienz zu verbessern. Mutations Lasten wurden durch Abtasten Mutantenbibliotheken mit unterschiedlichen Landschaften angepasst, um die Anzahl der Klone mit &lt;10% des Elternenzymaktivität zu berechnen und sie weiter Überprüfung durch Sequenzierung einer Stichprobe von aktiven und nicht aktiven Varianten (5A). Für die Bestimmung des Koeffizienten der Varianz S. cerevisiae - Zellen wurden mit dem parentalen AAO und plattiert auf SC-Dropout - Platten transformiert. Einzelne Kolonien wurden in einer 96-Well-Platte und die Aktivität der Klone wurde ausgewertet aus frischen Präparationen gepickt und inokuliert. mutagene Probe2 (Taq / MnCl 2 0,05 mM) wurde als Ausgangspunkt für Bibliothekskonstruktion und Screening ausgewählt. Da die biologische Aktivität von AAO das Medium H 2 O 2 -Konzentration in der Reaktion erhöht, suchten wir nach einer empfindlichen und genauen Assay geringfügige Änderungen in H 2 O 2 zu quantifizieren. FOX ist ein chemisches Verfahren auf der Grundlage der Fenton - Reaktion 20, wobei die Oxidation durch H 2 O 2 treibt die Reaktion von Fe 3+ mit Xylenolorangelösung ein blau-lila - Komplex (o -cresolsulfone-phthalein 3 zu bilden &#39;, 3&#39; &#39;- Bis (methylimino) diacetat ε 560 = 1,5 × 10 4 M -1 cm -1). Der Eisenoxidationsschritt wurde amplifiziert Sorbit durch Zugabe der Empfindlichkeit des Assays zu verbessern, um die Ausbreitung von Radikalen mit einer scheinbaren Erhöhung ε 560 = 2,25 x 10 5 M -1 cm -1 (FiAbbildung 4). Die Nachweisgrenze dieses Tests (im um - Bereich) durch die Blank - Bestimmungsverfahren in einer 96-Well - Platte mit den Standards in dreifacher Ausführung (0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 und 4 uM H berechnet 2 O 2 ) und mehrere Überstände von S. Verwendung cerevisiae fehlt das URA3 - Plasmid (5B). Der Assay war linear in Gegenwart von Sorbit (bis zu 8 &amp; mgr; M H 2 O 2), und obwohl die Linearität in Abwesenheit dieses Zuckers mehr persistent war (zumindest bis zu 30 &amp; mgr; M H 2 O 2) die Reaktion schwächer (beispielsweise bei 6 &amp; mgr; M H 2 O 2, eine 4-fache Verstärkung wurde in Gegenwart von Sorbit -deep purpur von einer Extinktion von 0,24 in ihrer Abwesenheit erhalten -dunkel orange- (5B)). Die Beziehung zwischen Abs und der AAO-Konzentration wurde mit steigenden Mengen von e ausgewertetnzyme (von Hefeüberstände) und eine lineare Reaktion beobachtet wurde; R 2 = 0,997 (5C). Es ist bemerkenswert, dass die FOX-Signal für mehrere Stunden ohne sichtbare Störung durch die verschiedenen Elemente in der Kulturbrühe stabil war. Die geschätzte Empfindlichkeit von FOX betrug ~ 0,4 &amp; mgr; M H 2 O 2 durch die AAO im Überstand produzierten in Gegenwart von Sorbit und ~ 2 &amp; mgr; M in seiner Abwesenheit. Eine Mutantenbibliothek von 2.000 Klonen wurde mit diesem Assay konstruiert und gescreent. Mehrere AAO - Mutanten wurden mit deutlich verbesserte Sekretion und Aktivität gegen p - Methoxybenzyl Alkohol (5D) 19 identifiziert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig1.jpg" /> Abbildung 1.. MORPHING Protokoll für AAO Entwicklung Zwei verschiedene Regionen von AAO wurden für statistische Mutagenese und Rekombination gezielt: M1 (blau, 590 bp), die das Signalpeptid (SP) umfasst; M2 (gelb, 528 bp). Der HF-Bereich (grau, 844 bp) wurde mit High-Fidelity-Polymerasen amplifiziert. Mutagene Regionen wurden in der Kristallstruktur von AAO (PDB ID: 3FIM) abgebildet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig1large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig2.jpg" /> Figure 2. Herstellung von PCR - Produkte und der linearisierte Vektor (A) Analytical Agarosegel (1% w: v). , Die einen Molekulargewichtsmarker (1 kb - Leiter) in den Bahnen 1 und 7; die Bam HALLO und XhoI linearisierte Vektor, Spur 2; PCR-Segment M1, Spur 3; PCR-Segment M2, Spur 4; PCR-Segment HF, Spur 5; die in vivo zusammengesetzt Vektor mit NheI linearisiert I (enthaltend das vollständige AAO - Gen mit Regionen MI, HF und M-II), Spur 6 (B) Vektorlinearisierung, Bahnen 1 und 6 molekulare Standards, 1 Kb Leiter; Plasmid Miniprep, Spur 2; Plasmid linearisiert mit NheI, Spur 3; Plasmid linearisiert mit Bam HALLO und Xho I, Bahn 4; linearisierte Plasmid durch Gel - Extraktion und Reinigung nach der Verdauung, Spur 5 (C) Protokoll für die Plasmid - Reinigung erhalten. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig3.jpg" /> Abbildung 3. Hochdurchsatz - Screening - Protokoll. Überblick über den Prozess. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier einen größeren vers zu sehen</a>Ion dieser Figur. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig4.jpg" /> Abbildung 4. Die FOX - Methode. Weißfäulepilze greifen die Zellwand aus Holz durch eine Fenton - Reaktion , die Hydroxyl - Radikal OH • erzeugt. Die FOX Verfahren koppelt diese Reaktion Xylenolorangelösung (XO), und die Absorption des XO-Fe 3+ Komplexes wird bei 560 nm gemessen. Eisenoxidation durch Zugabe von Sorbit zu Reagenzmischung verstärkt wird. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53761/53761fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig5.jpg" /> Abbildung 5. mutagene Landschaften für Bibliotheken unter Verwendung verschiedener fehleranfällige PCR - Bedingungen und Validierung des Screening - Assays MORPHING. (A </stro<html> ng&gt;) MORPHING Landschaften. Feste horizontale Linie zeigt die Aktivität des Elterntyp in dem Test, während die gestrichelten Linien die Variationskoeffizient des Assays anzeigen. Die Prozentangaben geben die Anzahl der Klone mit weniger als 10% des parentalen Enzymaktivität. Die Aktivitäten sind in absteigender Reihenfolge aufgetragen. (B) Die Grenze FOX Erkennung ausgewertet wurde mit Konzentrationen von H 2 O 2 in Gegenwart (schwarze Kreise) und Abwesenheit (weiße Quadrate) von Sorbit zu erhöhen. (C) lineare Korrelation zwischen AAO - Konzentration (Transüberstand) und Abs 560nm. Jeder Punkt entspricht dem Mittelwert von 8 Experimenten und enthält die Standardabweichung. (D) Mutant Bibliothekslandschaft. Die ausgewählten Varianten (beschatteten Platz) wurden als anderswo 19 berichtet gescreent. Durchgezogene Linie zeigt die Aktivität von AAO Elterntyp.&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Entwicklung Methode Regie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Bibliothek Schöpfung und Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Aufrufe.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Serie: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Forschung

Genetik

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologie

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Optimierung der Proteinfunktionen durch Techniken zur Anzeige von Hefeoberflächen

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biotechnik

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Entwicklung Methode Regie in

Zusammenfassung

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Gen gezielt Random Mutagenesis Heterochromatin destabilisieren Proteasom Mutanten in Spalthefe auswählen

Paarung-basierte Überexpression Bibliothek Screening in der Hefe

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

Competitive Genomic Screens von Barcoded Hefe Bibliotheken

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Schnelle Identifikation von chemischen Genetische Interaktionen in