Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
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Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse des öffentlichen Gesundheitsdienstes AI41816 und AI099339 (N.E.F.) sowie durch F31AI094886-01 (P.D.M.) von NIAID unterstützt. Die Inhalte liegen allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht unbedingt die offizielle Meinung der Finanzierungsquellen dar.

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	<li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+hot+dogs+to+host+cells:+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression.">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li><li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+epidemiology,+human+disease,+and+mechanisms+of+brain+invasion.">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li><li>Farber, J. M., Peterkin, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes.+a+food-borne+pathogen.">Listeria monocytogenes. a food-borne pathogen.</a> Microbiol. Rev. 55, 476-511 (1991).</li><li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+how+Listeria+monocytogenes+targets+and+crosses+host+barriers.">Understanding how Listeria monocytogenes targets and crosses host barriers.</a> Clin Microbiol Infect. 11, 430-436 (2005).</li><li>Lecuit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+listeriosis+and+animal+models.">Human listeriosis and animal models.</a> Microbes Infect. 9, 1216-1225 (2007).</li><li>Bou Ghanem, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice.">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).</li><li>Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+with+signature-tagged+Listeria+monocytogenes+reveals+organ-specific+growth+and+dissemination+routes+in+guinea+pigs.">Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs.</a> Infect Immun. 80, 720-732 (2012).</li><li>Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+subpopulations+of+Listeria+monocytogenes+with+enhanced+invasion+of+cardiac+cells.">Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells.</a> J Med Microbiol. , (2011).</li><li>Adler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pseudotumor+of+the+heart+caused+by+Listeria+monocytogenes+infection.">Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection.</a> J Infect. 58, 161-163 (2009).</li><li>Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+Listeria:+description+of+two+cases+and+review+of+the+literature.">Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature.</a> Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).</li><li>Brouqui, P., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+rare+and+fastidious+bacteria.">Endocarditis due to rare and fastidious bacteria.</a> Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).</li><li>Brusch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient.">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li><li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct.">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li><li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells.">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li><li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+silage,+sandwiches+and+science.">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li><li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li><li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes.">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776,+a+cardiotropic+serovar+4b+strain.">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552 (2012).</li></ol>

Die Autoren berichten von keinen konkurrierenden finanziellen Interessen.

L. monocytogenes ist ein weit verbreiteter und gut charakterisierter menschlicher Erreger, der in der Lage ist, eine Reihe verschiedener Krankheitserscheinungen zu verursachen15. Das Bakterium wurde zuvor für seine Fähigkeit beschrieben, über Barrieren, wie die Blut-Hirn-Barriere und Plazenta-fetale Barrieren zu translozieren, um das zentrale Nervensystem zu erreichen und zu besiedeln bzw. Fötus zu entwickeln. Die In-vivo-Fähigkeit des Organismus, diese Gewebe zu besiedeln, wird oft durch eine In-vitro-Fähigkeit ergänzt, in die repräsentativen Zellen in die Kultur einzudringen, aus der die betroffenen Organe besteht. Zum Beispiel wurde die Invasion von Epithelzellen im Aderhautplexus mit der Fähigkeit des Organismus in Verbindung gebracht, das ZNS16zu kolonisieren; und villous trophoblast Explants wurden verwendet, um die mütterlich-fetale Barriere17darzustellen. In diesem Protokoll wurden Methoden beschrieben, die nützlich sind, um die bakterielle Invasion von Herzzellen in der Kultur sowie für den Vergleich der bakteriellen Besiedlung des Herzens für einzelne Isolate relativ zur Besiedlung von Leber und Milz zu bewerten.
Dieses Protokoll enthält eine Reihe von kritischen Schritten, aber zu den kritischsten gehören diejenigen, die die Verwendung der richtigen bakteriellen KBE für entweder die Infektion von Gewebekulturzellen auf Decklippen oder die Infektion von Tieren. Wenn die bakterielle KBE-Zahl zwischen verschiedenen Brunnen und Tieren nicht korrekt kontrolliert wird, können keine direkten Vergleiche zwischen Proben angestellt werden. Es ist wichtig, die Verdünnungsreihen, die zur Erzeugung der Inocula verwendet werden, durch direkte Beschichtung der Endverdünnungen auf Medienplatten zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die bakterielle KBE-Zahl genau geschätzt wurde.
Die in diesen Assays verwendeten H9c2-Zellen stammen aus der unteren Hälfte eines 13-tägigen embryonalen Rattenherzs, das hauptsächlich ventrikuläres Gewebe18enthielt. Die Zellen vermehren sich als mononukleierte Myoblasten und nach Erreichen der Durchblutung in Gewebekulturkolben oder Geschirr beginnen, multinukleierte röhrenförmige Strukturen zu bilden. Die Zellen haben eine Erzeugungszeit von ca. 30 hr18. Serumhunger von H9c2-Zellen wurde mit der Differenzierung der Zellen in Skelettmuskelzellen in Verbindung gebracht, während die Behandlung der Myoblasten mit 10 nM All-Trans-Retinsäure mit myoblastischer Differenzierung in Herzmyozyten14assoziiert wurde. Dieses Protokoll konzentrierte sich auf L. monocytogenes Myoblast Zellinvasion, aber die H9c2-Zelllinie ist eine vielseitige Zelllinie, die verwendet werden könnte, um die Auswirkungen der kontrollierten Zelldifferenzierung auf die bakterielle Invasion zu untersuchen.
Der L. monocytogenes Stamm 07PF0776 wurde ursprünglich von einem HIV-infizierten Patienten isoliert, der aufgrund einer invasiven L. monocytogenes-Infektion des Herzens8einen nicht resusitierbaren asystolischen Arrest hatte. Die anschließende Analyse dieses Stammes in Mausinfektionsmodellen zeigte, dass er eine verbesserte Fähigkeit hatte, auf Herzgewebe zu zielen und einzudringen. Eine begrenzte Analyse weiterer zufälliger Isolate von L. monocytogenes legt nahe, dass Subpopulationen von bakteriellen Isolaten in der Lage sind, die Herzen von Mäusen zu infizieren, wenn keine vorherigen Schäden an Herzgewebe oder Herzklappen vorliegen8. Interessanterweise wurden zwei der am besten charakterisierten L. monocytogenes Stämme, 10403S und EGD, als schlechte Kolonisatoren von Herzzellen und Gewebe gefunden. Die Genomsequenzierung des 07PF0776-Isolats ergab weder das Vorhandensein neuer Pathogenitätsinseln noch beweise einzigartige Gencluster19; dies deutet darauf hin, dass 07PF0776 Herzzellen für die Invasion durch Modifikation seines bestehenden Arsenals von Virulenz-Genprodukten ins Visier nimmt. Vorläufige histochemische Analysen zeigen, dass 07PF0776 Abszesse in infizierten Mausherzen bildet, die dem Abszess ähneln, der beim ursprünglichen infizierten menschlichen Patienten beobachtet wurde (Daten nicht gezeigt). Ob andere kardiotrope L. monocytogenes Isolate eine ähnliche Herzabszessbildung induzieren, bleibt abzuwarten.
Die hier vorgestellten Assays können leicht modifiziert werden, um die Untersuchung verschiedener Aspekte der Infektion zu erleichtern. Einzelne Abdeckungen können entweder für die Licht- oder Fluoreszenzmikroskopie fixiert und gebeizt werden, die Inkubationszeiten der Gewebekultur können für die Messung und den Vergleich von Bakterien-intrazellulären Wachstumsraten erhöht werden, Gewebe und Organe können paraffin eingebettet und für eine mikroskopische Untersuchung verarbeitet werden, um die Abszessbildung und die bakterielle Verteilung auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Bei der Bewertung der bakteriellen Invasion von Gewebekulturzellen oder der Besiedlung von Wirtsgeweben gibt es Einschränkungen in Bezug auf die minimale Menge an Bakterien, die jeder Assay erkennen kann. In-vitro-Invasions-Assays haben eine untere Nachweisgrenze von ca. 300 KBE pro Deckslip. Die Anpassung des Wasservolumens, das zum Wirbeln der Abdeckungen verwendet wird, kann den Nachweis einer geringen Anzahl von Bakterien verbessern, wobei sich die Zelllysevolumina von bis zu 500 l als nützlich erweisen, um schlecht invasive Stämme zu erkennen. Coverlips können kurz in steriles Wasser getaucht werden, um überschüssiges Gentamicin vor der Lyse von Wirtszellen in kleineren Mengen zu entfernen. Volumenstufen bis zu 5 ml oder mehr können verwendet werden, um hochinvasive Stämme richtig aufzuzählen. Bei den Tieren können Organhomogenate in Volumen von 5 ml oder 10 ml ddH20 erzeugt werden, wobei geringere Volumina nützlich sind, um niedrigere Bakterienkonzentrationen zu erkennen, und höhere Volumina, um stark besiedelte Organe besser aufzuzählen. Der minimale Erfassungsbereich für infizierte Organe beträgt ca. 100 KBE. Wenn Organe konsequent auf hohem Niveau kolonisiert werden, sollten Sie ein größeres Volumen wasser (10 ml) verwenden und mehr Verdünnungen innerhalb der 96-Well-Platte durchführen.
Die beschriebenen Methoden können auf Organe und Gewebe außerhalb des Herzens angewendet werden. Invasion Assays und Maus-Infektionen wie diese wurden verwendet, um die Besiedlung in einer Vielzahl von Standorten zu bewerten, einschließlich der Plazenta, Gehirn, Gallenblase, Leber, und Darm. Änderungen der oben beschriebenen Protokolle können auch vorgenommen werden, um hyperinvasive und/oder hypervirulente Stämme aufzunehmen, und die Substitution von Herzzellen durch andere Zelltypen kann durchgeführt werden, um Invasions-Phänotypen an Stellen außerhalb des Herz-Kreislauf-Systems zu bewerten. Da verschiedene Zelltypen die Anfälligkeit für die Invasion von L. monocytogenes verändert haben, können Anpassungsparameter wie MOI und Inkubationszeiten erforderlich sein, um daten von den Assays genau wiederherzustellen.

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver intrazellulärer Erreger, der schwere Krankheiten in anfälligen Populationen verursachen kann, einschließlich älterer Menschen, Schwangerer, HIV/AIDS-Patienten und Patienten, die eine Chemotherapie erhalten1. Infektionen in diesen Populationen sind häufig das Ergebnis der Einnahme kontaminierter Lebensmittel, und die meisten Infektionen sind mit großangelegten lebensmittelbedingten Ausbrüchen verbunden2,3. Bei Menschen und anderen Säugetieren ist L. monocytogenes in der Lage, sich über die Epithelgrenze des Dünndarms zu transortieren und anschließend in die Leber transportiert zu werden4,5. Tiermodelle deuten darauf hin, dass aufgenommene Bakterien sich innerhalb der Darmzotten vermehren und durch die Portalvene in die Leber gelangen oder sich über die mesenterischen Lymphknoten in den Blutkreislauf ausbreiten, was zu einer hämatogenen Verbreitung in der Leber und Milz6,7führt. In der Leber und Milz ist das Bakterium in der Lage, sowohl in professionelle Phagozyten als auch in ansässigen parenchymalen Zellen zu vermitteln und stellt schnell Infektionen in diesen Organen her. Mit zunehmender bakterieller Belastung werden zahlreiche Bakterien wieder ins Blut verteilt, wo sie in der Lage sind, empfängliche Gewebe, einschließlich des zentralen Nervensystems und der Plazenta (sofern vorhanden), weiter zu besiedeln. Kolonisierung dieser Standorte schließt die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen, einschließlich Meningitis, Enzephalitis, und fetale Abtreibung2.
Ausgewählte Subpopulationen von L. monocytogenes haben vor kurzem gezeigt, dass eine verbesserte Fähigkeit, in Herzgewebe eindringen und replizieren8. Manifestationen der Herzbeteiligung sind vielfältig und reichen von Endokarditis und Perikarditis bis hin zu fulminanten Myokarditis mit Leitstörungen9-13. Die Gesamtzahl der L. monocytogenes Herzfälle pro Jahr ist gering, kann aber unterschätzt werden, da diese Facette der Infektion im Allgemeinen nicht gut erkannt wird. Die Besiedlung des Herzens durch Krankheitserreger erfordert oft Wirtsveranlagungen wie bereits bestehende Valvularschäden oder künstliche Herzklappen. Es gibt jedoch Isolate von L. monocytogenes, die identifiziert wurden, die für ihre Fähigkeit, die Herzen der infizierten Tiere in Ermangelung von Herzschäden und/oder Anomalien8zu besiedeln bemerkenswert sind.
Hierin werden in vitro und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Besiedlung von Herzgewebe in infizierten Tieren mit Invasions-Assays in der Gewebekultur sowie lebenden Tierinfektionen beschrieben. Diese Methoden haben sich nicht nur bei der Identifizierung von Stämmen mit dem Potenzial zur Besiedlung von Herzgewebe bei infizierten Tieren als nützlich erwiesen, sondern sollten auch für die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten nützlich sein, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder zu Veränderungen in der Herzpathologie führen. Diese Methoden erleichtern den Vergleich des Kardiographen zwischen mehreren Stämmen. Für die hier beschriebenen Methoden wird L. monocytogenes 10403S als gut untersuchter Vertreter eines nichtkardiotropen Stammes und das klinische Isolat 07PF0776 als repräsentatives Beispiel für einen kardiotropen Stamm verwendet. Diese beiden Stämme wurden ausgewählt, um einen Vergleich für die bakterielle Invasion von Herzzellen in vitro und die Besiedlung von Herzen infizierter Mäuse in vivozu liefern. Das Isolat 07PF0776 ist ein klinisches Isolat, das aus einem interventrikulären Abszess gewonnen wurde, der bei einem HIV+-Patienten eine tödliche Arrhythmie verursachte8. L. Monocytogenes-Isolate können in ihrem Virulenzpotenzial variieren, und angesichts der Neigung für Listerien, Personen mit Immunsuppression zu infizieren und Schwangere, sollten Personen innerhalb dieser Populationen bei der Beurteilung verschiedener klinischer Isolate Vorsicht walten lassen.

<table><tbody><tr><td>Difco</td><td>BHI Broth Base</td><td>237200</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td></tr><tr><td>Difco</td><td>Agar</td><td>214510</td><td>2 kg of Granulated Agar</td></tr><tr><td>Difco</td><td>BHI Agar</td><td>241810</td><td>2 kg of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td></tr><tr><td>in vitrogen</td><td>LB Broth Base</td><td>12975-084</td><td>2 kg of Luria Broth Base Powder (without agar)</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Glass Coverslips</td><td>12-545-80</td><td>12 mm glass coverslips</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>24-well Tissue Culture Plate</td><td>35-3047</td><td>24 well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>14mL Polystyrene tube</td><td>352051</td><td>14 ml Polystyrene tubes</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>96-well U-bottom plate</td><td>35-3077</td><td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td></tr><tr><td>Corning</td><td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td><td>25-052-CI</td><td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td><td>15-013-CU</td><td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Pen/Strep/Glut Solution</td><td>30-009-CI</td><td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td></tr><tr><td>Corning</td><td>Gentamicin</td><td>30-005-CR</td><td>50 mg/ml Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td></tr><tr><td>Cellgro (Corning)</td><td>L-Glutamine</td><td>25005197</td><td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td></tr><tr><td>Denville</td><td>75cm^2 Flask</td><td>T1225</td><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; tissue culture treated flask</td></tr><tr><td>Denville</td><td>1.5mL microcentrifuge tubes</td><td>2013004</td><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>ATCC</td><td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td><td>CRL-1446</td><td>Rat cardiac myoblasts</td></tr><tr><td>Hyclone</td><td>Fetal Bovine Serum</td><td>SH30070.63</td><td>Fetal Bovine Serum</td></tr></tbody></table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes ist ein grampositiver fakultativer intrazellulärer Erreger, der in der Lage ist, schwere invasive Infektionen bei immungeschwächten Patienten, älteren Menschen und Schwangeren zu verursachen. Die häufigsten Manifestationen der Listeriose beim Menschen sind Meningitis, Enzephalitis und fetale Abtreibung. Eine signifikante, aber viel weniger dokumentierte Fortsetzung der invasiven L. monocytogenes Infektion betrifft das Herz. Die Sterblichkeitsrate durch Herzerkrankungen kann trotz Behandlung bis zu 35% betragen, allerdings ist sehr wenig über die Besiedlung von Herzgewebe und deren folgenden Pathologien bekannt. Darüber hinaus hat sich in jüngster Zeit gezeigt, dass Subpopulationen von L. monocytogenes eine verbesserte Fähigkeit haben, in Herzgewebe einzudringen und zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt detailliert In-vitro- und In-vivo-Methoden, die zur Beurteilung des Kardiographenvon L. monocytogenes Isolate verwendet werden können. Methoden werden zur Infektion von H9c2-Ratten-Herzmyoblasten in der Gewebekultur sowie zur Bestimmung der bakteriellen Besiedlung der Herzen infizierter Mäuse vorgestellt. Diese Methoden sind nicht nur nützlich, um Stämme mit dem Potenzial zu identifizieren, Herzgewebe bei infizierten Tieren zu besiedeln, sondern können auch die Identifizierung von bakteriellen Genprodukten erleichtern, die dazu dienen, die Invasion von Herzzellen zu verbessern und/oder Veränderungen in der Herzpathologie voranzutreiben. Diese Methoden sehen auch den direkten Vergleich des Kardiontropismus zwischen mehreren L. monocytogenes Stämmen vor.

Ausgewählte Isolate von L. monocytogenes zeigen eine verbesserte Invasion von Herzzellen in der Zellkultur und in Mausmodellen der Infektion. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel dafür, wie bakterielle Kolonien nach der Fleckbeschichtung von Suspensionen auf Agarmedien auftreten können. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung von KBE innerhalb einer Probe, ohne eine große Anzahl von Agar-Medienplatten zu verwenden. Abbildung 2 zeigt ein Beispiel für einen gewebekulturbasierten Assay, der die Fähigkeit des Stammes 10403S vergleicht, in Herzzellen einzudringen, mit der des Stammes 07PF0776. Mehr als doppelt so viele 07PF0776 bakterielle KBE kann aus infizierten H9c2-Herzzellen nach Derichticin-Behandlung im Vergleich zu Zellen mit 10403S infiziert zurückgewonnen werden. Unterschiede von 2 bis 4-fach werden routinemäßig für kardiotrope Stämme mit diesem Assay beobachtet. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für die Wiederherstellung von Bakterien aus der Leber, Milz, und Herzen von infizierten Mäusen an 3 Tagen nach der Infektion. Die Infektion von Mäusen mit dem kardiotropen Stamm 07PF0776 oder Stamm 10403S führt zu einer vergleichbaren Anzahl von Bakterien, die aus der Leber und Milz infizierter Mäuse gewonnen werden, jedoch sind Mäuse, die mit 07PF0776 infiziert sind, eher nachweisbare Anzahl von Bakterien aus dem Herzen zu erzielen und größere bakterielle Belastungen in diesem Organ aufweisen.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig1.jpg"> Abbildung 1: Beispiel für die Spot-Beschichtungstechnik zur Bestimmung bakterieller KBE. H9c2-Zellen, die auf Glasabdeckungen angebaut und mit L. monocytogenes infiziert wurden, wurden lysiert und Suspensionen wurden mit 1:10 Verdünnungen bis zu einer Verdünnung von 1:1.000 (linkes Panel) seriell verdünnt. Eine Mehrkanalpipette wurde verwendet, um 10 ul von jedem Brunnen direkt auf eine LB-Agarplatte zu leiten, und die Platte wurde über Nacht bei 37 °C (rechte Platte) inkubiert. Die Anzahl der Bakterien pro Deckslip wird durch Zählen der bakteriellen KBE im Zusammenhang mit der entsprechenden Verdünnung bewertet.
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig2.jpg"> Abbildung 2: L. monocytogenes Stamm 07PF0776 zeigt verbesserte Invasion von Herzzellen in der Gewebekultur. Invasions-Assays wurden in H9c2-Zellen mit einem MOI = 100 durchgeführt. Grafik zeigt die durchschnittliche Anzahl der intrazellulären bakteriellen KBE erholt +/- SE aus Zellen mit 10403S (schwarz) im Vergleich zu den kardiotropen 07PF0776 Stamm (blau) infiziert. ** gibt eine Signifikanz von p <0.01 an.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52497/52497fig3.jpg"> Abbildung 3: L. monocytogenes Stamm 07PF0776 zeigt verbesserte Invasion des Herzens in Maus-Infektionsmodelle. Die Tiere wurden mit 10.000 KBE über die Schwanzvene geimpft. Infektionen wurden für 72 Stunden fortschreiten gelassen, an dem Punkt, an dem die Tiere geopfert wurden und die Lebern, Milz, und Herzen gesammelt und verarbeitet wurden, um bakterielle KBE pro Organ zu bestimmen. Feste Kreise stellen die KBE dar, die von einzelnen Mäusen erhalten wurde, wobei der Durchschnittswert für alle Tiere innerhalb einer Gruppe durch eine Linie +/- SE angegeben wird. Die Prozentwerte geben die Anzahl der Tiere an, die nachweisbare bakterielle KBE im Herzen enthalten. * gibt eine Signifikanz von p <0.05 an.

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten.

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

5.4K Aufrufe.  College of Medicine, University of Illinois at Chicago. Listeria monocytogenes verursacht fetale Infektionen bei Schwangeren und Meningitis in anfälligen Populationen. Subpopulationen von Bakterien können Herzgewebe besiedeln, was bei Patienten und Labortieren Zufluss zu Myokarditis führt. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das beschreibt, wie L. monocytogenes Herzzellinvasion in vitro und Herzkolonisation bei infizierten Tieren zu bewerten. 

Serie: Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of Listeria, which results in systemic infection2. After injection, Listeria quickly disseminates to the spleen and liver due to uptake by CD8&alpha;+ dendritic cells and Kupffer cells3,4. Once phagocytosed, various bacterial proteins enable Listeria to escape the phagosome, survive within the cytosol, and infect neighboring cells5. During the first three days of infection, different innate immune cells (e.g. monocytes, neutrophils, NK cells, dendritic cells) mediate bactericidal mechanisms that minimize Listeria proliferation. CD8+ T cells are subsequently recruited and responsible for the eventual clearance of Listeria from the host, typically within 10 days of infection6.
Successful clearance of Listeria from infected mice depends on the appropriate onset of host immune responses6	. There is a broad range of sensitivities amongst inbred mouse strains7,8. Generally, mice with increased susceptibility to Listeria infection are less able to control bacterial proliferation, demonstrating increased bacterial load and/or delayed clearance compared to resistant mice. Genetic studies, including linkage analyses and knockout mouse strains, have identified various genes for which sequence variation affects host responses to Listeria infection6,8-14. Determination and comparison of infection kinetics between different mouse strains is therefore an important method for identifying host genetic factors that contribute to immune responses against Listeria. Comparison of host responses to different Listeria strains is also an effective way to identify bacterial virulence factors that may serve as potential targets for antibiotic therapy or vaccine design.
We describe here a straightforward method for measuring bacterial load (colony forming units [CFU] per tissue) and preparing single-cell suspensions of the liver and spleen for FACS analysis of immune responses in Listeria-infected mice. This method is particularly useful for initial characterization of Listeria infection in novel mouse strains, as well as comparison of immune responses between different mouse strains infected with Listeria. We use the Listeria monocytogenes EGD strain15 that, when cultured on blood agar, exhibits a characteristic halo zone around each colony due to &beta;-hemolysis1 (Figure 1). Bacterial load and immune responses can be determined at any time-point after infection by culturing tissue homogenate on blood agar plates and preparing tissue cell suspensions for FACS analysis using the protocols described below. We would note that individuals who are immunocompromised or pregnant should not handle Listeria, and the relevant institutional biosafety committee and animal facility management should be consulted before work commences.

Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a model organism for studying immune responses and genetic susceptibility to intracellular bacteria in mice. This method enables one to measure bacterial load and generate single-cell suspensions of the liver and spleen from mice for FACS analysis to determine changes in immune cells due to Listeria infection.

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes</em

Listeria monocytogenes (Listeria) is a Gram-positive facultative intracellular pathogen1. Mouse studies typically employ intravenous injection of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the gastrointestinal phase of listeriosis due to the lack of a small animal model that closely mimics human disease. This paper describes a novel mouse model for oral transmission of L. monocytogenes. Using this model, mice fed L. monocytogenes-contaminated bread have a discrete phase of gastrointestinal infection, followed by varying degrees of systemic spread in susceptible (BALB/c/By/J) or resistant (C57BL/6) mouse strains. During the later stages of the infection, dissemination to the gall bladder and brain is observed. The food borne model of listeriosis is highly reproducible, does not require specialized skills, and can be used with a wide variety of bacterial isolates and laboratory mouse strains. As such, it is the ideal model to study both virulence strategies used by L. monocytogenes to promote intestinal colonization, as well as the host response to invasive food borne bacterial infection.

Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food

This paper describes a novel method for oral infection of mice using Listeria monocytogenes-contaminated food. The protocol can readily be adapted for use with other food borne bacterial pathogens.

Mündliche Übertragung von<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Mäusen über die Aufnahme von kontaminierten Speisen

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Experimentelle Infektion mit<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Als Modell für die Untersuchung Host-Interferon-γ Antworten

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled microscopic lesions (microlesions) that are remarkable due to the absence of infiltrating immune cells. Due to their release of cardiotoxic products, S. pneumoniae within microlesions are thought to contribute to the heart failure that is frequently observed during fulminate invasive pneumococcal disease in adults. Herein is demonstrated a protocol for experimental mouse infection that leads to reproducible cardiac microlesion formation within 30 hr. Instruction is provided on microlesion identification in hematoxylin &#38; eosin stained heart sections and the morphological distinctions between early and late microlesions are highlighted. Instruction is provided on a protocol for verification of S. pneumoniae within microlesions using antibodies against pneumococcal capsular polysaccharide and immunofluorescent microscopy. Last, a protocol for antibiotic intervention that rescues infected mice and for the detection and assessment of scar formation in the hearts of convalescent mice is provided. Together, these protocols will facilitate the investigation of the molecular mechanisms underlying pneumococcal cardiac invasion, cardiomyocyte death, cardiac remodeling as a result of exposure to S. pneumoniae, and the immune response to the pneumococci in the heart.

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Streptococcus pneumoniae forms discrete non-purulent microscopic lesions in the heart. Outlined is the protocol for a murine model of cardiac microlesion formation. Instruction is provided on microlesion visualization using microscopy, discrimination between early and late microlesions, and methods to detect cardiac remodeling in hearts of convalescent animals.

Visualisierung<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Innerhalb Cardiac Mikroläsionen und anschließende Herz Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

Medizin

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. monocytogenes to cross the blood-brain barrier (BBB) is concerning as it can lead to life-threatening meningitis and encephalitis. The BBB protects the brain microenvironment from various toxic metabolites and microbial pathogens found in the blood following infection, and therefore supports brain homeostasis. The mechanisms by which L. monocytogenes present in the bloodstream cross the BBB to cause brain infections are not fully understood and there is also a lack of a robust model system to study brain infections by L. monocytogenes. Here, we present a simple mouse infection model to determine whether bacteria have crossed the BBB and to quantitate the burden of bacteria that have colonized the brain in vivo. In this method, animals were infected intravenously with L. monocytogenes and were humanely euthanized by exposure to CO2 followed by cervical dislocation. Cardiac perfusion of the animals was performed prior to harvesting infected organs. Blood was collected before perfusion and the number of bacteria per organ or mL of blood was determined by plating dilutions of the blood or organ homogenates on agar plates and counting the number of colonies formed. This method can be used to study novel receptor-ligand interactions that enhance infection of the brain by L. monocytogenes and can be easily adapted for the study of multiple bacterial pathogens.

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

During infection, Listeria monocytogenes is capable of crossing the blood-brain barrier to colonize the brain. In this protocol, we demonstrate how to assess bacterial colonization of organs following infection of mice. A procedure to perform whole organ perfusion for specific determination of bacterial numbers in the brain parenchyma is provided.

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in an Ex Vivo Organ Culture

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates a method to establish an infection model in placental tissues to study infection propagation. An ex vivo placental organ culture is infected with Listeria monocytogenes, a facultative intracellular parasite. The bacteria invade extravillous trophoblasts (EVTs) to enter the placental tissue and then propagate to other cells via cell-to-cell spread.

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in einer ex vivo Organkultur

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunopathology

In Vitro Models

Quantification of Bacterial Infection in Host Cells by the Colony-Forming Unit Assay

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video demonstrates an in vitro quantification technique to determine Listeria monocytogenes infection of macrophages by the colony-forming unit assay. The bacterial colonies on the agar plate represent the intracellular bacterial population that escapes the host-defense mechanism and survives within the macrophages.

Quantifizierung der bakteriellen Infektion in Wirtszellen durch den koloniebildenden Unit-Assay

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.&#160;J. Vis. Exp.&#160; (2019).
This video ...

Immune Response

Host-Pathogen Interaction

Flow Cytometry Analysis of Intracellular and Emergent Extracellular Listeria monocytogenes In Vitro

Source: Gayle, P. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58775">Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses.</a> J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we quantify intracellular and extracellular Listeria monocytogenes, an intracellular pathogenic bacteria, following their infection of cultured macrophages in vitro using flow cytometry.

Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären und emergenten extrazellulären Listeria monocytogenes in vitro

Source: Gayle, P. et al., Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses. J. Vis. Exp. (2019)
In this video, we ...

Beurteilung der bakteriellen Invasion von Herzzellen in Kultur und Herzkolonisation bei infizierten Mäusen mit Listeria monocytogenes

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Mess-bakterielle Belastung und Immunreaktionen in Mäuse Infizierte mit Listeria monocytogenes

Mündliche Übertragung von

Imaging InlC Sekretion to Cellular-Infektion durch den bakteriellen Erreger untersuchen

Experimentelle Infektion mit

Visualisierung

Listeria monocytogenes Infektion des Gehirns

Verwenden eine bakterielle Erreger, Sonde für zelluläre und organismische Ebene Host Antworten

Eine Technik zur Etablierung eines bakteriellen Infektionsmodells in einer ex vivo Organkultur

Quantifizierung der bakteriellen Infektion in Wirtszellen durch den koloniebildenden Unit-Assay

Durchflusszytometrische Analyse von intrazellulären und emergenten extrazellulären Listeria monocytogenes in vitro