Name: design and construction of artificial extracellular matrix (aecm) proteins from escherichia coli for skin tissue engineering
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering at JoVE.com

Die Autoren danken, die Finanzierung von Bildungsministerium ACRF Tier 1 (RG41) bestätigen und starten Zuschuss von der Nanyang Technological University. Low und Tjin werden von der Forschung Student Scholarship (RSS) aus Nanyang Technological University, Singapur finanziert.

1. Klonierung von rekombinanten Plasmiden, die für Proteine ​​aECM <ol><li> Gestalten Sie die Aminosäuresequenz der funktionellen Domäne (zB Zellbindungsdomäne und Elastin-ähnliche Wiederholungen). Design Restriktionsstellen flankieren die Enden der funktionellen Domänen zu erleichtern Subklonierung mit freier Software nach Software-Anweisungen (zB http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Wählen Sie hier einmal vorkommende Restriktionsstellen, die nicht in der funktionalen Domäne vorhanden, um die Verdauung an die vorgesehenen Standorte beschränkt sind. Wählen Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Wirt-Vektor angegeben (z pET22b (+)) für Sub-Klonen. </li><li> Rückwärts übersetzen die Aminosäuresequenz in die Nukleotidsequenz mit kostenlosen Websites nach Software-Anweisungen. (ZB http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Stellen Sie sicher, Codons für E. optimiert coli-Hosts. </li><li> Gen von Interesse kann purchas seined Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden (dh, wenn die Oligonukleotide &lt;100 Basenpaare (bp)) und durchzuführen, DNA Tempern (siehe Schritt 1.4), die Kosten zu reduzieren. Ansonsten für Gene größer als 100 bp, sie könnten durch die Handelsgesellschaften erworben werden. </li><li> DNA Annealing der Oligonukleotide <ol><li> Tempern die DNA-Oligomeren, um die gewünschte Gen-Sequenz zu erhalten. Aufzulösen DNA-Oligonukleotide in einem DNA-Oligomer-Puffer (10 mM Tris: 2-Amino-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtriert) zu einer Endkonzentration von 1 ug / ul. </li><li> Hinzuzufügen 4 ul jedes Oligomers zu 32 ul DNA Annealing-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl und 100 nM MgCl 2), um insgesamt 40 ul Mischung zu erzielen. </li><li> Kochen Sie ein Becherglas mit Wasser unter Verwendung einer Kochplatte und tauchen Sie die Mischung für 5 min, 95 ° C. Das Becherglas und allmählich abkühlen die gesamte in einem Styropor-Box O / N eingestellt. Die Oligomere wurden geglüht und sind bereit für die Verdauung. </li></ol></li&gt; <li> Hinzufügen der entsprechenden Restriktionsenzyme, die geglüht Oligomere (dh als Einsatz bezeichnet) und Wirt-Vektor (dh pET22b (+)) separat zu verdauen. Verwenden des folgenden Rezepts (1-2 ug DNA, 2 ul jedes Restriktionsenzym wurden 5 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und Wasser bis zu insgesamt 50 &amp; mgr; l Mischung) für 3-4 h bei 37 ° C. HINWEIS: Der pET22b (+) Plasmidvektor Ampicillin Antibiotika-resistente und enthält ein 6x-His-Tag am C-Terminus. Die 6x-His in pET22b (+) vorhanden tag ermöglicht es uns, His-markierten Antikörper zu verwenden, um das Zielprotein durch Western-Blot in Schritt 7 zu identifizieren. </li><li> In 6x Ladepuffer zu jedem Verdauungsgemisch. Führen Sie die Aufschlussgemische getrennt einschließlich einer DNA-Leiter auf 1,2% Agarosegelen DNA, enthaltend eine UV-fluoreszierende DNA-Farbstoff 1 h bei 100 V visualisieren die 1,2% DNA Agarosegel mit einer UV-Lichtbeleuchtung. </li><li> Schneiden Sie das Gel auf verdauten DNA-Produkte mit kommerziellen Gel Aufreinigungskits extrahieren. Elute mit dem Mindestvolumen für die Spalte, um eine minimale DNA-Konzentration von 50 bis 100 ng / &amp; mgr; l zu erreichen. </li><li> Kombinieren der das interessierende Gen sequentiell durch Ligation des DNA-Inserts verdaut (dh Elastin Wiederholungen oder Zellbindungsdomänen von DNA Glühen erhalten wird) in den Plasmidvektor unter Verwendung von T4-Ligase mit dem folgenden Rezept: (2 &amp; mgr; l Vektor, 1 ul T4-Ligase, 1,5 ul T4-Ligationspuffer, x ul Einsatz, 10,5 x ul Wasser für insgesamt 15 &amp; mgr; l Mischung). Inkubieren Sie die Ligationsmischung bei RT für 2 h. HINWEIS: molare Konzentration von Vektor einfügen sollte geändert werden, um Ligationseffizienz zu optimieren. Volumen als x im Rezept beschrieben Einsatz ist abhängig von der eluierten DNA-Konzentration von Schritt 1.7. </li><li> Thaw E. coli DH5a chemisch kompetente Zellen (oder jedes Klonen Stamm) auf Eis. Warm 2xYT Agar-Platten (Tabelle 1), enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) auf 37 ° C. </li><li> Transformieren der Zellen unter VerwendungHitzeschock: <ol><li> Aliquot 50 ul kompetenter Zellen in saubere, vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Pipette 5 ul (zwischen 100 pg bis 100 ng) der Ligationsmischung in die Zellen, Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zu mischen. Lassen Sie die Mischung auf Eis für 20 min. </li><li> Eintauchen der Mikrozentrifugenröhrchen, das die Zellmischung in einem 42 ° C warmen Wasserbad für 2 Minuten und kehrte auf Eis für 2 min. Zeit der Eintauchdauer, um Hitzeschäden an den Zellen zu minimieren. </li><li> Gib 500 &amp; mgr; l SOC-Medium (Tabelle 1) in das Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde. </li><li> Verbreiten 50 500 ul der Zell / Ligationsmischung auf einem 2 × YT-Agar-Platte, die auf RT erwärmt worden ist, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Inkubation Platten der Oberseite nach unten bei 37 ° CO / N (12-16 h) . </li></ol></li><li> Am nächsten Tag abholen DNA Kolonien von der Agar-Platte mit saubere Pipettenspitzen. Wachsen die Kolonien in 5 ml 2YT-Medium (Tabelle1), das Ampicillin (25 ug / ml) O / N bei 37 ° CO / N (12-16 h) unter Schütteln (225 rpm). </li><li> Am folgenden Tag, mit einem Plasmid Isolation Kit, um die DNA-Plasmide für jede Kolonie nach Herstellerprotokoll aufgenommen zu extrahieren. Elution der DNA mit 50 ul Wasser. </li><li> Führen Sie einen Test verdauen mit Restriktionsenzymen mit folgender Rezeptur: (5 ul DNA, 0,2 ul jedes Restriktionsenzym, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und füllen Sie Wasser für insgesamt 10 ul Gemisch), Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C zum Bildschirm für die Kolonien, die wahrscheinlich enthalten den Einsatz und laufen auf 1,2% Agarose-Gel-DNA, wie in Schritt 1.6. HINWEIS: Bei der Verdauung, eine erfolgreiche Ligation sollten die Ergebnisse in zwei Bänder, je eine für Vektor- und Insert, das auf ihre jeweiligen Molekulargewicht entspricht (Abbildung 1). </li><li> Senden Sie die wahrscheinlich Kolonien zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung von T7-Promotor Vorwärts- und Rückwärtsprimer für kommerzielle Sequenzer. </li></ol><ol><li> Von der Sequenzierung Ergebnis, wählen Sie eine Kolonie, die erfolgreich ligiert wurde und verwenden Sie den DNA-Plasmid für die Transformation in einen E. coli Expressionswirt. </li><li> Thaw E. coli Expressionsstamm (BL21 (DE3) pLysS) auf Eis. Inzwischen warmen Agarplatten, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Chloramphenicol (34 ug / ml) auf Raumtemperatur. ANMERKUNG: Das Plasmid pLysS in Bakterien vorliegende Stamm BL21 (DE3) pLysS eine Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält. Die pLysS Plasmid enthält ein T7 Repressorgen, die konstitutiv exprimiert wird, um undichte Ausdruck der aECM Protein zu begrenzen. Chloramphenicol ist notwendig, um für die Bakterienzellen, die pLysS während der Kultur enthält auszuwählen. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1,10 bis transformierten E. zu erhalten coli-Zellen, die bereit sind, die künstliche Proteine ​​zu exprimieren sind. Wrap-Agar-Platten in Parafilm und lagern auf den Kopf in 4 6; C für bis zu einem Monat. </li></ol> 3. Bakterielle Expression des Proteins aECM <ol><li> Siehe Abbildung 2, wählen Sie eine Kolonie von der Agarplatte transformiert mit einer Pipettenspitze und Beimpfen in 10 ml sterilem Terrific Broth (TB) -Medium (Tabelle 1), die sowohl Ampicillin und Chloramphenicol-Antibiotika in einem Reagenzglas. Inkubieren Sie dieses Starterkultur bei 37 ° CO / N (12-16 h) mit 225 rpm schütteln. </li><li> 10 ml der Starterkultur in 1 l frisch und sterile TB-Medien mit den gleichen Antibiotika in einen 3 l-Erlenmeyerkolben ergänzt. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für 2-3 Stunden und beobachten Sie die optische Dichte der Kultur (OD 600) erreicht 0,6-0,8 durch Pipettieren von 1 ml der Kultur in eine leere Küvette zum Lesen. Sparen Sie 1 ml der Kultur vor der Induktion für SDS-PAGE Charakterisierung. <ol><li> Um OD 600 von der Zellkultur messen, bereiten 1 Flasche TB Medien in einer Küvettefür eine Leermessung. Getrennt davon wurde je 1 ml der Kultur aus der Kulturflasche in eine neue leere Küvette. Anschließend wird die optische Dichte der Kultur mit einem Spektrophotometer gegen die Blindprobe bei einer Absorption von 600 nm. </li><li> Speichern der Probe (für nachfolgende SDS-PAGE-Analyse) durch Übertragen der 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 12.000 × g für 2 min, und Dekantieren. </li></ol></li><li> Induzieren die Kultur mit Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für weitere 4 Std. Speichern 1 ml der Kultur am Ende der Induktion bei 4 Stunden für die SDS-PAGE-Charakterisierung. </li><li> Ernte der Zellen durch die Übertragung der Kultur in 1 l-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die Zellpellets und resuspendieren in TEN-Puffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) bei 0,5 g / ml. </li></ol> 4. Die Lyse von Bakterienkulturen <ol><li> Frieren Sie den resuspendierten Zellkultur bei -80 ° CO / N. Auftauen der gefrorenen Zellkultur in einem Wasserbad bei RT oder auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Zugabe von 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 &amp; mgr; g / ml Ribonuclease A (RNase I), und 50 ug / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), während dem Auftauen und homogenisieren der Lösung unter langsamem Rühren. </li><li> Nachdem alle resuspendierten Zellen werden aufgetaut, passen Sie die Lösung auf pH 9,0, um das Protein Löslichkeit in Wasser 12 zu erhöhen. In 6 N NaOH tropfenweise unter Rühren auf Eis, um eine homogene Konsistenz zu erreichen. Lyse durch Ultraschall Unterbrechung für 20 Minuten auf Eis mit einem Durchmesser von 2 mm flache Spitze, 5 sec Puls. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zell-Lösung bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes, leere Flasche und bei 4 ° C zur Reinigung später. </li><li> Inzwischen Zellpellet wieder mit TEN-Puffer und wieder einfrieren bei -80 ° C. Bisvollständige Zelllyse, wiederholen Einfrieren / Auftauen und Beschallen Prozess bis zu dreimal. Sparen Sie 20 ul Zellysat für SDS-PAGE-Charakterisierung. </li></ol> 5. Reinigung von Proteinen mit aECM Inverse Transition Radfahren <ol><li> Kollationieren des Zelllysats aus Schritt 4.3 und damit fortfahren, die aECM Proteine ​​mittels ITC, ähnlich der für die Reinigung von Proteinen elastinbasiertem 21 verwendet zu reinigen. Zyklen bei den verschiedenen Temperaturen, die 4 ° C durchgeführt werden und 37 ° C (bezeichnet als &quot;kalt&quot; bezeichnet) Zyklen (nachfolgend als &quot;warm&quot; bezeichnet) auf. </li><li> Spalten die Zelllysat in 50 ml-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Das Aussehen der Zellpellet sollte dunkelbraun sein und freuen flüssig. </li><li> Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, um eine saubere Trennung von dem Pellet zu erhalten. Sammeln Sie den Überstand in sauberes Zentrifugenflaschen und NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M (bis zu einem Maximum von 3 M). Warmdie Lösung auf 37 ° C für 2 Stunden mit Schütteln bei 225 rpm. HINWEIS: Die Zugabe von NaCl wird der Übergang des Elastin-Komponente des aECM verursachen Aggregation auszulösen. Der Überstand wird sich trüben. Wenn die Proteinkonzentration hoch genug ist, kann weißen schaumigen Protein an den Seiten des Zentrifugenflasche ersichtlich ist. </li><li> Zentrifugieren der Überstand aus Schritt 5.3 bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 37 ° C. Den Überstand umfüllen. Crush the Pellet mit einem Metallspatel und das Pellet Bits in eiskaltem autoklaviert destilliertem Wasser (50 mg / ml) unter kräftigem Rühren O / N bei 4 ° C unter Verwendung eines magnetischen Rührstab und Teller. Das Pellet sollte vollständig aufgelöst werden. </li><li> Die Schritte 5.2 bis 5.4 für weitere drei bis fünf Mal, um eine höhere Reinheit des Proteins zu erhalten. </li><li> Nach dem letzten Reinigungszyklus, entsalzen der Proteinlösung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 4 ° C. Dialysiere Proteinlösung gegen Wasser für 2-3 Tage mit Veränderungen der Wasser alle 4h oder 8 h für O / N. Sparen Sie 20 ul des gereinigten Proteins für SDS-PAGE und lyophilisieren den Rest des gereinigten Proteins und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung. </li></ol> 6. Charakterisierung von aECM Proteinen mit SDS-PAGE-Elektrophorese <ol><li> Vorbereitung eines 12% SDS-PAGE-Gel (wenn das Molekulargewicht groß ist, nutzen 8% SDS-PAGE-Gele für eine bessere Trennung). Hinzuzufügen 2x SDS-Ladepuffer zu jeder Probe, Erwärmen der Proben für 10 min bei 100 ° C einstellen und Auftragung auf das Gel 1 h lang bei 100 V, bis das Protein Leiter entsprechend dem Molekulargewicht des Proteins aECM der Mitte der erreicht Gel. </li><li> Abrufen des Gels aus dem SDS-PAGE einzurichten und fügen Coomassie Brilliant Blue-Färbung (Tabelle 2) mit einem Volumen, das Gel für 1 Stunde in einer Petrischale eintauchen. Rinse Gel in einer Entfärbelösung (Tabelle 2) für 5 min auf einer Wippe. Ändern Sie die Entfärbelösung, und weiter, um das Gel mit Schaukel bis dem Hintergrund t entfärbener gel deutlich. Proteinbanden muss deutlich sichtbar sein. </li><li> Vergleichen der Position des Zielproteins gegen das Protein Leiter um das Molekulargewicht des Zielproteins zu bestimmen. </li><li> Um die Anwesenheit des Target-Proteins weiter zu bestätigen, führen Western Blotting, wie in Schritt 7. </li></ol> 7. Charakterisierung von Proteinen mit aECM Western Blotting <ol><li> Führen Sie die Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, wie in Kapitel 6 ohne Färbung. </li><li> Geschnitten Nitrocellulosemembran auf eine Größe geringfügig größer als die SDS-PAGE-Gel. Schneiden 4 Stück Filterpapier in der gleichen Größe. </li><li> Wet einem Stück Filterpapier mit westlichen Transferpuffer (20% v / v Methanol, 25 mM Tris, 190 mM Glycin, pH 8,3), legen Sie die SDS-PAGE-Gel auf dem Filterpapier, gefolgt von einem weiteren Stück Filterpapier , dann die Nitrocellulosemembran und einem abschließenden beiden anderen Stücke von Filterpapier. Stellen Sie sicher, das ganze Set-up wird mit ausreichend westlichen Transferpuffer eingetaucht. ANMERKUNG: Das Gel und die Membran nicht in Kontakt zu diesem Zeitpunkt, wie Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden. </li><li> Übertragen Sie die Proteine ​​auf der Nitrocellulosemembran, indem zwei Filterpapiere in einen westlichen halbtrockenen Transfereinheit, gefolgt von der Nitrocellulosemembran und vorsichtig die SDS-PAGE-Gel in und an der Membran, schließlich legen Sie die letzten zwei feuchtem Filterpapier auf Die SDS-PAGE-Gel. Führen Sie den westlichen Übertragung bei 45 mA, 30 min. In Puffer, wenn die Spannung höher als 30 V. HINWEIS: vorzugsweise die SDS-PAGE-Gel auf die Membran bei einem Versuch und vermeiden Verschieben des Gels unnötig auf der Membran als Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden. </li><li> Abrufen und blockieren die Nitrocellulose-Membran mit Blockierungslösung (5% fettfreier Milch in PBS, pH 7,4, mit Filterpapier filtriert) für 2 h bei RT. Entsorgen Blockierungspuffer und fügen PBS spülen. HINWEIS: Wechseln Sie neue Handschuhe zu vermeiden Kontamination der Membran mit unerwünschten proteIns. </li><li> Inkubieren primären anti-His Antikörper mit Verdünnung in PBS auf 1: 1000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 1.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) zu 999 &amp; mgr; l PBS für eine 1 ml Gesamtmischung. </li><li> Spülen der Membran mit 5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween 20). </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper bei 1, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit Verdünnung in PBS: 5000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 5.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) bis 4,999 &amp; mgr; l PBS für eine 5 ml Gesamtmischung. </li><li> Waschen Sie die Membran mit 5 ml PBST und zweimal wiederholen. </li><li> Übernehmen Sie die Chemilumineszenzsubstrat an die Membran mit einem Volumen, um die Membran abdecken und inkubieren indem Sie die Anweisungen für das verwendete Substrat. HINWEIS: Die Empfindlichkeit der Substrat zur Proteinnachweis können variieren, empfehlen wir ein Substrat mit maximaler Empfindlichkeit für sehr niedrige Signale bei steigender Antikörperkonzentration keine Signale zu erhöhen. </li><li> Erfassen Sie die chemolumineszierende Signale unter Verwendung einer CCD-Kamera auf Basis Imager. Stellen Sie die primären und sekundären Antikörperverdünnungsverhältnis, wenn Signale schwach und nicht-spezifisch sind. Länger inkubieren in Blockierungslösung, wenn Hintergrundsignal hoch ist. </li></ol>

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E., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+synthesis+of+protein-based+polymers+with+precisely+specified+molecular+weight+and+sequence+by+recursive+directional+ligation:+examples+from+the+elastin-like+polypeptide+system.">Genetically encoded synthesis of protein-based polymers with precisely specified molecular weight and sequence by recursive directional ligation: examples from the elastin-like polypeptide system.</a> Biomacromolecules. 3 (2), 357-367 (2002).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Recombinant Protein-Engineering ist eine vielseitige Technik, um neue Proteinmaterialien unter Verwendung eines Bottom-up-Ansatz zu schaffen. Die Materialien auf Proteinbasis kann je nach Anwendungsfall von Interesse konstruiert werden, um mehrere Funktionalitäten aufweisen, zugeschnitten. Aufgrund der zunehmenden Fortschritt in der Klonierung und Proteinexpression Technologien ist es relativ einfach (und kostengünstiger) zu werden, um eine Vielzahl von künstlichen Proteine ​​auf eine reproduzierbare und skalierbare Weise zu erstellen. Elastin-ähnliche Domäne ist in einer Anzahl von künstlichen Proteine ​​eingebaut wurde, um als Reinigungsmarkierung dienen, sowie die mechanischen Eigenschaften zu verleihen. Künstliche Proteine, die ein Elastin-ähnliche Sequenz enthalten, können leicht gereinigt werden, unter Verwendung von ITC, wodurch die Notwendigkeit für teure Reinigungssäulen und Antikörper eliminiert. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, um rekombinante Plasmide kodieren für Proteine ​​aECM zu konstruieren. Gene, die für die Elastin-ähnliche Wiederholungen angeschafft. Fürhoch repetitive Peptidsequenz wie Elastin ähnliche Polypeptide, ist es empfehlenswert, die Klonierungsstrategie, daß rekursive gerichtete Ligation (RDL) Strategien können verwendet werden, 22 zu gestalten. Durch die Verwendung von RDL, könnte sich wiederholenden Polypeptide mit einer bestimmten Kettenlänge synthetisiert und werden daher Gene von Interesse kann so kurz Monomere erworben werden. In unserer Arbeit wurden die Zellbindungsdomänen zur flankierenden NheI Restriktionsstellen zu enthalten, um an beiden Enden modulare Swapping des zentralen Zellbindungsdomäne zu ermöglichen. Es ist wichtig, Restriktionsstellen, die einzigartig sind und sich nicht in der funktionellen Domäne vorhanden ist oder an anderer Stelle außerhalb der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Wirt-Vektor auszuwählen. Dies ist auf die Verdauung des Einsatzes oder der Vektor an die beabsichtigten Sites zu beschränken. In einigen Fällen kann es notwendig sein, neue Restriktionsstellen im Wirt-Vektor unter Verwendung Mutagenese vor dem Einführen der funktionellen Domäne einzuführen. UnsereKlonierungsstrategie konnten wir die zentrale Zellbindungsdomäne zu drei Varianten aECM Proteine ​​zu erhalten ohne weiteres ändern. Wir auch festgestellt, daß das Einfügen eines Lysinrests nach dem Start-Methionin gesteigertem Proteingehalt von mehr als 10-fach. Diese drastische Zunahme der Proteinausbeute war am deutlichsten bei LN-5 aECM Proteins, wobei der endgültige Proteinausbeute stieg von 5 mg / l bis 60 mg / l. Verschiedene E. coli Expressionswirte wurden verglichen, und die BL21 (DE3) pLysS E. coli-Stamm hat die besten Proteinausbeuten. Die Verbesserung in der Proteinausbeute war minimal, wenn die Proteinexpression mit IPTG für mehr als 4 Stunden induziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Proteinexpression in IPTG-Konzentrationen von mehr als 1 mM. Allerdings war die Proteinexpression am höchsten, wenn bei OD näher an 0,6 induziert. Für eine effektive Rückgewinnung von aECM Proteinen unter Verwendung von ITC, ist es wichtig zu beachten, die Temperatur der Zentrifugenvorrichtung. Prüfungsweise die meisten der Reinigungsschritte wurden in einem Kühlraum (4 ° C) durchgeführt, um eine maximale Löslichkeit der aECM Proteine ​​gewährleisten. Es kann auch erforderlich sein, vor Kälte (4 ° C) der Zentrifugenrotor O / N vor dem Kaltzyklus. Ebenso ist der Zentrifugenrotor war (37 ° C) vor dem warmen Kreislauf zu gewährleisten, dass die Temperatur der Proteinlösung wurde über seiner T t aufrechterhalten vorgewärmt. Zusammenfassend sind die Verfahren zu entwerfen und Klon rekombinanten Plasmide künstlichen ECM-Proteine ​​kodieren, sind beschrieben. Insbesondere die Expression und Reinigung von Proteinen unter Verwendung der aECM ITC skizziert. Schließlich Charakterisierung der aECM Proteine ​​mittels SDS-PAGE-Elektrophorese und Western Blotting wurden beschrieben.

For several decades, both synthetic and natural materials have been explored for use as scaffolds in tissue engineering1,2. While synthetic materials such as polymers offer excellent structural integrity and tunable mechanical properties, they often have insufficient bioactivity to promote growth and infiltration of tissues. On the other hand, natural materials such as extracellular matrix (ECM) proteins have excellent biological activity, but have limitations such as batch-to-batch variability, rapid degradation and immunogenicity issues. As such, recombinant proteins are desired, since they can be designed to mimic only the desirable properties of native proteins3,4.
Recombinant protein engineering has garnered widespread interests as a versatile platform for the design and production of novel artificial protein biopolymers. By controlling the genetic sequence, the functionalities of the artificial proteins can be tailored for a wide variety of applications5,6. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins can be tailored to have multiple functionalities for applications in tissue engineering, regeneration and wound repair2,7. More importantly, advances in cloning and purification technologies have increased scalability and reduced the cost of manufacturing recombinant proteins tremendously. It is possible to produce large quantities of recombinant proteins at low production costs which are economic for use in the clinic5. 
Artificial extracellular matrix proteins have been developed for tissue engineering applications8-11. For instance, Tirrell et al. designed a small diameter vascular graft using artificial proteins containing fibronectin CS5 sequence and elastin-like repeats (ELP-CS5). They showed that human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were able to adhere and grow on these materials12. Others have also incorporated short bioactive sequences taken from fibronectin, collagen, laminin, fibrinogen and vitronectin as well as structural domains that mimic elastin, spider silk and collagens to create a variety of fusion proteins10. Bulk cross-linked films made out of elastin-based aECM proteins also exhibited mechanical properties similar to that of native elastin (elastic moduli ranges between 0.3-0.6 MPa)13. Subsequently, aECM proteins containing longer fibronectin fragments were also reported to accelerate wound healing in vitro due to increased integrin binding affinities8. 
Recently, integrin-specific artificial ECM proteins have been developed by Tjin and coworkers14. Each aECM protein contains a bioactive cell-binding domain taken from ECM components of native human skin2,7,15, such as laminin-5, collagen-IV and fibronectin. For example, the integrin &#945;3&#914;1 has been shown to bind the PPFLMLLKGSTR sequence found in the laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3)16,17. In their report, they showed that primary human skin epidermal keratinocytes preferentially engage different integrins for binding to each of the aECM proteins, depending on the type of cell binding domain present.
The aECM proteins discussed in the work by Tjin et al. contain flanking elastin-like domains {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8 that confer elasticity which mimics the mechanical properties of human skin. In addition, the incorporation of lysine residues within the elastin-like repeats also increases the overall protein solubility in aqueous solvents. In addition, the lysine residues also serve as crosslinking sites to facilitate the formation of crosslinked aECM films12. Inclusion of elastin-like repeats within the aECM protein sequence allow the proteins to be readily purified via Inverse Transition Cycling (ITC)14. Elastins undergo a sharp and reversible phase transition at a specific temperature known as the lower critical solution temperature (LCST) or the inverse transition temperature (Tt)18-20. Elastins and elastin-like repeats adopt hydrophilic random coil conformations below their LCST and become soluble in water, whereas above their LCST, elastins aggregate rapidly into micron-size particles. Such phase transitions are reversible and hence, can be exploited to allow elastin-based aECM proteins to be readily purified via the ITC technique21.
In this work, we report a generalized procedure to design, construct and purify artificial ECM proteins containing bioactive cell-binding domains, fused to elastin-like repeats. The process to design and clone the plasmids that encode for the amino acid sequences for the aECM proteins is described. The steps involved to purify the aECM proteins using ITC are outlined. Finally, the methods to determine the purity of the aECM proteins obtained using SDS-PAGE electrophoresis and Western Blotting are discussed.

<table><tbody><tr><td>pET22b (+)</td><td>Novagen</td><td>69744</td><td>T7 expression vectors with resistance to ampicillin&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>additional antibiotics - chloramphenicol</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>1 M stock solution with autoclaved water, make fresh prior to induction.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>plasmid isolation kit</td></tr><tr><td>T4 ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&amp;trade; gel DNA recovery kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-gold strain</td><td>Agilent Technologies</td><td>200315</td><td></td></tr></tbody></table>

design and construction of artificial extracellular matrix (aecm) proteins from escherichia coli for skin tissue engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Bei der Konstruktion von Fusionsproteinen enthalten, Elastin-ähnlichen Wiederholungen, ist es wichtig, eine Gesamt Elastingehalt, groß genug Anteil des Fusionsproteins 18 aufrechtzuerhalten. Dies soll sicherstellen, dass das Fusionsproteinkonstrukt behält seine Elastin ähnlichen Eigenschaften, um die ITC zur Aufreinigung verwenden. Die aECM Proteine ​​Design und in diesem Abschnitt beschriebenen Sequenzen wurden speziell von der Arbeit von Tjin et al. 14 genommen. In dieser Arbeit wurden drei aECM Proteine ​​erfolgreich in den pET22b (+) Expressionsvektor kloniert. Sequenzielle Ligation begann mit Ligation des Elastin-Wiederholungen in den pET-Vektor, gefolgt vom Einsetzen der Zellbindungsdomäne einfügen. Schließlich wird die letzte Gruppe von Elastin Repeats am terminalen Ende der Zellbindungsdomäne unter Verwendung des gleichen Verfahrens eingesetzt. Zu überprüfen, ob die rekombinanten Gene erfolgreich aufgebaut wurde jedes rekombinante Plasmid Test mit XhoI und SalI verdaut 3 h bei 37 °C. Die 1 zeigt die DNA-Inserts und Vektor-Bänder nach dem Test Verdauung. Für jede der aECM Proteine ​​die Grße der Inserts entsprach der Größe des Gens, was bestätigt, dass die Klonierung der Tat erfolgreich. Weitere Überprüfung durch DNA-Sequenzierung bestätigt auch die Testergebnisse der Verdauung. Wir konnten die aECM Proteinen durch ITC bei ausreichender Elastingehalt vorliegenden jeweils aECM Protein zu reinigen. 2 zeigt die schematische Darstellung des gesamten Reinigungsverfahrens. Die O / N-Kultur wurde in 1 l-Schüttelkolben mit einem typischen Ausgangs-OD 600 von 0,01 angeimpft. Die Kultur wurde nach 3-4 Stunden OD 600 von 0,6-0,8. Protein-Expression wurde unter Verwendung von 1 mM IPTG induziert. Nach 4 Stunden wird das typische OD von 1,5 erreicht. Die bakterielle Kultur wurde geerntet und zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde gewogen. Das Durchschnittsgewicht des Zellpellets betrug etwa 3 g / lKultur. Das Pellet wurde in TEN-Puffer resuspendiert und bei -80 ° CO / N froren. Eine Reihe von Gefrier- / Tau-Zyklen wurden verwendet, um die Zellen zu lysieren. Die Gefrier-Tau-Stufe bewirkt, dass die Zelle zu quellen und zu schrumpfen, schließlich brechen aufgrund Eiskristallen während des Gefrierprozesses gebildet. Anschließend DNase I und RNase I wurden zu dem Zelllysat zugegeben, um alle DNA und RNA zu verdauen. PMSF ist ein Protease-Inhibitor, der auch zu dem Zelllysat zugegeben wurde, um den Proteinabbau zu minimieren. Um eine vollständige Lyse der Zellen weiter zu gewährleisten, wurde das Lysat weiter beschallt, während auf Eis gehalten. Das Zellysat wurde dann zu 3 Zyklen ITC Reinigung unterworfen. Am Ende der 3 Zyklen wird das Pellet am Ende der Aufwärmzyklus glich Honig in Konsistenz und hatte eine leicht gelbe Färbung. Das Pellet einge transparent bei Kontakt mit Wasser, und leicht in vorgekühlte autoklaviertem Wasser unter Schütteln aufgelöst. Das gereinigte Protein wird dialysiert, um restliche s entfernenalt. Die am Ende des letzten Testzyklus erhaltene Proteinlösung wurde auf eine kurze Länge der Dialyseschlauch (mit 12 kDa Molekulargewicht abgeschnitten). Am Ende der Dialyse wurde die Proteinlösung in ein sauberes 50-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und bei -20 ° C eingefroren. Am nächsten Tag wurde die gefrorene Proteinlösung gefriergetrocknet, um den Wassergehalt zu entfernen. 3 zeigt ein Bild von dem dialysierten Protein, mit einer typischen wollähnlichen Aussehen. Zu bestimmen, ob das Protein-Expression wurde in der Tat hervorgerufen, bevor Proben gesammelt und nach der Induktion wurden durch SDS-PAGE-Elektrophorese analysiert. Dabei wurde 12% SDS-PAGE-Gel ausreicht, um Proteine ​​mit Molekulargewichten von 20-150 kDa zu trennen. Im Falle, dass das Molekulargewicht groß ist, dh&gt; 100 kDa, 8% SDS-PAGE-Gelen konnte bessere Proteintrennung verwendet werden. 4 zeigt eine intensive Proteinbande bei dem vorhergesagten Molekulargewicht der induzierten sample (Bahn 2). Typischerweise wurde SDS-PAGE-Analyse unmittelbar nach der Proteinexpression durchgeführt vor dem Reinigen. Anschließend Proben durch das Reinigungsverfahren kann auch unter Verwendung von SDS-PAGE-Elektrophorese, um eine effiziente Reinigung des Zielproteins sicherzustellen analysiert werden gemacht. 4 zeigt auch ein SDS-PAGE-Gel eines gereinigten Proteinprobe mit einem Molekulargewicht von 22 kDa (Spur 4 enthält ), entsprechend dem LN-5 aECM 14. Die geschätzte Reinheit der aECM Proteine ​​betrug etwa 90% -95%; Dieser Wert wurde durch Vergleich der Verhältnisse der Bandenintensitäten des Zielproteins und andere Proteinbanden auf SDS-Gel (Abbildung 4, Spur 4) vorhanden abgeleitet. Schließlich, um festzustellen, ob das gereinigte Protein wurde in der Tat die aECM Proteine ​​wurde Western-Blotting durchgeführt. Anschließend MALDI-TOF wurde ebenfalls durchgeführt, um den Gehalt an Verunreinigungen des gereinigten Materials 14 genau zu bestimmen. 5 zeigt das Proteinreinheit von the drei aECM Proteine ​​mit SDS-PAGE-Gel in 5A und gegen ein Bild der Nitrozellulosemembran für Western Blotting in 5B zu vergleichen, die das Vorhandensein der Zielproteine ​​Col-IV aECM und LN-5 aECM, markiert mit Anti -6x His-Tag Antikörper mit Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiert. Die endgültigen Ausbeuten der aECM Proteine ​​lagen zwischen 60 mg / l bis 120 mg / L. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52845/52845fig1.jpg" /> Abbildung 1. DNA Agarose-Gelelektrophorese von Proteinen aECM. Überprüfung der endgültigen aECM Protein DNA-Konstrukte durch Restriktionsenzyme Verdauung lief auf 1,2% DNA Agarose-Gel. Rekombinante Plasmide enthalten, für jede der aECM Proteine ​​wurden doppelt mit XhoI und SalI bei 37 ° C verdaut 3 h Die Grßen der Inserts entsprechen der Größe jedes aECM Protein-Gens (FN910: 1,8kbp, Col-IV: 696 bp, LN-5: 699 bp) und die Größe des Vektors pET22b (+) verwendet wird, ist 5,5 kbp. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52845/52845fig2.jpg" /> Figur 2: Schematische Fluss für die Proteinexpression, Lyse und Aufreinigung aECM Proteinen. Die Grundlagen für die Expression des rekombinanten Proteins ausgehend von der Inokulation einer einzelnen Kolonie auf kleine Kultur und skalieren bis 1-l-Kultur, Ernten und Resuspendieren der Zellen, gefolgt von Protein-Lyse. Proteinreinigung wurde unter Verwendung von LCST-Verhalten von Elastin artigen in den künstlichen ECM Proteine ​​vorhanden Domänen durchgeführt. Die aECM Proteine ​​über ITC gereinigt. Mehrere kalte und warme Zyklen wurden durchgeführt, um eine hohe Reinheit des Zielproteins zu erreichen. Schließlich wurden das Zielprotein mit Wasser dialysiert und gefriergetrocknet bis zur weiteren Verwendung. &quot;O / N&quot; = über Nacht. &quot;S / n&quot; = Überstand. Abbildung 3. Bild von lyophilisiert aECM Protein durch Inverse Transition Radfahren. Lyophilized LN5-aECM gereinigt hat eine Wolle-wie Aussehen. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52845/52845fig4.jpg" /> Abbildung 4. SDS-PAGE-Gelelektrophorese von aECM Protein (LN-5 aECM). Spur 1 und 2 zeigt, Kultur vor und nach der Proteininduktion. Vorhandensein eines dicken Band in der Nähe von 22 kDa zeigt, dass der LN-5 aECM wurde erfolgreich zum Ausdruck gebracht. Spur 3 zeigt den vollständigen Zelllysat während Spur 4 zeigt die gereinigten LN-5 aECM Protein nach 3 Zyklen von ITC. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52845/52845fig5highres.jpg" width="600" /> Figur 5 (A) SDS-PAGE-Gel der aECM Proteinen. (B) Western-Blot für 6x His-Tag für Col sondiert-IV Und LN-5 aECM Proteinen. Beide Col-IV und LN-5 aECM Proteine ​​enthalten C-Terminus 6xHis-tag. An der vorhergesagten Molekulargewicht für die Proben LN-5 aECM und 24 kDa für die Proben Col-IV aECM beobachtet bei 22 kDa, die 6x im gereinigten Protein vorhanden His-Tag Positive Chemilumineszenz. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td fo:width="1.5in" style="width:110px"> Medien / L </td><td> Komponenten und Anweisungen </td></tr><tr><td rowspan="9"> SOC-Medium </td><td> 20 g Trypton </td></tr><tr><td> 5 g Hefeextrakt </td></tr><tr><td> 0,6 g NaCl </td></tr><tr><td> 0,2 g KCl </td></tr><tr><td> Hinzufügen und Autoklaven in 940 ml Wasser, </td></tr><tr><td> dann fügen Sie sterile (filtersterilisiert) </td></tr><tr><td> 10 ml 1 M MgCl 2 </td></tr><tr><td> 10 ml 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 40 ml 20% Glucose </td></tr><tr> &lt;td rowspan = &quot;9&quot;&gt; 2 × YT-Medium </td><td> 16 g Trypton </td></tr><tr><td> 10 g Hefeextrakt </td></tr><tr><td> 5 g NaCl </td></tr><tr><td> 15 g Bacto-Agar (Zusatz nur für Agar-Platte) </td></tr><tr><td> In Wasser gelöst und oben bis zu 1 L und Autoklaven. </td></tr><tr><td> Auf Agarplatten, cool bis 55 vorbereiten ° C vor der Zugabe von Antibiotika. </td></tr><tr><td> Gut mischen vor dem Gießen in Petrischale. </td></tr><tr><td> Kühlen die Platten bis Agar verfestigt. </td></tr><tr><td> Wickeln Sie Platten in Parafilm und lagern auf den Kopf in 4 ° C. </td></tr><tr><td rowspan="10"> Terrific Broth (TB) </td><td> 12 g Trypton </td></tr><tr><td> 24 g Hefeextrakt </td></tr><tr><td> 4 ml Glycerol </td></tr><tr><td> Man löst in 700 ml Wasser und Autoklaven. </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> 16,42 g K 2 HPO 4(Merck) </td></tr><tr><td> 2,31 g KH 2 PO 4 (Merck) </td></tr><tr><td> Man löst in 300 ml Wasser und im Autoklaven getrennt, um sicherzustellen, Salze vollständig gelöst. </td></tr><tr><td></td></tr><tr><td> Kombinieren Sie beide mittleren und Salze nach dem Abkühlen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Rezepte für SOC-Medium, 2 × YT-Medium / Agar und Terrific Broth. Medien für E. coli-Kultur in die molekulare Klonierung und die Proteinexpression verwendet. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td fo:width="2in" style="width:200px"> Lösung / L </td><td> Komponenten und Anweisungen </td></tr><tr><td rowspan="4"> Coomassie Brilliant Blue-Färbung </td><td> 0,25 g Coomassie blueR250 </td></tr><tr><td> 100 ml Eisessig </td></tr><tr><td> 450 ml Methylalkohol </td></tr><tr><td> 450 ml Wasser </td></tr><tr><td rowspan = &quot;3&quot;&gt; Entfärbung Lösung </td><td> 100 ml Eisessig </td></tr><tr><td> 400 ml Methylalkohol </td></tr><tr><td> 500 ml Wasser </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Rezepte für Lösungen zu färben und entfärben SDS-PAGE-Gel. Coomassie Brilliant Blue R250 für Färbung und einer Entfärbelösung zur Charakterisierung unter Verwendung von SDS-PAGE.

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Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

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Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

8.8K Aufrufe.  Nanyang Technological University. Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats. 

Serie: Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

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Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

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Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. Several commercial extracellular matrix products are available as hydrogels or membranes, but these do not possess tissue-specific biological activity. Because perfusion decellularization is usually not possible with human heart tissue, we developed a 3-step immersion decellularization process. Human myocardial slices procured during surgery are first treated with detergent-free hyperosmolar lysis buffer, followed by incubation with the ionic detergent, sodium dodecyl sulfate, and the process is completed by exploiting the intrinsic DNase activity of fetal bovine serum. This technique results in cell-free sheets of cardiac extracellular matrix with largely preserved fibrous tissue architecture and biopolymer composition, which were shown to provide specific environmental cues to cardiac cell populations and pluripotent stem cells. Cardiac extracellular matrix sheets can then be further processed into a microparticle powder without further chemical modification, or, via short-term pepsin digestion, into a self-assembling cardiac extracellular matrix hydrogel with preserved bioactivity.

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

This protocol describes the complete decellularization of human myocardium while preserving its extracellular matrix components. Further processing of the extracellular matrix results in the production of microparticles and a cytoprotective self-assembling hydrogel.

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

Entwicklungsbiologie

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern tissue engineering. A technical bottleneck is the deposition of collagen in vitro, as it is notoriously slow, resulting in sub-optimal formation of connective tissue and subsequent tissue cohesion, particularly in skin models. Here, we describe a method which involves the addition of differentially-sized sucrose co-polymers to skin cultures to generate macromolecular crowding (MMC), which results in a dramatic enhancement of collagen deposition. Particularly, dermal fibroblasts deposited a significant amount of collagen I/IV/VII and fibronectin under MMC in comparison to controls.
The protocol also describes a method to decellularize crowded cell layers, exposing significant amounts of extracellular matrix (ECM) which were retained on the culture surface as evidenced by immunocytochemistry. Total matrix mass and distribution pattern was studied using interference reflection microscopy. Interestingly, fibroblasts, keratinocytes and co-cultures produced cell-derived matrices (CDM) of varying composition and morphology. CDM could be used as &#34;bio-scaffolds&#34; for secondary cell seeding, where the current use of coatings or scaffolds, typically from xenogenic animal sources, can be avoided, thus moving towards more clinically relevant applications.
In addition, this protocol describes the application of MMC during the submerged phase of a 3D-organotypic skin co-culture model which was sufficient to enhance ECM deposition in the dermo-epidermal junction (DEJ), in particular, collagen VII, the major component of anchoring fibrils. Electron microscopy confirmed the presence of anchoring fibrils in cultures developed with MMC, as compared to controls. This is significant as anchoring fibrils tether the dermis to the epidermis, hence, having a pre-formed mature DEJ may benefit skin graft recipients in terms of graft stability and overall wound healing. Furthermore, culture time was condensed from 5 weeks to 3 weeks to obtain a mature construct, when using MMC, reducing costs.

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

We present a protocol to obtain cell-derived matrices rich in extracellular matrix proteins, using macromolecular crowders (MMC). In addition, we present a protocol which incorporates MMC in 3D organotypic skin co-culture generation, which reduces culture time while maintaining maturity of construct.

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue culture systems lack a three-dimensional (3D) matrix, resulting in a significant disconnect between results collected in vitro and in vivo. To address this limitation, researchers have engineered 3D hydrogel tissue culture platforms that can mimic the biochemical and biophysical properties of the in vivo cell microenvironment. This research has motivated the need to develop material platforms that support 3D cell encapsulation and downstream biochemical assays. Recombinant protein engineering offers a unique toolset for 3D hydrogel material design and development by allowing for the specific control of protein sequence and therefore, by extension, the potential mechanical and biochemical properties of the resultant matrix. Here, we present a protocol for the expression of recombinantly-derived elastin-like protein (ELP), which can be used to form hydrogels with independently tunable mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration. We further present a methodology for cell encapsulation within ELP hydrogels and subsequent immunofluorescent staining of embedded cells for downstream analysis and quantification.

Recombinant protein-engineered hydrogels are advantageous for 3D cell culture as they allow for complete tunability of the polymer backbone and therefore, the cell microenvironment. Here, we describe the process of recombinant elastin-like protein purification and its application in 3D hydrogel cell encapsulation.

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Two-dimensional (2D) tissue culture techniques have been essential for our understanding of fundamental cell biology. However, traditional 2D tissue ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...

<meta charset="utf8"></head><body>Effiziente 3D-Hautmodelle für flexible Forschungsanwendungen

Building Up Skin Models for Numerous Applications - from Two-Dimensional (2D) Monoculture to Three-Dimensional (3D) Multiculture

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical industries. In the European Union, there has been a total ban on testing cosmetic products and their ingredients on animals. In the case of medicine and pharmaceuticals, this possibility is also constantly limited. In accordance with the 3Rs principle, it is becoming more and more common to test individual compounds as well as entire formulations on artificially created models. The cheapest and most widely used are the 2D models, which consist of a cell monolayer but do not reflect the real interactions between the cells in the tissue. Although the commercially available 3D models provide a better representation of the tissue, they are not used on a large scale. This is because they are expensive, the waiting time is quite long, and the available models are frequently limited to only those typically used. 
In order to move the conducted research to a higher level, we have optimized the procedures of various 3D skin model preparations. The described procedures are cheap and simple to prepare as they can be applied in numerous laboratories and by researchers with different experiences in cell culture.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Vielfalt von Hautmodellen mit kostengünstigen 3D-Zellmodellen

Here, we present inexpensive and simple procedures to introduce various 3D skin models for routine research in a cell culture laboratory. Researchers can create models tailored to their needs without relying on commercially available models.

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Due to the complex structure and important functions of the skin, it is an interesting research model for the cosmetic, pharmaceutical, and medical ...

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

Engineering 3D cellularized Kollagengele für Gefäßgeweberegeneration

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

Aufbau von Hautmodellen für zahlreiche Anwendungen - von der zweidimensionalen (2D) Monokultur bis zur dreidimensionalen (3D) Multikultur

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

Zusammenfassung

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Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Ein Vollhautdefekt Modell zur Vaskularisierung von Biomaterialien Bewerten

Verarbeitung von menschlichen Herzgewebe in Richtung extrazelluläre Matrix selbst Montage Hydrogel für In Vitro und In Vivo -Anwendungen

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Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Produktion von Elastin-Like Protein Hydrogele für Kapselung und Immunostaining Zellen in 3D

Produktion von Fasern der extrazellulären Matrix über Opfer Hohlfaser-Membran Zellkultur

Generierung von selbst zusammengesetzten vaskularisierten äquivalenten menschlicher Haut

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Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus