Wir danken Drs. Markus Manz und Irving Weissman für die Bereitstellung von Reagenzien. Der Service von der Analyse über Durchflusszytometrie und Zellsortierung Core Facility des ersten und zweiten Kern Laboratory an der National Taiwan University College of Medicine und NTU Krankenhaus zur Verfügung gestellt Wir erkennen auch auf. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie, Taiwan unterstützt (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) und den Nationalen Gesundheitsforschungsinstitute, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI und NHRI-EX103-10256SI).

C57BL / 6-Wildtyp-Mäuse wurden von der National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan gekauft. Alle Mäuse wurden gezüchtet und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten. Protokolle und Tiernutzung Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der National Taiwan University College of Medicine (Permit-Nummer: 20120075) zugelassen. Darüber hinaus machte die Forscher alles tun, um das Potenzial für die Schmerzen, Leiden oder Angst bei den Tieren zu reduzieren, während die Durchführung von Experimenten. Alle beschriebenen Verfahren wurden bei RT mit Handschuhen. 1. Herstellung von AC-6 Feeder-Zellen Hinweis: Die AC-6.21 (AC-6 in kurzen) Stromazelllinie 18 (von I. Weissman, der Stanford University zur Verfügung gestellt) sollten in RPMI aufrechterhalten werden, ergänzt mit 15% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS). Als Feeder-Zellen dienen, sind AC-6-Zellen γ-bestrahlt mit 3000 rad (30Gy) einen Tag vor der Co-Kultur, um ihre Verbreitung zu verhindern. Hinweis thbei AC-6 Zellen neigen dazu, ihre Differenzierung unterstützende Fähigkeit zu verlieren, wenn bei der Wartung überfüllten verlassen, oder wenn ihre Durchgang Nummer ist über 20. <ol><li> Wasch AC-6 Zellen einmal mit 1 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) gewaschen und durch Absaugen zu entfernen DPBS. Behandlung von AC-6-Zellen mit 0,8 ml Trypsinlösung (0,05% Trypsin und 0,5 mM EDTA in DPBS) für 3-5 Minuten bei 37 ° C, 5% CO 2 und stoppt dann die Reaktion durch mit 10 Volumina Kulturmedium zu verdünnen machen Einzelzellsuspension. </li><li> Samen AC-6-Zellen bei 5.9x10 4 Zellen / Well in 12-Well-Platten und Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO &amp; sub2; O / N. Anmerkung: Die Dichte des AC-6-Zellen ist sehr wichtig, da eine geringere Dichte wird cDC- Erzeugung begünstigen. Aussaat mit einer Dichte von 5.9x10 4 Zellen / Vertiefung ermöglicht AC-6 bis zur Konfluenz am nächsten Tag, die optimal für die Ableitung pDCs von CLPs ist zu erreichen. </li><li> Bestrahlen AC-6-Zellen mit 3000 rad (30 Gy) unter Verwendung von γ-Bestrahlungsvorrichtung. Notiz: Das zur AC-6 bestrahlen Dosis ist optimiert, um die Zellen aus proliferierenden zu verhindern und dennoch tragfähig zu halten sie lange genug, um die für die Differenzierung der DCs von CLPs erforderlich Zytokine und Zell-Zell-Kontakt. </li><li> Saugen Sie Medium und ersetzen mit 1 ml komplettem RPMI (RPMI mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 50 ug / ml Gentamycin und 50 uM β-Mercaptoethanol). </li></ol> 2. Isolieren BM Zellen von Mäusen <ol><li> Opfern Mäuse durch CO 2 Ersticken und Genickbruch. Platzieren Sie die Maus auf eine Dissektion Tablett und sterilisieren mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Mitte der Unterleib und entfernen Sie die Haut von dem distalen Teil der Maus, einschließlich der Haut, die die unteren Extremitäten. </li><li> Sezieren Mäuse in einem semi-sterile Haube. Um den Oberschenkel und Schienbein zu lösen, Clip den Oberschenkelknochen und Schienbeine oben unterhalb des Kniegelenks. Lösen Sie die Muskeln von den Knochen mit einer Schere und legen Sie die Knochen in einer 6 cm Petrischale mit 5 ml RPMI abzuschließen. </li><li> Gehen Sie zu einem sterilen Kultur Kapuze. Füllen Sie ein 3-ml-Spritze mit einer 27G Nadel mit komplettem RPMI verbunden. Schneiden Sie die beiden Enden der Knochen mit einer Schere, und legen Sie die 27G Nadel, um das Mark aus den Knochen durch leichtes Einspritzen von komplettem RPMI einmal von jedem Ende zu spülen. </li><li> Vorbereitung einer Einzelzellsuspension durch vorsichtiges Pipettieren die Zellen auf und ab 3-5 mal in der Kulturschale mit der Spritze ohne Nadel. </li><li> Zentrifugieren die Zellen 5 min bei 500 xg und dekantiert den Überstand. </li><li> Lyse der roten Blutzellen, die mit 1 ml ACK-Puffer (150 mM NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA) Inkubation für 1 min und Abstoppen der Reaktion durch Verdünnen mit 10 Volumina komplettem RPMI. Lassen Sie Zellen für 5 Minuten, um durch die Schwerkraft zu pelletieren tot Zellklumpen und Gewebereste stehen. Hinweis: Stellen Sie sich nicht mehr als 5 Minuten, da dies in der Zellverlust durch Absetzen der lebensfähigen Zellen führen. </li><li> Langsam decant zellhaltige Überstand in ein neues Röhrchen verlassen Trümmerhinter der original tube. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 500 xg, um die Zellen zu pelletieren, dann entfernen und den Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren Gesamt BM-Zellen in 100 &amp; mgr; l FACS-Puffer (1 × PBS + 2% FBS + 1 mM EDTA) (typischerweise 4-6 × 10 7 Zellen werden aus BM eine Maus erhalten wurde). </li></ol> 3. FACS Analyse und Sortierung der CLP <ol><li> Fügen Sie anti-CD16 / 32 (Hybridom-Überstand Clone 2.4G2, 50 ul / Reaktion oder 1-2 ug / Reaktion) in Zellen in FACS-Puffer (Schritt 2.9) für 1-2 min, um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Hinweis: Anti-CD16 / 32 ist auch Fc-Block, der zugegeben wird, um nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die Fc-Rezeptoren, einschließlich Granulozyten, Monozyten und B-Lymphozyten zu verhindern bezeichnet. </li><li> Gleichzeitig gefärbt werden Zellen mit den folgenden Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörpern (für 4x10 7 Zellen) für 15 Minuten auf Eis unter Vermeidung Umgebungslicht. Antikörper: PE-konjugierten Lineage Marker (jeweils 0,2 ug), das anti-CD3 (17A2), anti-CD8 (53-6.7), anti-B220 (RA3-6B2), anti-CD19 (eBio1D3), anti-CD11b (M1 / 70), Anti-Gr-1 (RB6-8C5), anti- Thy1.1 (HIS51), anti-NK1.1 (PK136), anti-TER119 (TER-119) und anti-MHC-II (NIMR-4), 0,2 &amp; mgr; g anti-c-Kit-PerCP-Cy5.5 (2B8), 1 &amp; mgr; g anti-Sca-1-FITC (D7), 0,4 &amp; mgr; g anti-M-CSFR-APC (AFS98) und 0,2 &amp; mgr; g anti-IL-7Rα-PE-Cy7 (A7R34). </li><li> Wasche die Zellen mit 3 ml FACS-Puffer und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li><li> Die Zellen in 300 ul FACS Puffer und Filterzellen durch ein 40 &amp; mgr; M Zellsieb. </li><li> Waschen Sie die Röhrchen mit einem zusätzlichen 100 ul FACS-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu gewinnen und die Filter in eine sterile FACS-Sortierung Rohr mit der gleichen Zellsieb. </li><li> Führen Durchflusszytometrieanalyse unmittelbar nach der Färbung mit entsprechenden Filtern und Spannungen zur Signalerfassung. Verwenden 488 nm-Laser, um die FITC-PerCP-Cy5.5-markierten Antikörpern, 561 nm-Laser, um die PE- und PE-Cy7-labelded Antikörper und 633 nm erfassen laser, um die APC-markierten Antikörper zu erkennen. </li><li> Sortieren Sie CLP nach folgenden Marker lin - c-kit int Sca-1 int M-CSFR - IL-7Rα + (wie in Schritt 3.2 gefärbt) mit einem Zellsortierer. Sammeln der sortierten Zellen in ein 15 ml Röhrchen, enthaltend 8 ml komplettem RPMI als Polster. </li><li> Erfassen die absolute Anzahl der sortierten Zellen durch den Zellsortierer am Ende des Durchlaufs angezeigt. Typischerweise kann 5x10 4 CLP vom BM einer Maus gewonnen werden. </li></ol> 4. Cokultur CLP und AC-6 <ol><li> Zentrifugieren Sie die sortierten Zellen aus Schritt 3.7 für 10 Minuten bei 500 xg, entfernen Sie den Überstand und Zellpellet mit genügend komplettem RPMI um eine Zelldichte in der Umgebung von 5x10 4 Zellen / ml zu erhalten. Seed 500 Zellen / Well in 12-Well-Platte mit Feeder-Zellen in Schritt 1.4 vorbereitet. </li><li> In 100 ng / ml FL 19 (hu-Flt3L-Ig in-house mit einem Expressionssystem von M. Manz, Universi unsere Anbieterty Spital Zürich, Schweiz) und bei 37 ° C, 5% CO 2 mit periodischen visuelle Überwachung der DC Entwicklung unter dem Mikroskop. Anmerkung: Im Handel erhältliche rekombinante menschliche FL oder Maus FL kann als Ersatz für hu-Flt3L-Ig DC Entwicklung bereitgestellt werden können. </li><li> Sammeln der Zellen im Überstand am Tag 12 und Waschen der Wells einmal mit 0,5 ml RPMI-Medium Kombinieren der resultierenden Überstände zu vervollständigen. 0,5 ml frisches Medium und Schrott, die haftenden Zellen mit einem Zellschaber. </li><li> Verbinden die Zellen enthaltenden Mediums aus beiden Teilen und Zentrifuge für 5 Minuten bei 500 x g. </li><li> Dekantieren und resuspendieren Zellen in 50 ul FACS-Puffer. In 50 ul anti-CD16 / 32 Hybridomüberstand und Inkubation für 1-2 Minuten an Fc-Rezeptoren zu blockieren. </li><li> Aufzuzählen und färben alle Zellen mit den folgenden Antikörpern (jeweils 0,05 ug) Anti-CD11c-APC (N418), Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE. </li><li> Waschen und Zentrifuge die Zellen wie beschriebend in Schritt 3.3. </li><li> Die Zellen in 100 ul FACS-Puffer, Tor auf CD11c + und zu analysieren, für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17. </li></ol>

<ol>
	<li>Hartwig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fcgamma+receptor-mediated+antigen+uptake+by+lung+DC+contributes+to+allergic+airway+hyper-responsiveness+and+inflammation.">Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation.</a> Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).</li><li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dendritic+cell+lineage:+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting.">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).</li><li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Function+of+Dendritic+Cell+Subsets.">Development and Function of Dendritic Cell Subsets.</a> Immunity. 40, 642-656 (2014).</li><li>Swiecki, M., Colonna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+functions+of+plasmacytoid+dendritic+cells+during+viral+infections,+autoimmunity,+and+tolerance.">Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance.</a> Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).</li><li>Liu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IPC:+professional+type+1+interferon-producing+cells+and+plasmacytoid+dendritic+cell+precursors.">IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).</li><li>Merad, M., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+homeostasis.">Dendritic cell homeostasis.</a> Blood. 113, 3418-3427 (2009).</li><li>Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+expression+of+the+transcription+factor+e2-2+maintains+the+cell+fate+of+mature+plasmacytoid+dendritic+cells.">Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells.</a> Immunity. 33, 905-916 (2010).</li><li>Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flt3+ligand+regulates+dendritic+cell+development+from+Flt3++lymphoid+and+myeloid-committed+progenitors+to+Flt3++dendritic+cells+in+vivo.">Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo.</a> J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).</li><li>Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+potentials+of+early+lymphoid+and+myeloid+progenitors.">Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors.</a> Blood. 97, 3333-3341 (2001).</li><li>D'Amico, A., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+progenitors+of+mouse+dendritic+cells+and+plasmacytoid+predendritic+cells+are+within+the+bone+marrow+hemopoietic+precursors+expressing+Flt3.">The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3.</a> J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).</li><li>Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+differentiation:+myeloid+and+lymphoid+pathways+to+murine+plasmacytoid+dendritic+cells.">Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells.</a> Blood. 121, 11-19 (2013).</li><li>Shigematsu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+activate+lymphoid-specific+genetic+programs+irrespective+of+their+cellular+origin.">Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin.</a> Immunity. 21, 43-53 (2004).</li><li>Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells:+recent+progress+and+open+questions.">Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions.</a> Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Naik, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+subtypes+from+single+precursor+cells+derived+in+vitro+and+in+vivo.">Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo.</a> Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clonogenic+common+Flt3+M-CSFR++plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow.">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).</li><li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+type+I+IFN-Flt3+ligand+axis+augments+plasmacytoid+dendritic+cell+development+from+common+lymphoid+progenitors.">A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors.</a> J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+stromal+cell+lines+with+lymphopoietic+activity+express+high+levels+of+a+pre-B+neoplasia-associated+molecule.">Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule.</a> Cell. 48, 1009-1021 (1987).</li><li>Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Flt3+signal+transduction+cascade+rescues+and+enhances+type+I+interferon-producing+and+dendritic+cell+development.">Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development.</a> J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).</li><li>Szilvassy, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+inhibitory+factor+upregulates+cytokine+expression+by+a+murine+stromal+cell+line+enabling+the+maintenance+of+highly+enriched+competitive+repopulating+stem+cells.">Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells.</a> Blood. 87, 4618-4628 (1996).</li><li>Arcanjo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+characterization+of+heparan+sulfate+derived+from+murine+hemopoietic+stromal+cell+lines:+a+bone+marrow-derived+cell+line+S17+and+a+fetal+liver-derived+cell+line+AFT024.">Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024.</a> J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).</li><li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clonogenic+progenitor+with+prominent+plasmacytoid+dendritic+cell+developmental+potential.">A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential.</a> Immunity. 38, 943-957 (2013).</li><li>Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+B-lymphoid+cultures+from+murine+bone+marrow+establishment+and+cloning+by+using+stromal+cell+line+AC+6.21.">Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21.</a> Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).</li><li>Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Generation+of+Plasmacytoid+Dendritic+Cell+from+Common+Lymphoid+Progenitors+by+Flt3+Ligand.">Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand.</a> PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).</li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Hier beschreiben wir ein in-vitro-Kultursystem für die robuste Erzeugung von DCs und pDCs insbesondere aus einer kleinen Anzahl von CLPs. Die Einzigartigkeit dieses Kultursystem ist auf die Verwendung von AC-6-Zellen, eine Stromazelllinie, Speiser. Diese Vorgehensweise hat sich gezeigt, dass nicht nur die Cytokine, wie IL-7, SCF, M-CSF und FL 20 vorzusehen, sondern auch die Zell-Zell-Kontakt 21 notwendig DC Entwicklung zu unterstützen. AC-6 Zellen wurden zuvor verwendet, um die Untersuchung der in vitro DC Entwicklung von mehreren Vorläufern 8,16,22 erleichtern. Wir fanden, dass es von entscheidender Bedeutung, um eine optimale Dichte von AC-6 Feederzellen Saatgut, um die effiziente Differenzierung von pDCs von CLP zu unterstützen. Insbesondere Impfen 5.9x10 4 γ-bestrahlten AC-6-Zellen in 12-Well-Platten ergibt Konfluenz am nächsten Tag, die geeignet pDC Entwicklung. Eine niedrigere AC-6 Zelldichte (3.9x10 4 / Well in 12-Well-Platte) tendiert CDC developmen unterstützent 24. Daher ist es zum ersten Keim mehreren Konzentrationen von AC-6-Zellen zu empfehlen ist, um die Bedingungen zu optimieren, wenn die Aufstockung der Kultursystem 23. Darüber hinaus ist es auch wichtig, dass die AC-6-Zellen strikt einzuhalten, auch sorgfältig auf Passagezahl und niemals zum Erreichen der Konfluenz erlaubt. Wenn unbefüllt ist oder wenn ihre Passagenzahl größer als 20 ist, diese Zellen sind in der Regel die Möglichkeit, die Blutbildung in vitro zu unterstützen verlieren. Zusätzlich wird die Konzentration von FL wirkt sich auch auf DC Entwicklung. Insbesondere bei niedrigen Dosen (25-50 ng / ml) cDCs werden vorzugsweise entwickelt, während bei hohen Dosen (100-200 ng / ml) pDCs überwiegend 24 erzeugt. Zusätzlich zur AC-6 Zelldichte und FL Dosierung ist eine sorgfältige Auswahl einer Charge von FBS, die effizient unterstützt DC Entwicklung in diesem Kultursystem für den Erfolg des Verfahrens. Während in vitro abgeleitete cDCs und pDCs kann dis seinund CD11c + CD11b - - durch ihre Oberflächenmarkern, nämlich CD11c + CD11b + B220 B220 + unterschieden sind jeweils auch deren Morphologien erkennbar durch Mikroskopie. cDCs größer sind, spindelförmigen und haftenden, während pDCs kleiner sind, rundgestalteten und wachsen in Suspension (Abbildung 2). Die Kinetik der DC Differenzierung unterscheidet sich auch, mit pDCs erscheinen früher und cDCs später. Zusätzlich kann das Verfahren der pDC Entwicklung signifikant durch AC-6 Zelldichte mit höheren AC-6 Dichte Beschleunigung des Entwicklungsprozesses beeinflusst. Es sollte beachtet werden, dass pDCs beginnen sterben nach vollständiger Entwicklung und damit das Verhältnis von cDCs gegen pDCs in diesem Kultursystem schrittweise zu späteren Zeitpunkten erhöht werden kann. Daher ist eine periodische Überwachung der DC Entwicklung durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie hoch um zu bestimmen, empfiehlt sich, wenn pDCs starten zur Apoptose. Zu beachten ist, das described Verfahren kann auch auf andere Gleich Progenitoren wie CDPs angewendet werden; Jedoch sind die Haupt DC-Population aus diesen Zellen erzeugten cDCs 17 auch bei hohen AC-6 Dichten bzw. FL Dosen. Die geringe pDC Potenzial von CDP steht im Einklang mit Berichten aus verschiedenen Gruppen entweder mit CDP-Feeder 11 oder Feeder-freien 16-Systeme, zwei unterschiedlichen in vitro-Kultur-Systeme. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Feeder-System AC-6 kann wahrheitsgetreues Bild der Differenzierungspotential der verschiedenen Vorläuferzellen. Die aus diesem Kultursystem erzeugt pDCs sind CD11c + CD11b - B220 +. Außerdem exprimieren sie relativ hohe Gehalte an Tcf4 (kodiert E2-2) und Rag1 zwei pDC-spezifische Gene, aber niedrigere Id2, eine CDC-spezifische Gen, als dies cDCs 17. Obwohl diese pDCs fehlt Siglec-H und BST2, Marker als charakteristisch für murine pDCs, sind sie noch in der Lage, höhere IFN-I produzieren alstun cDCs und hochregulieren CD86, wenn sie mit der vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) 24 infiziert. Dies legt nahe, dass diese pDCs, obgleich unvollständig differenzierten, noch funktionstüchtig sind. Darüber hinaus haben wir bereits erfolgreich diese Methode verwendet, um eine synergistische Rolle von IFN-I und FL in pDC Entwicklung von CLPs 17 abzugrenzen, was bestätigt, dass dieses Verfahren ist wertvoll für die Untersuchung der DC Entwicklung. Zusammenfassend stellen wir hier eine einfache, aber effiziente Methode pDCs aus einer kleinen Anzahl von CLPs mit dem AC-6 feeder Kokultursystem, die Entwicklungs- oder funktionelle Untersuchungen pDCs erleichtern kann generieren.

Dendritische Zellen (DCs) sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die bei der Kontrolle der Immunantwort 1 eine wichtige Rolle spielen. Während DCs sind heterogen, sie können grob in zwei Populationen klassifiziert werden, herkömmliche DCs (cDCs) und plasmazytoiden DCs (pDCs) 2,3. Zusätzlich zu lymphoiden Organen, sind cDCs und pDCs auch in Geweben, einschließlich Lunge, Darm, Haut und 2 gefunden. Die Morphologie cDCs und pDCs unterscheidet, mit cDCs aufweist Dendriten artigen Vorsprünge und die Form pDCs wobei mehrere Plasmazellenartigen. Darüber hinaus wird der gemeinsame Maus DC Marker, CD11c, stärker auf als auf pDCs cDCs ausgedrückt. CDCs und CD11b - - CD24 + cDCs, die beide exprimieren höhere Niveaus von MHC-Klasse II und kostimulatorische Moleküle als dies pDCs 2 kann darüber hinaus weiter in cDCs CD11b + CD24 teilen. Reife pDCs, andererseits hat sich gezeigt, selektiv auszudrücken Siglec-H und BST2 4. Functionally sind cDCs besser Antigen-präsentierenden Zellen sind als pDCs; jedoch können pDCs eine große Menge an Typ I Interferon bei der Virusinfektion oder entzündlichen Stimulation 5 zu produzieren. Beide cDCs und pDCs sind kurzlebig und müssen deshalb ständig von Vorläufern im Knochenmark (BM) 6,7 nachgefüllt werden. Adoptiven Transfer von gemeinsamen myeloischer Stammzellen (CMPs) und gemeinsame lymphoide Vorläuferzellen (CLP) in letal bestrahlten Mäusen zeigt, dass cDCs und pDCs kann von beiden Abstammungslinien 8-10 erzeugt werden. Jedoch gibt es eine Untergruppe von pDCs die RAG1 / 2 ausdrücken und besitzen umge DJ Abschnitte der IgH-Locus 11,12. Diese Zellen teilen auch molekulare Ähnlichkeit mit B-Lymphozyten, einschließlich Ausdruck der B220 Marker, Nukleinsäure-Sensing-Rezeptoren (TLR7 / TLR9) und Transkriptionsfaktoren (SPIB und BCL11A) 13, verfügt über alle geglaubt, um Unterschriften der lymphoiden Linie zu sein. Daher CLPs kann eine gute Wahl für in-vitro-Erzeugung von pDCs wegen der Abstammung Ähnlichkeit zu sein. Während die Frequenz der beiden cDCs und pDCs bei Mäusen und Menschen ist sehr gering 6 DCs, insbesondere cDCs kann in vitro aus BM oder Vorläuferzellen in der Gegenwart von Cytokinen, wie GM-CSF 11,14 oder Flt3-Liganden erzeugt werden (FL ) unter Verwendung von Feederfreie Systeme 11,15,16. Leider ist es jedoch nicht möglich, eine große Anzahl von pDCs in vitro unter Verwendung von FL 11,15,16 herzustellen. Bisher haben wir gezeigt, dass pDCs effizient in vitro aus CLP mit der AC-6 Speisesystem 17 erzeugt werden. Der Vorteil der Verwendung der AC-6 Stromazelllinie im Kultursystem ist, dass er Zell-Zell-Kontakt und die Sekretion von Cytokinen, die die Erzeugung einer großen Zahl von pDCs von CLPs Unterstützung bietet. Obwohl die Produktion mit diesem System ist sehr robust, ist eine sorgfältige Replikation der Verfahren unten beschrieben erforderlich in, um eine effiziente Erzeugung von pDCs gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5</td><td>Biolegend</td><td>108408</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136</td><td>Biolegend</td><td>108708</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse&amp;nbsp; CD11b (PE), cloneM1/70</td><td>Biolegend</td><td>101208</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3</td><td>Biolegend</td><td>115508</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103208</td><td>linage marker/FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2</td><td>Biolegend</td><td>100308</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100707</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4</td><td>Biolegend</td><td>107608</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51</td><td>eBioscience</td><td>12-0900-83</td><td>linage marker</td></tr><tr><td>Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98</td><td>Biolegend</td><td>135510</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8</td><td>Biolegend</td><td>105824</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7</td><td>Biolegend</td><td>108106</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34</td><td>Biolegend</td><td>135014</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101206</td><td>FACS</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Cell sorter</td></tr><tr><td>FACS sorting tube&amp;nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Flow analysis sofrware</td></tr></tbody></table>

in vitro generation of murine plasmacytoid dendritic cells from common lymphoid progenitors using the ac-6 feeder system

Plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) sind starke Typ I Interferon (IFN-I) Herstellung von Zellen, die in Reaktion auf eine Infektion oder bei entzündlichen Reaktionen aktiviert werden. Leider wird Studium der PDC-Funktion durch ihre niedrigen Frequenz in lymphatischen Organen behindert, und die bestehenden Verfahren zur in-vitro-DC Generation überwiegend zugunsten der Produktion von cDCs über pDCs. Hier präsentieren wir einen einzigartigen Ansatz, um effizient zu erzeugen pDCs von gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) in vitro. Speziell beschriebene Protokolldetails, wie CLPs aus dem Knochenmark zu reinigen und zu erzeugen pDCs kokultiviert mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von Flt3-Liganden. Ein einzigartiges Merkmal dieses Kultursystems ist, dass die CLPs wandern unter den AC-6-Zellen und werden gepflasterten Fläche bildenden Zellen, ein kritischer Schritt zur Erweiterung pDCs. Morphologisch DCs, nämlich pDCs und cDCs wurden mit einer Zusammensetzung aus 7 erzeugte nach ca. 2 Wochen0-90% pDCs unter optimalen Bedingungen. Typischerweise ist die Anzahl der pDCs durch dieses Verfahren erzeugte etwa 100-fachen der Anzahl der CLPs ausgesät. Daher ist dies ein neuartiges System, das eine robuste erzeugen die eine große Zahl von pDCs erforderlich, weitere Untersuchungen über die Entwicklung und Funktion der Zellen zu erleichtern.

Insgesamt 4-6x10 7 BM-Zellen werden typischerweise aus Oberschenkelknochen und Schienbein einer 6-8 Wochen alten Wildtyp C57BL / 6-Maus isoliert. Zu sortieren, CLP, sind insgesamt BM-Zellen mit PE-konjugierten Antikörpern gegen Linie Marker (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119 und MHC-II), anti gebeizt c-kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-CSFR-APC und Anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analysiert und sortiert werden mit einem Zellsortierer. Die Sortierstrategie für CLP ist in Abbildung 1 dargestellt. Typischerweise werden 5x10 4 CLPs aus einer C57BL / 6-Mäusen erhalten. Um mehr CLP zu erhalten, kann BM-Zellen 3-4 Mäusen kombiniert werden und das Protokoll entsprechend vor dem Sortieren angepasst. Nach der Co-Kultur von 500 CLP mit 5.9x10 6 AC-6-Feeder-Zellen, Kopfsteinpflasterbereich bildenden Zellen (CAFC) starten, um bei Tag 3-4 angezeigt. Bis zum Tag 8, erscheinen runde pDCs und Suspend auf der Oberseite des CAFC (2A). Die Anzahl der pDCs Gipfel rund um day 12-14 an welcher Stelle pDCs starten, um die Apoptose nach ihrer vollen Entfaltung zu unterziehen, und die Zahlen beginnen, allmählich ab. cDC- Kolonien erscheinen später als pDC Kolonien am Tag 6-8 sowie die Morphologie der cDCs größer sind, spindelförmige und haft (2B). Typischerweise kann 5-6x10 4 Zellen von 500 CLPs nach 2 Wochen der Kokultur erzeugt werden. Nach Färbung der Zellen mit anti-CD11c-APC, Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE, Analyse durch Durchflusszytometrie zeigt, dass der Prozentsatz der pDCs (CD11c + CD11b - B220 +) und cDCs (CD11c + CD11b + B220 - ) beträgt 91% und 6%, bzw. (3). Daher kann mit diesem Verfahren pDCs kann so viel wie 100-fache erweitert werden. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53211/53211fig1.jpg" /> Abbildung 1. Gating Strategien für CLP. BM-Zellen isorechnet von einer Maus wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gefärbt und CLP, die als lin definiert wurden analysiert - c-Kit int Sca-1 int M-CSFR -. IL-7Rα + <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53211/53211fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53211/53211fig2.jpg" /> Abbildung 2. Morphologie der CDC und pDC Kolonien in CLP-AC-6 Cokulturen. 500 CLPs wurden mit γ-bestrahlten AC-6-Feeder-Zellen in Gegenwart von 100 ng / ml FL cokultiviert. (A) pDC Kolonien am Tag 8, 10 und 12, und (B) cDC- Kolonien an Tag 8, 12 und 16 wurden unter dem Lichtmikroskop bei 200 x (Maßstab 50 um) fotografiert. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53211/53211fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine larg ansehen</a>äh Version dieser Figur. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53211/53211fig3.jpg" /> Abbildung 3. Die durchflusszytometrische Analyse der CLP-abgeleitete pDCs und cDCs. Fünfhundert CLPs und γ-bestrahlt AC-6-Feeder-Zellen (5.9x10 4 / ml) wurden in vitro für 12 Tage in Gegenwart von FL (100 cokultiviert ng / ml ). Die Zellen wurden mit anti-CD11c-APC, Anti-CD11b-FITC und anti-B220-PE gefärbt und durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Zellen wurden zunächst auf CD11c + gated und dann für cDCs (CD11c + CD11b + B220 -) analysiert und pDCs (CD11c + CD11b - B220 +). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53211/53211fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System at JoVE.com

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

In-vitro-Erzeugung von Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen aus Lymphoid Gemeinsame Vorläufern mit der AC-6-Feeder-System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

in-vitro-generation-murine-plasmacytoid-dendritic-cells-from-common

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

8.4K Aufrufe.  National Taiwan University College of Medicine. In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. 

Serie: In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Mausmodell der CD40-Aktivierung von B-Zellen

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to infection. Because these are the most potent antigen presenting cells, DCs are being increasingly used as a vaccine vector to study the induction of antigen-specific immune responses. In this video, we demonstrate the procedure for harvesting tibias and femurs from a donor mouse, processing the bone marrow and differentiating DCs in vitro. The properties of DCs change following stimulation: immature dendritic cells are potent phagocytes, whereas mature DCs are capable of antigen presentation and interaction with CD4+ and CD8+ T cells. This change in functional activity corresponds with the upregulation of cell surface markers and cytokine production. Many agents can be used to mature DCs, including cytokines and toll-like receptor ligands. In this video, we demonstrate flow cytometric comparisons of expression of two co-stimulatory molecules, CD86 and CD40, and the cytokine, IL-12, following overnight stimulation with CpG or mock treatment. After differentiation, DCs can be further manipulated for use as a vaccine vector or to generate antigen-specific immune responses by in vitro pulsing using peptides or proteins, or transduced using recombinant viral vectors. 

This video demonstrates the procedure for differentiating myeloid dendritic cells from mouse bone marrow. Isolation of mouse tibia and femur, and processing of bone marrow are demonstrated. Pictures demonstrating cell morphology before and after differentiation, and figures depicting cell phenotype and IL-12 production following maturation using CpG are shown.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

Biologie

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% CD11c high dendritic cells in culture that home to the draining lymph node after subcutaneous injection and present antigen to antigen specific T cells (see video). Additionally, we use Essen Instruments Incucyte to track dendritic cell maturation, where, at day 10, the morphology of the cultured cells is typical of a mature dendritic cell and &lt;85% of cells are CD11chigh. The study of antigen presentation in peripheral lymph nodes by 2-photon imaging revealed that there are three distinct phases of dendritic cell and T cell interaction1, 2. Phase I consists of brief serial contacts between highly motile antigen specific T cells and antigen carrying dendritic cells1, 2. Phase two is marked by prolonged contacts between antigen-specific T cell and antigen bearing dendritic cells1, 2. Finally, phase III is characterized by T cells detaching from dendritic cells, regaining motility and beginning to divide1, 2. This is one example of the type of antigen-specific interactions that can be analyzed by two-photon imaging of antigen-loaded cell tracker dye-labeled dendritic cells.

Antigen presentation in secondary lymphoid organs by dendritic cells is crucial for the initiation of the T cell mediated adaptive immune response. Here we demonstrate the culture of bone marrow derived murine dendritic cells, activation, and labeling for 2-photon imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal Peyer&#39;s patch (PP). Common dendritic cell progenitors (CDPs, lin- c-kitlo CD115+ Flt3+) were purified from the bone marrow of C57BL6 mice by FACS and transferred to recipient mice that lack a significant pDC population in PP; in this case, Ifnar-/- mice were used as the transfer recipients. In some mice, overexpression of the dendritic cell growth factor Flt3 ligand (Flt3L) was enforced prior to adoptive transfer of CDPs, using hydrodynamic gene transfer (HGT) of Flt3L-encoding plasmid. Flt3L overexpression expands DC populations originating from transferred (or endogenous) hematopoietic progenitors. At 7-10 days after progenitor transfer, pDCs that arise from the adoptively transferred progenitors were distinguished from recipient cells on the basis of CD45 marker expression, with pDCs from transferred CDPs being CD45.1+ and recipients being CD45.2+. The ability of transferred CDPs to contribute to the pDC population in PP and to respond to Flt3L was evaluated by flow cytometry of PP single cell suspensions from recipient mice. This method may be used to test whether other progenitor populations are capable of generating PP pDCs. In addition, this approach could be used to examine the role of factors that are predicted to affect pDC development in PP, by transferring progenitor subsets with an appropriate knockdown, knockout or overexpression of the putative developmental factor and/or by manipulating circulating cytokines via HGT. This method may also allow analysis of how PP pDCs affect the frequency or function of other immune subsets in PPs. A unique feature of this method is the use of Ifnar-/- mice, which show severely depleted PP pDCs relative to wild type animals, thus allowing reconstitution of PP pDCs in the absence of confounding effects from lethal irradiation.

This protocol describes experimental procedures to assess the differentiation of plasmacytoid dendritic cells in Peyer&#8217;s patch from common dendritic cell progenitors, using techniques involving FACS-mediated cell isolation, hydrodynamic gene transfer, and flow analysis of immune subsets in Peyer&#8217;s patch.

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Herstellung von menschlichen Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen aus Vollblut

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state against self-antigens as well as antigens derived from commensal organisms. The disruption of this immune homeostasis can lead to chronic inflammation and to the development of autoimmunity. Dendritic cells (DCs) are the professional antigen-presenting cells of the innate immune system involved in activating na&#239;ve T cells to initiate immune responses against foreign antigens. However, DCs can also be differentiated into TolDCs that act to maintain and promote T cell tolerance and to suppress effector cells contributing to the development of either autoimmune or chronic inflammation conditions. The recent advancement in our understanding of TolDCs suggests that DC tolerance can be achieved by modulating their differentiation conditions. This phenomenon has led to tremendous growth in developing TolDC therapies for numerous immune disorders caused due to break in immune tolerance. Successful studies in preclinical autoimmunity murine models have further validated the immunotherapeutic utility of TolDCs in the treatment of autoimmune disorders. Today, TolDCs have become a promising immunotherapeutic tool in the clinic for reinstating immune tolerance in various immune disorders by targeting pathogenic autoimmune responses while leaving protective immunity intact. Although an array of strategies has been proposed by multiple labs to induce TolDCs, there is no consistency in characterizing the cellular and functional phenotype of these cells. This protocol provides a step-by-step guide for the development of bone marrow-derived DCs in large numbers, a unique method used to differentiate them into TolDCs with a synthetic triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acid-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), and the techniques used to confirm their phenotype, including analyses of essential molecular signatures of TolDCs. Finally, we show a method to assess TolDC function by testing their immunosuppressive response in vitro and in vivo in a preclinical model of multiple sclerosis.

Here, we present a protocol to develop and characterize tolerogenic dendritic cells (TolDCs) and evaluate their immunotherapeutic utility.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

The immune system operates by maintaining a tight balance between coordinating responses against foreign antigens and maintaining an unresponsive state ...

Medizin

In Vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors

Source: Chang, S., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53211">In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System.</a> J. Vis. Exp. (2015)
This video demonstrates an in vitro assay to generate plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from common lymphoid progenitor cells (CLPs). Upon co-culturing purified CLPs with &#947;-irradiated feeder cells in the presence of Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FL), the CLPs differentiate into non-adherent pDCs, the presence of which is confirmed using flow cytometry.

In vitro Erzeugung von plasmozytoiden dendritischen Zellen aus gemeinsamen lymphatischen Vorläuferzellen

Source: Chang, S., et al. In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System. J. ...