Name: high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications
Uploaded: 2016-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications at JoVE.com

We thank Dr. M. Rosenberg for her advice and help with anatomical sectioning. We also thank D. Eisler for his technical assistance. This research was supported by grants from FP7-PEOPLE-IRG-2008, Binational Agriculture research and Development (BARD; IS-4246-09), and Israel Science Foundation (ISF; 592/13).

1. Pflanzenwachstum <ol><li> Oberflächen sterilisieren Samen. <ol><li> Sterilisieren Samen (bis zu 30 mg) durch Nass- oder Trockenverfahren. Als Beispiel für die Trockensterilisationsverfahren, 1 ml glazialen HCl 37% in 50 ml Bleichmittel, in einem Becherglas in einem geschlossenen Exsikkator für mindestens 4 Stunden und bis über Nacht. Führen Sie diesen Schritt in einer chemischen Haube. </li></ol></li><li> Verbreiten Sie die sterilen Samen auf Platten mit 0,8% Plant Agar in 0.5x Murashige &amp; Skoog (MS) Medium. Wrap-Platten mit Parafilm oder porösen Band und mit Alufolie abdecken. </li><li> Lagern Sie die Platten bei 4 ° C für 1 - 4 days einheitliche Keimung zu fördern. </li><li> Übertragen , um die Platten in eine Wachstumskammer geeignet für den Anbau Arabidopsis Keimlingen. Legen Sie die Platten vertikal Wurzelwachstum auf dem Agar-Medium zu erhalten und das Eindringen zu verhindern. </li><li> Transfer-Setzlinge zu Fixiermittel 7 Tage nach der Keimung (DAG). </li></ol> 2. Fixation <ol><li> Bereiten Sie 50 ml Richardson Solution von gleichen Volumina von 1% Borax (Puffermittel), 1% Methylenblau und 1% Azure (histologische Farbstoffe) in doppelt destilliertem Wasser kombiniert. Filter durch eine Spritze Driven 0,22 um PVDF-Filtereinheit vor dem Gebrauch. </li><li> Vorbereitung 50 ml Fixierlösung: 1,25% Glutaraldehyd in 0,05 M Natriumcacodylat (Puffermittel). Anmerkung: Diese Materialien sind toxisch und müssen in einer chemischen Haube verarbeitet werden. </li><li> 100 l Richardson Lösung (siehe 2.1) auf die Fixierungslösung (siehe 2.2), um die endgültige Fixierung Lösung zu erhalten. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen. </li><li> Platz 2 - 3 ml endgültige Fixierung Lösung (siehe 2.3) in die Vertiefungen, so dass die Sämlinge, einmal übertragen, wird vollständig in Flüssigkeit bedeckt sein. </li><li> Sorgfältig übertragen, Pinzette, zu jeder Vertiefung bis zu 10 Sämlinge. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm. Lagerung bei 4 ° C, in der Finsternis, für mindestens eine Nacht, und bis zu einer Woche. </li></ol> 3. Dehydration <ol> &lt;li&gt; Entwässern Sämlinge. Übertragen sie zwischen Vertiefungen neue Platten mit 6 Vertiefungen, enthaltend Konzentrationen von Ethanol zu, wie hier aufgeführt: 10% Ethanol für 15 min; 30% Ethanol für 15 min; 50% Ethanol für 15 min; 70% Ethanol für 15 min; 85% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol für 15 min; 95% Ethanol bei 4 ° C, über Nacht bei Minimum. Griff Sämlinge indem man sie vorsichtig in ihren Kotyledonen, bevorzugt mit Kunststoff-Pinzette greifen. </li></ol> 4. Infiltrations <ol><li> Bereiten Sie Infiltrationsmedium. Mischen Sie den Inhalt von 1 Beutel des Historesin Kit-Aktivator mit 50 ml Basisharzflüssigkeit Kit in einer kleinen Glasflasche. Rühren mit Magnet für 20 min. Infiltrationsmedium kann bei 4 ° C für ein paar Wochen aufbewahrt werden. </li><li> Markieren Sie jede Vertiefung einer neuen 6-Well-Platte mit dem entsprechenden Beispielnamen und füllen mit 2 - 3 ml Infiltrationsmedium. </li><li> Übertragen Sie die Sämlinge aus der 95% igen Ethanollösung zu dem Infiltrationsmedium mit einer Pinzette. Stellen Sie sicher, die Sämlinge sind fully vom Medium bedeckt. </li><li> Lagerung bei 4 ° C für mindestens 4 Tage, maximales Eindringen in die Pflanzengewebe zu gewährleisten. </li></ol> 5. Satzvorbereitung <ol><li> Legen Sie kleine Etiketten, Bleistift-markiert mit Beispielnamen, innerhalb jeder Vertiefung Einbettschälchen. </li><li> Bereiten Sie Einbettmedium durch Zugabe von 1 ml Härter 15 ml Infiltrationsmedium (siehe 4.1). Versuchen Sie nicht, ein Volumen von weniger als 15 ml herzustellen, Polymerisation Probleme zu vermeiden. </li><li> Füllen Sie die Hälfte jeder Vertiefung in der Form mit 200 ul Einbettungsmedium und Abdeckung mit einem Overhead-Folienstück auf die Form Form geschnitten, sondern zu einer Größe von 1 mm größer auf jeder Seite. Inkubieren bei Raumtemperatur mindestens 2 h für die Polymerisation zu ermöglichen. Nicht 5 Stunden nicht überschreiten. </li><li> Bereiten Sie eine zusätzliche Charge von Einbettmedium (siehe 5.2) und auf Eis halten, Polymerisation zu vermeiden, während der Wurzelspitzen in der Form angeordnet werden. </li><li> Schneiden Sie jede Wurzelspitze unter einem Binokular Skalpell und sehr sorgfältig positionieren it: senkrecht zur Querschnitte oder horizontal für Längsschnitt, bei etwa 2 - 3 mm von der Formperipherie. Füllen Sie die Form vollständig mit Blocking-Lösung und die Abdeckung mit einem Overhead-Folie. Beachten Sie, dass die Blockierungslösung leicht schrumpfen wird, wenn es polymerisiert wird. </li><li> Halten Sie bei Raumtemperatur für 2 Stunden, bei Minimum. </li><li> Um die Blöcke trocknen, legen Sie in einem Kasten mit trockenem Kieselgel und lassen bei Raumtemperatur bei mindestens über Nacht. </li></ol> 6. Sectioning <ol><li> Bereiten Glasmesser aus Glasstäben mit einem Messer ausgestattet. Verwenden Sie die Glasmesser für Gewebe Schnitte. Schneiden Sie den Glasstab in ein Quadrat und dann schneiden Sie das Quadrat diagonal zwei Messer zu produzieren, ein Diamant-Scoring-Tool. </li><li> Die Sperrung der Abschnitte in 2 - 3 &amp; mgr; m Breite Scheiben, mit schneidender Maschine. Die Scheiben auf einem Glasträger, auf destilliertes Wassertröpfchen und den Objektträger auf einem Wärmeblock zu geringe Wärme gesetzt (50 - 60 ° C), bis das Wasser verdunstet. </li></ol><ol><li> Verdünnte Richardson-Lösung (siehe 2.1) auf 0,2% der ursprünglichen Lösung und mit 1 ml davon die Scheiben zu bedecken. Legen Sie auf dem Wärmeblock für 5 Sekunden und dann mit destilliertem Wasser waschen. </li><li> Trocknen Sie die Folie auf einer heißen Platte. Beachten Sie unter einem Binokular und die Rückseite der Folie mit einer Markierung zu markieren, um die Position der Scheiben von Interesse zeigen, ihre spätere Identifizierung unter dem Mikroskop zu erleichtern. </li><li> 100 l Eindeckmediums und Abdeckung mit einem Deckglas. </li></ol> 8. Image Acquisition <ol><li> Legen Sie die bedeckte Schlitten die Wurzelabschnitte unter einem Lichtmikroskop ausgestattet mit PolScope System , das geeignet ist, um Retardierung Informationen und einen Polarisator / Interferenzoptikfilter (Abbildung 1 AD) erhalten. </li><li> Wählen Sie Vergrößerung , die klare Visualisierung der gesamten Probe erlaubt (zB 40X in dieser Studie) und konzentrieren sich die microscope auf einem leeren Feld, das Blockabschnitt aber keine Wurzel Abschnitt enthält. Versuchen Sie, eine saubere Region ohne Makel zu finden. Verwenden Sie diese Region den Hintergrund zu setzen. </li><li> Stellen Sie die Abbildungssystem und Software-Parameter: Stellen Sie Bereich bis 17 nm. Übernehmen &quot;Auto Exposure&quot; und Hintergrundbild aus dem leeren Feld erhalten (siehe 8.2). Einem Hintergrundbild wird pro Experiment verwendet. </li></ol> 9. PolScope Analyse von Cellulose Mikrofibrillen Orientierung <ol><li> Analyse von Längsschnitten. <ol><li> Legen Sie eine Folie mit Längsschnitten unter dem Mikroskop und erhalten eine Retardierung Bild davon. Konzentrieren Sie das Mikroskop auf einem Wurzelabschnitt von Interesse. Geben Sie einen neuen Dateinamen. </li><li> Aufnehmen eines Abrio Bild (Bild mit Verzögerung Informationen) durch die &quot;Live Abrio&quot; Fenster. Sicher sein , einen Abschnitt zu erfassen , die die Zellwand enthält, die von der gefärbten Cellulose identifiziert werden können , die entlang des Umfangs der Zelle ausgeführt wird , wie in 2C gezeigt.</li></ol></li><li> Die Bildanalyse. <ol><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Ausrichtung Pseudo Farbe&quot; im &quot;Display Settings&quot;. </li><li> Um die Zellulose microfibril Winkel abschätzen zu können, passen Sie die entsprechenden Schatten der Zellwand, das dem in dem Farbrad. HINWEIS: Das Farbrad in Figur 2C zeigt die langsame Achse des Lichts entlang der Mikrofibrillen liegen , die der Richtung entlang der langen Achse der Mikrofibrillen zeigt. Der Winkel der Cellulose-Mikrofibrillen ist der Winkel zwischen der Farbe und der langen Achse der Zelle angezeigt. Zum Beispiel zeigt die elongating Zelle in der eingesetzten Farbe Zyan, um etwa 90 ° zur langen Achse der Zellen verkippt. </li><li> Um die durchschnittliche microfibril Winkel in der Zellwand zu quantifizieren, verwenden Sie &quot;Hemmung und Azimuth Stamp&quot; aus der Werkzeugleiste der Software. Während das Werkzeug, Punkt auswählen und in dem erhaltenen Bild auf dem Gebiet von Interesse klicken. HINWEIS: Diese will Ergebnis in der Anzeige der Winkel (Azimut) in Grad (Figur 2C). </li><li> In einer alternativen Open-Access-polarisierten Lichtbildanalyse-Software, Mittagessen &quot;Pol-Analyzer&quot; Plugin aus dem Plugin-Menü. Im neu geöffneten Fenster wählen Sie die &quot;Doppelbrechungs&quot; und öffnen Sie dann die Hintergrunddatei und die Bilddatei speichern. </li><li> Im Bildfenster, wählen Sie &quot;Specs.&quot; und stellen Sie die &quot;ROI Pixelgröße&quot; (Einsatz 5 Pixel für diese Studie). Im &quot;Specs.&quot; Wählen Sie im Fenster &quot;zeigen Werte in Ergebnistabelle&quot;. </li><li> Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug, um die Region von Interesse im Bildfenster zu markieren. Wählen Sie &quot;Orientierungslinien&quot;, um die Ausrichtung der Cellulose Mikrofibrillen erhalten. ANMERKUNG: Diese in der Anzeige der Winkel führen (Azimut) in Grad. HINWEIS: Der Durchschnittswinkel berechnet, indem einer der beiden Methoden, dann entlang der Rutsche zur Positionierung des Fußabschnitts normalisiert werden sollte. Zur Korrektur für die Abweichung vondie horizontale Positionierung des gesamten Wurzelabschnitt entlang der Rutsche, quantifizieren die durchschnittliche microfibril Winkel der Zellwand der Zelle entlang ihrer langen Achse flankieren (dh, senkrecht zu dem Abschnitt und entlang der Achse des Wurzelwachstums, 2C). Dieser Winkel 180 ° beträgt, wenn der Wurzelabschnitt genau entlang der Rutsche positioniert ist. Für den microfibril Winkel zu berechnen, subtrahieren den Mittelwert gemessen microfibril Winkel der flankierenden Zellwand von 180 °. Fügen Sie den ergab Unterschied zu den durchschnittlichen gemessenen microfibril Winkel der Zellwand, die auf der Folie flach liegt. </li></ol></li></ol> 10. PolScope Analyse der kristallinen Cellulose Accumulation <ol><li> Verwenden Sie die Quer (Kreuz) Abschnitte. Man beachte, dass kristalline Cellulose Akkumulation kann nur zwischen den Zellen verglichen werden, wenn die Cellulose-Mikrofibrillen in einem ähnlichen Winkel ausgerichtet sind (wie in 9 bestimmt). </li><li> Doppelklicken Sie auf das entsprechende Bild im Bildstapel. Wählen Sie &quot;Pseudonym Farbe &quot;im&quot; Display Settings &quot;. </li><li> Zur Messung der Retardierung. Zoom-in auf das Bild. Wählen Sie &quot;Region&quot; und alle Regionen von Interesse zu markieren. Umzug in die &quot;Messungen&quot; klicken und alle Werte &quot;In Zwischenablage kopieren&quot;. <ol><li> Übertragen Sie die Daten in Excel und extrahieren erforderlichen Informationen (mittlere Region Retardierung). Normalisieren der Daten. HINWEIS: Um Unterschiede in der Dicke zwischen den Schichten ausmachen, drücken die Werte relativ zu einer bestimmten Zellwandkante in der Folie. Zu normalisieren, teilen die durchschnittliche Verzögerung an die Zellwand von Interesse durch die durchschnittliche Verzögerung von einer anderen Zellenwand in der gleichen Bild entspricht. So wurde beispielsweise die äußere epidermale Zellwand zu der inneren kortikalen Zellwand in unserer Studie normalisiert. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie die Messungen für mindestens 3 Abschnitte pro Wurzel, mit einem Minimum von 3 Wurzeln pro Probe. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+plant+cell+wall.">Growth of the plant cell wall.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 850-861 (2005).</li><li>Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control+and+cell+wall+signaling+in+plants.">Growth control and cell wall signaling in plants.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).</li><li>Mazeau, K., Heux, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Dynamics+Simulations+of+Bulk+Native+Crystalline+and+Amorphous+Structures+of+Cellulose.">Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose.</a> J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+cellulose+fiber+structure+by+SEM,+XRD,+NMR+and+acid+hydrolysis.">Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis.</a> Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).</li><li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+microtubules+optimize+cell-wall+crystallinity+to+drive+unidirectional+growth+in+Arabidopsis.">Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis.</a> Plant J. 66, 915-928 (2011).</li><li>Peng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractional+separation+and+structural+features+of+hemicelluloses+from+sweet+sorghum+leaves.">Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves.</a> Bioresources. 7, (2012).</li><li>Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+leucine-rich+repeat+receptor+kinases+mediate+signaling,+linking+cell+wall+biosynthesis+and+ACC+synthase+in+Arabidopsis.">Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Imaging+of+Cellulose+Reorientation+during+Cell+Wall+Expansion+in+Arabidopsis+Roots.">Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots.</a> Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).</li><li>Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disorganization+of+cortical+microtubules+stimulates+tangential+expansion+and+reduces+the+uniformity+of+cellulose+microfibril+alignment+among+cells+in+the+root+of+Arabidopsis.">Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).</li><li>Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birefringence+of+native+cellulosic+fibers.+I.+Untreated+cotton+and+ramie.">Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie.</a> J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).</li><li>Abraham, Y., Elbaum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+microfibril+angle+in+secondary+cell+walls+at+subcellular+resolution+by+means+of+polarized+light+microscopy.">Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy.</a> New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).</li><li>Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Arabidopsis+root+development.">Control of Arabidopsis root development.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 563-590 (2012).</li><li>Vanstraelen, M., Benkova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hormonal+Interactions+in+the+Regulation+of+Plant+Development.">Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).</li><li>Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+control:+brassinosteroid+activity+gets+context.">Growth control: brassinosteroid activity gets context.</a> J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).</li><li>Fridman, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+growth+is+modulated+by+differential+hormonal+sensitivity+in+neighboring+cells.">Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells.</a> Genes Dev. 28, 912-920 (2014).</li><li>Vragovic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translatome+analyses+capture+of+opposing+tissue-specific+brassinosteroid+signals+orchestrating+root+meristem+differentiation.">Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).</li><li>Hacham, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brassinosteroid+perception+in+the+epidermis+controls+root+meristem+size.">Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size.</a> Development. 138, 839-848 (2011).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cellulose+synthase-associated+protein+required+for+cellulose+biosynthesis.">Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).</li><li>Fendrych, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+controlled+by+ANAC033/SOMBRERO+determines+root+cap+organ+size+in+Arabidopsis.">Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis.</a> Curr Biol. 24, 931-940 (2014).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

Hier stellen wir ein Verfahren zur Bestimmung der Anreicherung von kristalliner Cellulose in den verschiedenen Geweben , die Arabidopsis Wurzeln Komponieren, während anatomische Information erhalten bleibt. Als solches bietet es einen zusätzlichen Schritt in Richtung Wachstum zu verstehen Prozesse in Pflanzen auf zellulärer Auflösung. Dieses Verfahren kann auch für die Untersuchung der zusätzlichen Pflanzenarten und Organe angewendet werden. Eine Reihe von Punkten berücksichtigt werden müssen, wenn das Verfahren anwenden. Erste, kristalline Cellulose Akkumulation in einem gegebenen Fußabschnitt kann unter Geweben verglichen werden, unter Abschnitte aus verschiedenen Genotypen und zwischen den Behandlungen, wenn die Ausrichtung ihrer Cellulosemikrofibrillen ist ähnlich. Cellulose - Mikrofibrillen Orientierung im Längsschnitt , die eine Fläche der Zellwand 18 bestimmt. Daher ist die Reihe von Längsschnitten, die unterschiedlichen Geweben der Wurzeln bedeckt, von der äußeren zu den inneren meisten diejenigen, ermöglichen analysist der Cellulose-Mikrofibrillen Orientierung in den verschiedenen Geweben in einem Entwicklungsstadium gegeben. In dem hier gezeigten Beispiel haben die meristematischen Zellen der Epidermis eine Vielzahl von Cellulose-Mikrofibrillen Orientierungen mit einer durchschnittlichen Cellulosemikrofibrillen Winkel von 140 °, während die verlängernden Zellen der Epidermis eine organisierte Struktur mit einer durchschnittlichen Cellulosemikrofibrillen Winkel 120 °. Diese Messungen waren ähnlich zwischen Wildtyp und der Mutante von Interesse, wodurch ein zuversichtlich Vergleich ihrer relativen kristalline Cellulose Akkumulation ermöglicht, in den entsprechenden Zelltypen und Entwicklungszone. Zweitens Variabilität in der Breite der verschiedenen Abschnitte können die Ebenen der Lichtverzögerung gemessen auswirken. Dies wird hier umgangen, indem die rohe Retardierung Messungen des Gewebes von Interesse (Epidermiszellen) Normalisieren zur Retardierung Messung eines unterschiedlichen Gewebe (cortex Zellen). Die normierten Werte are verglichen (siehe Abbildung 2E-G). Schließlich Querschnitte entlang der Wurzel, verschiedene Entwicklungszonen zu erfassen. Identifizierung dieser Zonen im Querschnitt ist für die Interpretation der Daten wichtig. Der Verlust der äußersten Zellschicht laterale Wurzelkappe im Abschnitt umfassen einen einfachen Zonenmarkierung. In der Regel beginnen Zellen ihre schnelle Expansion , wenn die älteste Zelle der Seitenwurzelkappe programmierten Zelltod erfährt, worauf wird die ungeschützten Epidermis die äußerste Gewebe 19. Derzeit sind Verfahren, die eine zelluläre Auflösung Maß für das Verhältnis des kristallinen gegenüber den amorphen Cellulose Domänen bereitzustellen fehlen. Tatsächlich ist dies auch eine Begrenzung des hier vorgestellten Verfahren. Jedoch seine Fähigkeit , die Akkumulation von kristalliner Cellulose per se ist ein bedeutender Fortschritt, wie hohen relativen Mengen an kristalliner Cellulose zu kommunizieren , macht wahrscheinlich einerobuste Zellwand mit einer erhöhten Zugfestigkeit. Entwicklung von hochauflösenden Werkzeugen genau die Zusammensetzung der Zellwand neben seinen mechanischen Eigenschaften bestimmen bleibt eine Herausforderung für die Zukunft.

Die Pflanzenzellwand ist eine dynamische Struktur. Wachsende Zellen werden durch eine primäre Zellwand umgeben ist, zu erweitern die Organisation, der ermöglicht Zellen. Zellen, die Kaution zu wachsen, um eine steifere Sekundärwand aufhören, die die mechanische Unterstützung der Anlage verbessert. Beide Zellwände bestehen aus Cellulose - Mikrofibrillen zusammengesetzt in einer Matrix aus Polysacchariden verschiedener Strukturen eingebettet (beispielsweise Hemicellulose und Pektin), die über die verschiedenen Entwicklungsstadien variieren und Geweben 1,2. Cellulose wird synthetisiert, wie Ketten (1,4) -β-D-Glucan, die eng ausgerichtet sind, die Mikrofibrillen einer kristallinen Struktur zu bilden. Amorpher Cellulose bezieht sich auf die Regionen, in denen die Glucan-Ketten weniger geordnet. Das Verhältnis zwischen dem kristallinen und dem amorphen Domänen ist ein Parameter gedacht , um die mechanischen Eigenschaften der Zellwand beeinflussen, durch die mechanische Festigkeit und viskoelastische Eigenschaft Bereitstellen bzw. 3. Verschiedene Verfahren wurdenentwickelt , um die zwei Formen von Cellulose Anordnung zu detektieren und zu quantifizieren, darunter Röntgenbeugung und Kreuzpolarisation / Magic Angle NMR Solid-State - Spinnen 4. Röntgenbeugung kann verwendet werden , um den Anteil an kristallinen gegenüber amorpher Cellulose Domänen in der Probe 5 zu bestimmen. Eine alternative Methode verwendet Fraktionierung von Zellwand-Gehalt in säureunlösliche und säurelösliches Material, zwischen dem kristallinen und amorphen Cellulose oder anderen Polymeren zu unterscheiden, respectively. Bei diesem Ansatz Einbau markierter Glukose ([14 C] Glucose) wird verwendet , um die Cellulose 6,7 zu quantifizieren. Diese Verfahren erfordern große Mengen von Pflanzenmaterial für ganze Organ Analysen allenfalls und daher sind unzureichend empfindlich auf gewebespezifische Variation in der Zellwandstruktur. Visualisierung von Zellulosemikrofibrillen auf zellulärer Auflösung kann in Live - Imaging - Studien mit Fluoreszenzfarbstoffen 8,9 kombiniert erreicht werden, dass Änderungen erkennen können,die Orientierung der Cellulosemikrofasern. Jedoch werden diese Farbstoffe nicht zur Quantifizierung verwendet, sie sind nicht spezifisch Cellulose kristallin und kann mit der normalen Struktur der Zellwand 8 stören. PolScope ist ein bildgebendes Verfahren , das auf der Fähigkeit von kristalliner Cellulose beruht Lichtstrahlen zu teilen und einen Teil des Lichts 10 zu verzögern. Licht Retardierung ist am stärksten für Mikrofibrillen, die senkrecht zur Richtung der Lichtausbreitung liegen. Für Mikrofibrillen mit ähnlicher Orientierung, desto höher ist der Grad der Kristallinität ist , desto größer der Lichtverzögerung 11. Daher wird PolScope verwendet zu untersuchen, sowohl die relativen Niveaus und der Orientierung der Cellulosemikrofasern. Wurzeln aufweisen lineares Wachstum, bei der Zellen an der Stammzellnische Ursprung an der Spitze der Wurzel, durchlaufen eine Reihe von Zellteilungen, bevor sie schnell 12 erweitern. Die Zellen, die das Wurzel erweitern in einer unidirektionalen (anisotroper)Art und Weise, wie durch kleine Molekül Signalisierungs Hormone diktiert, die die Eigenschaften der Zellwand 13 auswirken. Differential Reaktionen auf Hormone, in Zeit und Raum, ein Mittel zur Gewährleistung einer ausgewogenen Organwachstum 14. Daher können hochauflösende Analyse der Zellwandstruktur wichtige Informationen, die notwendig sind, um besser die Verbindung zwischen Zelltyp-spezifische Antworten auf ganze Organwachstum zu verstehen. Hier berichten wir über die Umsetzung der PolScope gewebespezifische Anreicherung von kristalliner Cellulose in Arabidopsis Wurzeln zu untersuchen, wie es in hoher Qualität anatomischen Abschnitten beobachtet. Dieses Verfahren kürzlich zelltypspezifischen Anhäufung von kristalliner Cellulose in Reaktion auf räumliche Störung der hormonellen Aktivität 15 freigelegt.

<table><tbody><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog (MS)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>LOBA CHEMIE&amp;nbsp;</td><td>6038</td><td></td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M-9140</td><td></td></tr><tr><td>Azure</td><td>Sigma</td><td>861065</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter&amp;nbsp;</td><td>MILLEX-GV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>EMS</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma</td><td>C-0250</td><td></td></tr><tr><td>Leica kit historesin&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>7022 18 500</td><td></td></tr><tr><td>embedding molds</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3530</td><td></td></tr><tr><td>film 100 &amp;micro; P.P.C.&amp;nbsp;</td><td>www.Jolybar.com</td><td></td><td>overhead film</td></tr><tr><td>Knivemaker</td><td>LKB</td><td>7800</td><td></td></tr><tr><td>Ultratome III</td><td>LKB</td><td>8800</td><td>Ultratome</td></tr><tr><td>Shandon immumount&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>9990402</td><td>mounting medium</td></tr><tr><td>light microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td></td></tr><tr><td>Abrio imaging system</td><td>CRI</td><td>Abrio imaging system</td><td></td></tr><tr><td>Abrio V2.2 software</td><td>CRI</td><td>Abrio V2.2 software</td><td></td></tr><tr><td>Open access polarized light image analysis software &amp;nbsp;</td><td>OPS</td><td>OpenPolScope</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.openpolscope.org/&quot;&gt;http://www.openpolscope.org/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

high resolution quantification of crystalline cellulose accumulation in arabidopsis roots to monitor tissue-specific cell wall modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

Wir untersuchen die Auswirkungen der zelltypspezifische Reaktionen auf Brassinosteroiden (BRS), mit der Arabidopsis Wurzel als Modellorgan 15-17. Wenn der BR - Rezeptor BRI1 richtet, in dem Hintergrund BRI1 mutant, zu einer Untergruppe von Epidermiszellen nicht-Haarzellen (2A, B) genannt, es unidirektionalen Zellexpansion benachbarter Zellen hemmt und Vollwurzelwachstum 15. PolScope Analyse wurde durchgeführt, um den Mechanismus zugrunde liegen diese Hemmung zu offenbaren. Längsschnitte der Wurzel aus dem Wildtyp erhalten und von den Leitungen nur BRI1 in nicht-Haarzellen exprimieren, zeigten ähnliche Orientierung der Cellulosemikrofasern (2C, D und , wie in 9.2.3 beschrieben) und ermöglicht den Vergleich der relativen Anreicherung von kristallinem Cellulose in meristematischen und verlängernden Zellen unter Verwendung von Querschnitten aus diesen Zonen entnommen (2E, F). Diese Analyse zeigte eine correlatIon zwischen BRI1 Expression in nicht-Haarzellen und lokale Anhäufung von kristalliner Cellulose. Follow - up - Experimente zeigten , daß milde Hemmung der Cellulosesynthase durch niedrige Konzentrationen von Isoxaben abgesenkt , um den Grad der kristallinen Cellulose in diesen Zellen, was wiederum teilweise Wachstumshemmung wiederhergestellt, durch die Förderung von unidirektionalen Zellexpansion und Wurzellänge 15. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig1.jpg" /> Abb . 1: Polarisierte Lichtmikroskopie - System Das PolScope System besteht aus einem Lichtmikroskop (A), mit einer CCD - Kamera ausgestattet (B), Analysator und einem grünen auf seiner Lichtquelle angeordnet Flüssigkristall (C) (D). Abrio Software wurde für die Bildaufnahme und Analyse verwendet. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53707/53707fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier t</a>o eine größere Version dieser Figur sehen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53707/53707fig2.jpg" /> Abbildung 2: PolScope Analyse von Zellwand Zusammensetzung. (A) Querschnitt der Arabidopsis Primärwurzel zeigt radiale Organisation seiner konstituierenden Gewebe. Von diesen sind die epidermalen nicht-Haarzellen (N); Haarzellen (H) und Cortex (C) sind gekennzeichnet. Bar, 10 &amp; mgr; m. (B) Die konfokale Mikroskopie Bilder von Wurzeln zum Ausdruck BRI1-GFP gezielt auf nicht-Haarzellen. Weiß, PI-Färbung, die die Zellen, Grün, BRI1-GFP-Expression markiert. Bar, 20 &amp; mgr; m. (C) Längsschnitte von Wurzeln von Wildtyp erhalten und aus Pflanzen BRI1 in nicht-Haarzellen exprimieren. Der Winkel der Cellulose - Mikrofibrillen (dh der Winkel zwischen der Farbe und Zell langen Achse, der Längsachse des Wurzel reflektierend) ist ähnlich zwischen den beiden Linien. Die Zellwand der Zelle entlang ihrer l flankierendenOng-Achse ist umgeben; Winkelmarke der schattierten Zellwand dar, die gemessen wird. Bar, 50 &amp; mgr; m. (D) Quantifizierung von Cellulose microfibril Winkel in epidermalen Zellwänden. Beachten Sie die hohe Variabilität der Winkel in meristematischen Zellen (dh meristematischen Zone, MZ) im Vergleich zu Zellen in der Übergangszone (TZ), wie sie in der Box - Plot reflektiert. Der ähnliche durchschnittliche Cellulose microfibril Winkel zwischen Wildtyp und Pflanzen BRI1 in nicht-Haarzellen exprimieren, ermöglicht den Vergleich der kristallinen Cellulose Akkumulation in Zellen ihrer entsprechenden Entwicklungszone. Der durchschnittliche Winkel in jeder Probe wird durch eine rote Linie angezeigt. (EF) Wurzelquerschnitte dieser gleichen Pflanze Hintergründe, in Licht Retardierung Modus angezeigt. Farbskala repräsentiert Licht Retardierung von 0-17 nm. Abschnitte entsprechend dem Meristem (E) und die Dehnung (F) Zonen gezeigt. Bar, 50 um. Die äußere epidermalen Zellwand und Innenkortikale Zellwand sind eingekreist. (G) Quantifizierung der Retardierung Werte wie aus den PolScope Bilder berechnet. Die Werte werden als Verhältnis von Verzögerung zwischen der äußeren epidermalen Zellwand und der inneren kortikalen Zellwand ausgedrückt. Man beachte, dass die hohe Abscheidung von kristalliner Cellulose in nicht-Haarzellen in Linien nur BRI1 in diesen Zellen exprimiert. Mittelwert + SE; 40 &lt;n &lt;600; (**) P &lt;0,01; (***) P &lt;0,001 in einem two-tailed t-Test. Die Figur wurde von 15 angenommen und geändert werden . <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53707/53707fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications at JoVE.com

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

high-resolution-quantification-crystalline-cellulose-accumulation

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

8.1K Aufrufe.  Technion-Israel Institute of Technology. Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Serie: High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

Umfassende Analyse der Zusammensetzung von pflanzlichen Zellwänden (Lignozellulose) Teil II: Kohlenhydrate

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Forschung

Biologie

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Label-freie In situ Imaging der Verholzung in pflanzlichen Zellwänden

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through nanoindentations with an atomic force microscope (AFM) coupled with an optical inverted fluorescence microscope. The method consists of applying controlled forces to the sample while measuring its deformation, allowing quantifying parameters such as the apparent Young's modulus of cell walls at subcellular resolutions. It requires a careful mechanical immobilization of the sample and correct selection of indenters and indentation depths. Although it can be used only in external tissues, this method allows characterizing mechanical changes in plant cell walls during development and enables the correlation of these microscopic changes with the growth of an entire organ.

Atomic Force Microscopy to Study the Physical Properties of Epidermal Cells of Live Arabidopsis Roots

The atomic force microscopy indentation protocol offers the possibility to dissect the role of the physical properties of the cell wall of a particular cell of a tissue or organ during normal or constrained growth (i.e., under water deficit).

Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der physikalischen Eigenschaften epidermaler Zellen lebender Arabidopsiswurzeln

A method is described here to characterize the physical properties of the cell wall of epidermal cells of living Arabidopsis roots through ...

Entwicklungsbiologie

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Langfristige, High-Resolution Konfokale Zeitraffer Bildgebung<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis während der Keimung

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories can face is the development and attainment of these methods. Observation of phenotypes in a process of interest is a typical objective of research labs studying gene function and this is often achieved through image capture. A particular process that is amenable to observation using imaging approaches is the corrective growth of a seedling root that has been displaced from alignment with the gravity vector. Imaging platforms used to measure the root gravitropic response can be expensive, relatively low in throughput, and/or labor intensive. These issues have been addressed by developing a high-throughput image capture method using inexpensive, yet high-resolution, flatbed scanners. Using this method, images can be captured every few minutes at 4,800 dpi. The current setup enables collection of 216 individual responses per day. The image data collected is of ample quality for image analysis applications.

This protocol describes a process for rapid collection of images of Arabidopsis seedlings responding to a gravity stimulus using commercially-available flatbed scanners. The method allows for inexpensive, high-volume capture of high-resolution images amenable for downstream analysis algorithms.

Mit Flachbett-Scanner mit hoher Auflösung zeitversetzt Bilder von der Arabidopsis-Wurzel gravitropen Antwort sammeln

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) micro/nano-indentations, for a JPK&#160;AFM. Specifically, in this protocol we measure the apparent Young&#8217;s modulus of cell walls at subcellular resolutions across regions of up to 100 &#181;m&#160;x 100 &#181;m in floral meristems, hypocotyls, and roots. This requires careful preparation of the sample, the correct selection of micro-indenters and indentation depths. To account for cell wall properties only, measurements are performed in highly concentrated solutions of mannitol in order to plasmolyze the cells and thus remove the contribution of cell turgor pressure.
In contrast to other extant techniques, by using different indenters and indentation depths, this method allows simultaneous multiscale measurements, i.e. at subcellular resolutions and across hundreds of cells comprising a tissue. This means that it is now possible&#160;to spatially-temporally characterize the changes that take place in the mechanical properties of cell walls during development, enabling these changes to be correlated with growth and differentiation. This represents a key step to understand how coordinated microscopic cellular changes bring about macroscopic morphogenetic events.
However, several limitations remain: the method can only be used on fairly small samples (around 100 &#181;m in diameter) and only on external tissues; the method is sensitive to tissue topography; it measures only certain aspects of the tissue&#8217;s complex mechanical properties. The technique is being developed rapidly and it is likely that most of these limitations will be resolved in the near future.

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histochemische Färbung von<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundärzellwand-Elemente

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

Eine effiziente Methode zur quantitativen, Einzel-Zell-Analyse von Chromatin Modifikation und Reaktor Architektur in Whole-Mount-Samenanlagen in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. Upon wounding of a leaf, an increase in cytosolic calcium ion concentration (Ca2+ signal) occurs at the wound site. This signal is rapidly transmitted to undamaged leaves, where defense responses are activated. Our recent research revealed that glutamate leaking from the wounded cells of the leaf into the apoplast around them serves as a wound signal. This glutamate activates glutamate receptor-like Ca2+ permeable channels, which then leads to long-distance Ca2+ signal propagation throughout the plant. The spatial and temporal characteristics of these events can be captured with real-time imaging of living plants expressing genetically encoded fluorescent biosensors. Here we introduce a plant-wide, real-time imaging method to monitor the dynamics of both the Ca2+ signals and changes in apoplastic glutamate that occur in response to wounding. This approach uses a wide-field fluorescence microscope and transgenic Arabidopsis plants expressing Green Fluorescent Protein (GFP)-based Ca2+ and glutamate biosensors. In addition, we present methodology to easily elicit wound-induced, glutamate-triggered rapid and long-distance Ca2+ signal propagation. This protocol can also be applied to studies on other plant stresses to help investigate how plant systemic signaling might be involved in their signaling and response networks.

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Extracellular glutamate-triggered systemic calcium signaling is critical for the induction of plant defense responses to mechanical wounding and herbivore attack in plants. This article describes a method to visualize the spatial and temporal dynamics of both these factors using Arabidopsis thaliana plants expressing calcium- and glutamate-sensitive fluorescent biosensors.

Weitfeld-Echtzeit-Bildgebung lokaler und systemischer Wundsignale bei Arabidopsis

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Hochauflösende Bildgebung der Chlorophyll-Biosynthese in Arabidopsis-Keimlingen

Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly dynamic process of chlorophyll biosynthesis is triggered during the shift from the dark to the light in flowering plants. At the moment when etiolated seedlings are exposed to the first traces of sunlight, rapid (in order of seconds) conversion of protochlorophyllide into chlorophyllide is mediated by unique light-accepting protein complexes, leading via subsequent metabolic steps to the production of fully functional chlorophyll. Standard techniques for chlorophyll content analysis include pigment extraction from detached plant tissues, which does not apply to studying such fast processes. To investigate chlorophyll kinetics in vivo with high accuracy and spatiotemporal resolution in the first hours after light-induced de-etiolation, an instrument and protocol were developed. Here, we present a detailed procedure designed for statistically robust quantification of chlorophyll in the early stages of Arabidopsis de-etiolation.

Autor im Rampenlicht: Nicht-invasive hochauflösende Messung der Chlorophyllsynthese während der De-Etiolation

Here, we describe an advanced tool designed for chlorophyll biosynthesis monitoring during the early stages of Arabidopsis seedling de-etiolation. The novel methodology provides non-invasive real-time chlorophyll fluorescence imaging at high spatial and temporal resolution.

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Chlorophyll biosynthesis is a hallmark of de-etiolation, one of the most dramatic stages in the plant life cycle. The tightly controlled and highly ...

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video