We would like to thank Dr. Marc Liesa, Boston University School of Medicine, helpful discussions; Ms. Karin Murphy, Ms. Heather Gregory, and Mr. John Stone, all from Wake Forest School of Medicine, for helpful technical assistance in the development of this protocol.

HINWEIS: Die beschriebenen wurde vom Institutional Review Board der Wake Forest School of Medicine genehmigten Protokoll. Eine Einverständniserklärung wurde schriftlich erhalten. Alle Teilnehmer waren gesunden älteren Erwachsenen (65-79 Jahre) beider Geschlechter, mit BMI zwischen 23-35. 1. Skelettmuskelbiopsie <ol><li> Wie zuvor beschrieben, 9 führen alle Biopsien am frühen Morgen, nachdem ein A / N schnell. Fragen Sie die Themen, zum von Aspirin, verschreibungspflichtigen und OTC-the-counter-nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente oder andere Verbindungen, die Blutungen, Blutplättchen oder Blutergüsse in der Woche vor der Biopsie beeinflussen können unterlassen. Bitten Sie die Teilnehmer auch von jeder anstrengenden Tätigkeit zu enthalten mindestens 36 Stunden vor der Biopsie. HINWEIS: Muscle aus dem Vastus lateralis erhalten mit dem perkutanen Nadelbiopsie Technik mit einem perkutanen Nadel unter Lokalanästhesie mit 1% Lidocain. Keine medizinische Komplikationen oder other berichteten Nebenwirkungen von dem Verfahren wurden in unserem klinischen Forschungseinheit aufgetreten. </li><li> HINWEIS: Die beschriebene Biopsieprozedur wird von der Bergstrom 10 ausgelegt. <ol><li> Kurz gesagt, lokal zu verabreichen 1% Lidocain kümmert sich nicht um den Muskel zu infiltrieren. Befolgen Sie diese mit einem 10 Minuten Wartezeit, um eine ausreichende Betäubung ermöglichen. </li><li> Nehmen Sie die Biopsien aus dem Bauch des Muskels (der mittlere Bereich des Muskels zwischen Ein- und Herkunft) zu vermeiden subfaszialen und myotendonous Bereichen. <ol><li> Verwenden perkutane Nadel (eine Saugwirkung unterstützt wiederverwendbaren Gerät mit einem Seitenschneider Fenster und Innenschneidzylinder) und folgen einer Faszien &quot;Pop&quot; oder Widerstand der Faszie als Leitfaden. </li><li> Schätzen Sie die Tiefe der Anästhesie Nadel, dann wieder das Gefühl, es mit der schmalen Skalpell und eine 4-5 mm Schnitt durch die Faszie. Die Kanüle durch den Einschnitt, bis es in den Muskel eingeführt wird. </li><li> Sammelnmehrere Proben mit dem Fenster gedreht in verschiedenen Richtungen. Bewerben Dauersog mit einem 60-ml-Spritze beim Vorrücken und Zurückziehen Muskelproben in die perkutane Nadel zwei bis vier Mal in verschiedene Richtungen. Unterbrechen Sie die Saug- und entfernen Sie die Nadel. HINWEIS: Jeder Durchlauf (Einsetzen und Entfernen der Nadel) weniger als eine Minute. </li><li> Einen Assistenten anwenden festen Druck auf Website Punktion für 5 Minuten, um eine Hämostase zu etablieren. Trennen Nadel aus Saugschlauch und entfernen Sie vorsichtig Muskelproben aus dem Fenster und Zylinder. </li></ol></li><li> Einen zweiten Durchgang, wenn mehr Muskel wird durch Wiederholen des obigen Verfahrens benötigt. </li><li> Entfernen Sie alle sichtbaren Blutgerinnseln aus der Muskelprobe mit einer Pinzette, wiegen die Probe, und sofort in ein Röhrchen mit eiskaltem DPBS platzieren. HINWEIS: Der Durchschnittsertrag mit dieser Methode ist 150 ± 20 mg. </li></ol></li></ol> 2. Mitochondriale Isolation &lt;ol&gt; <li> Frisch bereiten die Chappel-Perry (CP) und mitochondriale Assay-Lösung (MAS) Puffer (Tabelle 1) am Tag des Experiments oder aliquotieren und lagern Sie sie bei -20 ° C. Bereiten Sie die Verbindungen in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 2,5 mM und aliquote und bei -20 ° C. Verwenden Sie die bei -20 ° C innerhalb von 2 Monaten ab dem Tag der Vorbereitung gespeicherten Puffer und Verbindung Aliquots. </li><li> Sichtbare Bindegewebe aus der Probe mit einer scharfen Schere und Pinzette; Bei Bedarf Verwendung eines Binokular für diesen Schritt. Gründlich waschen Proben 3-4 mal mit eiskaltem DPBS-Puffer, um Blut zu entfernen. Bewahren Sie die Proben auf eiskaltem DPBS und Verfahren so schnell wie möglich, dabei mehr als 45 Minuten von Biopsie nicht zu überschreiten. Nehmen Sie vorsorglich sorgfältig entfernen Sie alle Sehnen oder Fettgewebe von der Muskelprobe. </li><li> Unmittelbar hacken Muskelgewebe in feine Stücke mit einer sterilen Schere und Aussetzung in 500 ul zu 1 ml enthält CPI proteinase (Nagarse) in einer Konzentration von 0,2 mg / g Gewebe. Folgen Sie dieser mit einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur und dann in Eis zu übertragen. </li><li> Homogenisieren Hackfleisch Gewebe mit Nagarse behandelt unter Verwendung eines automatischen Homogenisator. Halten Sie die Probe auf Eis während des gesamten Prozesses. Homogenisieren jeder Gewebeprobe vier Mal, jedes Mal für einen Impuls von 2 sec, unter Verwendung des automatisierten Homogenisator bei einer Geschwindigkeitseinstellung von 10.000 Upm. Waschen Sie die Sonde mit 70% Ethanol, gefolgt von destilliertem Wasser zwischen Geweben. </li><li> Mit einem gleichen Volumen von CP I (500 &amp; mgr; l bis 1 ml) und 2x Volumen CP II (1 ml bis 2 ml) waschen des homogenisierten Gewebes und sammeln sich die Inhalte in ein Zentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 600 × g, 4 ° C für 10 min. Übergeben Sie den Überstand durch ein Käsetuch benetzt, das Filtrat und entsorgen Sie den Pellet und damit die Mehrheit der nicht-mitochondriale Fraktionen zu entfernen. </li></ol> 3. Waschen der Mitochondrien <ol><li> Zentrifugieren Sie den Überstand aus dem obigen Schritt 10,000 × g, 4 ° C für 10 min. Suspendiere das Pellet in 4 ml CP-Puffer II und weitere Zentrifuge bei 10.000 × g, 4 ° C für 10 min. HINWEIS: In seltenen Fällen wird eine dünne Pellet von Blut unter der mitochondrialen Pellet geformt. In diesem Fall nehmen Sie die mitochondriale Pellet durch vorsichtiges Ansaugen mit CPII Puffer. Dieser Schritt kann durch gründliches Waschen entfernt Blut in Schritt 2 vermieden werden. </li><li> Hängen Sie das in 2 ml CP I Puffer erhaltenen Pellets. In dieser Phase mit einem kleinen Aliquot dieser Suspension für die Proteinschätzung. Resuspendieren die verbleibende Probe in CP I wie oben Puffer und Zentrifuge. Suspendiere das endgültige Pellet in einer minimalen Menge (200 ul) der mitochondrialen Assaylösung (MAS). HINWEIS: Das Protein wird in dieser Phase untersucht, da CP I Puffer keine BSA, während MAS in dem die Proben später ausgesetzt werden muss haben BSA darin. </li></ol> 4. Schätzen Sie die Mitochondrial Inhalt von Messproteinkonzentration unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Hinweis: Nutzen Sie diese Konzentration, die Menge der Mitochondrien für das Laden verwendet, auf eine 24-Well-Mikroplatten für respirometrischen Messungen oder für Western-Blot-Experimenten berechnen. Berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor (10) zur Berechnung der Proteinkonzentration. 5. Führen Sie die XF-Assays wie von Rogers, GW et al. 12 HINWEIS: Visualisieren der O 2 Verbrauchsrate (OCR) in pMol O 2 / min oder absoluten Werte von O 2 und pH-Wert in dem Datenausgang. <ol><li> Verwenden 1x MAS um Verbindungen herzustellen, die injiziert werden. Fügen Sie einen 10x Konzentration der Verbindungen auf die Ports AD, um eine Endkonzentration geben wie folgt: Anschluss A, ADP [Adenosin 5 &#39;-diphosphate, 2 mM, 50 ul]; Port B, Oligomycin (2 &amp; mgr; M, 55 &amp; mgr; l); Port C, FCCP [Carbonylcyanid 4- (Trifluormethoxy) Phenylhydrazon, 6 &amp; mgr; M 60 ul]; und Port D, 2 uM Antimycin-A (65 ul). Bereitenausreichendes Volumen von Verbindungen für die erforderliche Anzahl von Vertiefungen. </li><li> Die Ermittlung der optimalen Menge an Mitochondrien durch Titration. Zum Beispiel maximal 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug Mitochondrien pro Vertiefung in einer 50-ul-Volumen eiskaltem 1x MAS enthaltenden Substrat. Um die Variabilität zwischen den Wells zu minimieren, zunächst verdünnen 10x Mitochondrien in kaltem 1x MAS + Substrat. Anschließend liefern 50 ul dieser Suspension in jede Vertiefung (mit Ausnahme der Untergrundkorrektur Brunnen). </li><li> Zentrifugieren Sie die Platte bei 2.000 × g, 20 min bei 4 ° C. Nach dem Zentrifugieren vorsichtig mit 450 ul 1x MAS + Succinat (10 mM) und Rotenon (2 uM) (Anfangsbedingungen, siehe unten) in jede Vertiefung. Die Mitochondrien unter dem Mikroskop sehen homogene Festhalten an der auch vor der Übertragung der Platte an der XF-Analysator zu gewährleisten. HINWEIS: Die verwendeten davon ab, ob die Atmung wird entweder durch ETC-Komplex I oder komplexe II gefahren abhängt Anfangsbedingungen. Für komplexe II gesteuerte Beatmung, mit succinate (10 mM) und Rotenon (2 &amp; mgr; M) als Anfangsbedingungen. Rotenon Blöcke Komplex I und Succinat liefert Brennstoff für komplexe II (Succinatdehydrogenase). Die Atmung von Komplex I angetrieben studieren, verwenden entweder Pyruvat und Malat, jeweils bei einer Endkonzentration von 5 mM oder Glutamat und Malat jeweils bei einer Endkonzentration von 10 mM als Anfangsbedingungen. Letzteres kann bei der Unterscheidung Dysfunktion bei Tricarbonsäurezyklus und Substrat-Transport zu helfen. Atmung sowohl Komplex I und komplexe II angetrieben zu studieren, sind Pyruvat und Succinat ohne Rotenon oder Malat als Anfangsbedingungen. Verwenden Palmitoylcarnitin als ein Substrat für β-Oxidation. </li><li> Nacheinander messen die mitochondriale Atmung in Echtzeit mit Hilfe der Respirometer durch Programmierung es wie zuvor beschrieben 12. Verwenden Sie die Einstellungen für die Respirometer in Tabelle 2 bereitgestellt. HINWEIS: Eine kurze Erläuterung der verschiedenen mitochondrialen Atmung Zustände sind wie folgt: </li><li&gt; State 2 = gekoppelten Zustand mit vorhandenen Substrat; Zustand 3 = Phosphorylieren Atmung in Gegenwart sättigender ADP; Zustand 4 o = nicht-Phosphorylierung Atmung durch Oligomycin induziert; Staats 3u = maximale abgekoppelt Atmung durch den Entkoppler FCCP stimuliert; Rest nicht-mitochondriale Atmung = Atmung nach komplexen III Hemmung durch Antimycin-A. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass die Länge des OCR-Messung in Kombination mit der mitochondrialen Konzentration konnten die Angaben abbau Sauerstoff während der Messzeiträume zu beeinflussen. </li></ol> 6. Western Blot HINWEIS: Legen Sie die mitochondriale Marker COX IV und ganze Gewebe GAPDH durch Western-Blotting, um die Anreicherung von Mitochondrien in die endgültige Stichprobe zu gewährleisten <ol><li> Trenne die isolierten Mitochondrien und ganze Gewebeextrakt von 12% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelen. </li><li> Transfer der Proteine ​​auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran.</li><li> Inkubieren mit COX IV-Antikörper (1: 20.000), gefolgt von Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierten sekundären Antikörpern. Für GAPDH Bestimmung, Streifen der Blot und Sonde mit einer GAPDH monoklonalen Antikörper (1: 2000). HINWEIS: Wenn Unterschiede in der ER Kontamination von Belang sind, umfassen ER Marker wie ERp72, Calnexin, Calreticulin oder in der Analyse. </li></ol>

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	<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies:+An+update.">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10, 253-262 (2010).</li><li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells.">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods. 26, 292-297 (2002).</li><li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria.">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PloS One. 6, e18317 (2011).</li></ol>

The author, George Rogers, is an employee of Seahorse Bioscience that produces the instrument used in this article. Open Access fees were supported by Seahorse Biosciences.

Isolierten Mitochondrien werden oft in Studien, die die Rolle von ETC-Funktion, sowie andere mitochondriale Aktivitäten, einschließlich Substrattransport und TCA-Zyklus-Funktion zu untersuchen genutzt. Respirometrische Tests unter Verwendung von isolierten Organellen ermöglichen direkte Untersuchung der grundlegenden Prozesse der oxidativen Phosphorylierung und intrinsischen Eigenschaften des ETC. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien im Vergleich zu ganzen Zellen oder permeabilisierten Muskelfasern hat den Vorteil, relativ einfach die Interpretation der Daten und das Fehlen von &quot;Einmischung&quot; von nicht-mitochondrialen Prozesse oder Veränderungen im mitochondrialen Masse / Biogenese. Die Normalisierung der Daten auf der mitochondrialen Proteingehalt, wodurch einfache Quervergleich der Mitochondrien zwischen den Proben ermöglicht. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien ist eine bevorzugte Vorgehensweise, wenn das Ziel der Studie ist es, festzustellen, zu Grunde liegenden Mechanismen und die Ermittlung konkreter Ziele wie ETC Komponentes / Komplexen oder mitochondrialen Transportmechanismen. Beschrieben ist ein Protokoll zur Muskelbiopsie und Isolierung von funktionellen Mitochondrien aus kleinen Gewebeproben. Diese Methode führt zu reproduzierbaren Ergebnissen zwischen den Benutzern durch die Nutzung eines automatisierten Homogenisator gegenüber Hand bedient Dounce-Homogenisator. Isolierung von Mitochondrien können mit so wenig wie 20 mg des Muskelgewebes geführt werden. Die Menge an isolierter Mitochondrien, die aus dieser Stichprobengröße erhalten werden kann, ist ausreichend, um Seahorse Platte-basierte Respirometrie laufen, während überschüssige Mitochondrien für andere Experimente und die Lagerung für die weitere molekulare Analysen. Es sei darauf hingewiesen, dass dieses Verfahren zum XF 96, wobei auch kleinere Mengen von Mitochondrien kann verwendet werden (1-2 &amp; mgr; g pro Vertiefung) übersetzt werden kann. Mehrere Protokolle zur Isolierung von Mitochondrien setzen auf Dounce-Homogenisator für die erste Gewebezerstörung. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die praktische Art der AusgangsgewebeHomogenisierung. Die Kraft und Geschwindigkeit der Stößel im Homogenisator deutlich zwischen den Betreibern 6 variieren. Dies kann im Experiment zu Experiment Variation sowie Labor zu Labor Variation führen, und führt zu Schwierigkeiten beim Vergleich von Daten zwischen den Experimenten. Dies ist von besonderer Bedeutung in Interventionsstudien, wenn Daten von den Teilnehmern an getrennten Zeitpunkten typischerweise vor und nach der Behandlung und möglicherweise an mehreren Stellen gesammelt. Wir verwenden eine automatisierte Homogenisator für einen einheitlicheren Ansatz, der mehr reproduzierbare Ergebnisse mit begrenzten Mensch-zu-Mensch-Variante ergibt. Die Geschwindigkeit der Herstellung macht diesen Ansatz für den Umgang mit mehreren Proben gleichzeitig. Typischerweise können bis zu drei Versuche an einem einzigen Tag durchgeführt werden. Potentielle Einschränkungen der hier beschriebenen Technik ergeben sich aus der Verwendung von isolierten Organellen und der Verwendung eines plattenbasierten Format. Beispielsweise Picard et al. haben Dämonstrated dass isolierten Mitochondrien besitzen funktionellen Eigenschaften, die sich grundlegend von denen des intakten Mitochondrien in permeabilisierten Muskelfasern unterscheiden. Sie schlugen vor, dass die mitochondriale Isolationstechniken führen zu veränderten bioenergetischen Funktion, wie deutlich erhöht RCR Vergleich zu permeabilisierten Muskelfasern und verstärkte Produktion reaktiver Sauerstoffspezies 13. Im Vergleich zu permeabilisierten Muskelfasern, Isolierung von Mitochondrien ist erfordern längere Vorbereitungszeit. Auch Verlust zellulären Gehalt vermindert physiologische Relevanz, etwas, das in ganzen Zellen und sogar permeabilisiert Fasern zurückgehalten wird. Die Verwendung von Plattenbasis Respirometrie mit den beschriebenen Technik ermöglicht replizieren Läufe pro Probe. Jedoch müssen Mitochondrien zum Boden jeder Vertiefung haften. Diese Konfiguration unterscheidet sich von ihrer gewohnten Umgebung und können funktionelle Eigenschaften zu beeinflussen. Außerdem sollte beachtet werden, dass unter Verwendung dieses Protokolls für mitochondriale Isolierung there können noch Verunreinigungen von endoplasmatischen Retikulum (ER) in der mitochondrialen Präparation sein. Unterschiede in der ER eine Verunreinigung die Bestimmung der mitochondrialen Ertrag und Einfluss Ergebnisse beeinflussen. Abschließend dieser Studie präsentiert Daten, die bestätigt, dass die Mitochondrien aus Gewebe mit diesem Verfahren isoliert sind funktionell aktiv und kann für Studien / Anwendungen, die hochwertige isoliert Mitochondrien aus minimalen Skelettmuskelproben erfordern. Der Vorteil dieser Methode ist, dass: i) ist es möglich, den Mitochondrien von minimalen Mengen an Skelettmuskulatur zu isolieren, ii) das Verfahren ist schnell, iii) mit der Platte auf der Basis-Technologie ist es möglich, mehrere Proben gleichzeitig laufen, und iv) es gibt genug überschüssige Gewebe und isolierten Mitochondrien nach der bioenergetischen Test zur Probenlagerung und andere molekularbiologische Untersuchungen.

Mitochondrien sind die Primärenergieproduktionsstandorte in der Zelle und eine wichtige Rolle bei der Alterung sowie verschiedene altersbedingte Erkrankungen wie Herz-Kreislauf-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Krebs und Fettleibigkeit. Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien bietet direkte Analyse der Elektronentransportkette (ETC) Funktion und hat wesentlich zu unserem Verständnis der mitochondrialen Biologie und ihre Rolle in Gesundheit und Krankheit beigetragen. Isolierten Mitochondrien werden verwendet, um verschiedene Aspekte des bioenergetischen dergleichen Substrattransport, ATP-Synthase-Aktivität, Protonenleck usw. Die in diesem Manuskript beschriebenen Methodik wurde optimiert, um respirometrischen Analyse von Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe Biopsien aus humanen Probanden isoliert ermöglichen studieren. Die in dieser Handschrift beschrieben Biopsie-Protokoll wurde von unseren Mitarbeitern für die letzten 12 Jahre genutzt. Unsere Gruppe hat über 700 Verfahren durchgeführt bei Erwachsenen unterschiedlichen Alters,bis zu 90 Jahre alt, und mit verschiedenen chronischen Krankheitszuständen ohne nachteilige Sicherheitsfragen. Ein wichtiger Aspekt dieses Protokolls ist, dass es speziell für die minimale Mengen von Gewebe zu verwenden, wodurch ihre Verwendung in klinischen Studien erleichtert. Verschiedene Protokolle zur Isolierung von Mitochondrien entwickelt. Fernandez-Vizarra et al. 1,2 beschrieben, ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus verschiedenen Rattengeweben sowie kultivierte Zellen. Garcia-Cazarin et al. 3 haben ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskeln von Ratten und Mäusen berichtet. Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus Rattenhirn wurde auch von Iglesias-Gonzales et al. 4 Gross berichtet, et al. 5 über ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien mit der barocycler und / oder der PCT Schredder. Kürzlich Franko et al. 6 über ein Verfahren zur Isolierung von hochangereichertem Mitochondrien mit Anti-TOM22 Magnetischen Kügelchen. Während diese Protokolle liefern hervorragende Ergebnisse sind Gewebe Größenanforderungen hoch im Vergleich zu dem in dieser Handschrift beschriebenen Methode. Zum Beispiel, Gross et al. 5 verwendet 1,5-1,8 g des M. gastrocnemius und etwa 2 g des Nierengewebes. Ebenso Franco et al. 6 verwendet 500 mg Mauslebergewebe. Aus unserer Erfahrung, typische Ausbeuten von perkutanen Nadelbiopsie der Skelettmuskulatur (Vastus lateralis) erwarten reichen von 100 bis 200 mg. Die Fähigkeit, die Funktion der Mitochondrien in 20 bis 50 mg mit der hier beschriebenen Protokoll Muskelgewebe zu bewerten ermöglicht Benutzern, mehrere Assessments pro Biopsie und zur Lagerung von Proben für die spätere Verwendung in anderen molekularbiologische Experimente durchführen. Dies ist ein entscheidendes Merkmal in der klinischen Forschung und anderen Studien, die sorgfältige Verwendung von Proben erfordern. Es sei darauf hingewiesen, dass die zuvor eingefroren Mitochondrien sind nicht gut für die Untersuchung gekoppelt Atmung aufgrund oute werdenr Mitochondrienmembran Beschädigung und Verlust von Cytochrom-C-Aktivität. Unsere Methode wurde angepasst und von der von Chappell und Perry 7 veröffentlichte Methode modifiziert. Mit den in dieser Handschrift beschriebenen Methoden, haben wir vor kurzem berichtet, dass die respirometrischen Profil von Mitochondrien aus menschlichen Vastus lateralis isoliert ist direkt mit Behinderung, gemessen als Gehgeschwindigkeit 8 korreliert.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer Bio-Gen PRO200</td><td>BioExpress</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5804 R</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deepwell late Rotor&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 mm University College Hospital Needle</td><td>Cadence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 cc syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plate reader</td><td>Tecan (Genios-basic)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 24-3 analyzer</td><td>Seahorse Biosciences, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protein gel system</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak Gel Logic 112</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kodak camera assembly</td><td>Carestream Health, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XF24 V7 Cell Culture Microplate and XF24 sensor cartridge</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>100867-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide (KOH)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Acros</td><td>12421-0010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate buffered saline&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP308</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Fatty acid-free BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126575</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial proteinase</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P-8038</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>PI23227</td><td></td></tr><tr><td>Succinic Acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Malic acid*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>2288</td><td></td></tr><tr><td>ADP(K&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; salt)*</td><td>Sigma-Aldrich Co</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>XF Cell mito stress test kit</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>101706</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.&amp;nbsp;</td><td>SC-29113</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 12% Bis-Tris Gel</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0343BOX</td><td></td></tr><tr><td>Immobilin Transfer Membranes (0.45 um)</td><td>Millipore</td><td>IPVH20200</td><td></td></tr><tr><td>MOPS SDS Running Buffer (20X)-500 ml</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Transfer Buffer (20X)-1 liter</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>NP0006-1</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to VDAC1/Porin)</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies (mAB to GAPDH)</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF822E001EA</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (Goat), HRP-labeled</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF812E001EA</td><td></td></tr><tr><td>*ADP, succinic acid, pyruvic acid, and malic acid should be adjusted to pH 7.4 with KOH only&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy

Respirometrische Profilierung von isolierten Mitochondrien wird allgemein zur Atmungskette Funktion zu untersuchen. Wir beschreiben eine Methode zur Gewinnung von Proben menschlichen Vastus lateralis, Isolierung von Mitochondrien minimale Mengen an Skelettmuskelgewebe und Platte basiert respirometrischen Profilerstellung mit einer extrazellulären Fluss (XF) Analysator. Vergleichs respirometrischer Profile erhalten unter Verwendung von 1,0, 2,5 und 5,0 ug Mitochondrien zeigen, daß 1,0 ug ausreichend ist, um die Atmung zu messen, und daß 5,0 ug liefert konstante Ergebnisse basierend auf dem Vergleich der Standardfehler. Western-Blot-Analyse der isolierten Mitochondrien für mitochondriale Marker COX IV und nicht-mitochondrialen Gewebemarker GAPDH darauf hin, dass es nur begrenzte nicht-mitochondrialen Kontamination mit diesem Protokoll. Die Fähigkeit, mitochondriale respirometry in so wenig wie 20 mg des Muskelgewebes studieren ermöglicht Benutzern individuelle Biopsien mehrerer Endpunkte der Studie wurden in der klinischen NutzungForschungsprojekte.

1 zeigt ein detailliertes Flußdiagramm des gesamten Protokolls. Western-Blot-Profile von COX IV / GAPDH (Figur 2) zeigen die Expression des mitochondrialen Protein, COX IV, und der nicht-mitochondriale Marker GAPDH. Expression sowohl COX IV und GAPDH in der Gesamtmuskel Lysat evident. Nach Mitochondrien werden mit dem in diesem Protokoll beschriebenen Technik isoliert sind COX IV Bands immer noch deutlich während GAPDH abwesend gleichzeitig Belichtung. Längere Einwirkung kann ein schwaches GAPDH Band offenbaren. Diese Flecken zeigen, dass die isolierten Mitochondrien haben minimale nicht-mitochondrialen Kontamination. Darüber hinaus ist COX IV-Expression in isolierten Mitochondrien Einklang zwischen den Proben. Abbildung 3 zeigt typische respirometrischen Profile durch komplexe II (Succinat und Rotenon) angetrieben mit 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug Mitochondrien. Wie erwartet, ist die allgemeine OCR w erhöhtith höhere Mengen an Mitochondrien. Die berechnete respiratorische Steuerungsverhältnis (RCR) für diesen Assay ist 7,95, was anzeigt, dass die mitochondriale Zubereitung ist von hoher Qualität. Weiterhin ist Zustand 3u OCR etwas höher als die der Zustand 3, bestätigt mitochondrialen Qualität. Um die Konsistenz der Ergebnisse zu vergleichen, wenn Profiling unterschiedliche Mengen an Mitochondrien, führten wir ANOVA (Varianzanalyse) und berechnet die Summe der Quadrate (SS) als Ist-Werte der Varianz mit 1,0 ug, 2,5 ug und 5,0 ug pro Mitochondrien geladen und (4). SS ist für Zustand 2 Zustand 3 Zustand 3u, Antimycin A und RCR vorgestellt. Für den Zustand 2 und Zustand 3 Messungen, war einer ANOVA statistisch signifikant (p &lt;0,01 bzw. p &lt;0,05). Ebenso war die Einweg-ANOVA statistisch signifikant für Antimycin und RCR (p &lt;0,01 und p &lt;0,0001 auf. War kein signifikanter Unterschied für staatliche 3u zwischen den Gruppen zu sehen. These Ergebnisse zeigen, dass 5,0 &amp; mgr; g der Mitochondrien pro Vertiefung gab die niedrigste SS im Vergleich zu anderen Konzentrationen und ist der optimale Betrag in der XF 24-System mit unserer Bevölkerung der Teilnehmer zu verwenden. Figur 5 dient als eine Führung, um anzuzeigen, wie viel mitochondrialen Protein, bezogen auf das ursprüngliche Muskelprobengröße erwarten. Wie erwartet gibt es eine starke Korrelation zwischen dem Ausmaß der Muskel (mg) verarbeitet und die Gesamt mitochondriale Proteingehalt (mg) der Endprobe. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry-Puffer I (CPI) </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 1 mM </td></tr&gt; <tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Chappel-Perry-Puffer II (CPII) </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> 50 mM </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> ATP </td><td> 0,2 mM </td></tr><tr><td> Fettsäurefrei BSA </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondrial Assaylösung (MAS) (2X) </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 35 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> 110 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2,5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1,0 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Fettsäurefrei BSA </td><td> 0,10% </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Assay-Lösung (MAS) mit komplexen II Anfangsbedingungen </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Bernsteinsäure- </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Rotenon </td><td> 2 &amp; mgr; M </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Mitochondriale Assay-Lösung (MAS) mit Komplex I Anfangsbedingungen </td></tr><tr><td> Chemikalie </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> 1X MAS </td><td></td></tr><tr><td> Pyruvat</td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Malate </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH </td><td> 7.4 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Alle Puffer in entionisiertem Wasser hergestellt werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1 Lösung und Puffer Rezepte. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"> Protokoll Schritte </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> StartProtocol </td></tr><tr><td> Befehl </td><td> Zeit (min) </td><td> Port </td></tr><tr><td> Kalibrieren </td><td> 0.00 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 10,00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Warten Sie </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 0.50 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> A </td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 6.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr<html> &gt; <tr><td> Maßnahme </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Injizieren </td><td></td><td> D </td></tr><tr><td> Mischen </td><td> 1.00 </td><td></td></tr><tr><td> Maßnahme </td><td> 3.00 </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> EndProtocol </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Mix, messen und mischen Zyklus Einstellung für die Respirometer. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Flussdiagramm des gesamten Protokoll. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52350/52350fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> /ftp_upload/52350/52350fig2highres.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Eine repräsentative Western-Blot für ganze Skelettmuskelgewebe sowie isolierten Mitochondrien. Whole Gewebeextrakt sowie isolierte Mitochondrien wurden mit COX IV Antikörper als mitochondrialen Marker und GAPDH-Antikörper für nicht mitochondrialen Kontroll immungeblottet. Kein GAPDH Band wurde in der isolierten Mitochondrien beobachtet, was wenig oder keine Verunreinigungen von nicht-mitochondrialen Quellen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52350/52350fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative respirometrischen Profil von Mitochondrien aus menschlichen Vastus lateralis isoliert. Drei Konzentrationen von isolierten Mitochondrien, 5,0 ug, 2,5 ug und 1,0 ug wir<html> Re in diesem Assay verwendet. Endkonzentrationen der Verbindungen nach Port-Injektionen waren 2 mM ADP (Anschluss A); 2 uM Oligomycin (Port B); 6 uM FCCP (Port C); und 2 uM Antimycin A (Port D). Berechnete RCR für diesen Lauf war 7.95. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52350/52350fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52350/52350fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Summe der Quadrate. Summe der Quadrate für die verschiedenen mitochondrialen Atmung Staaten und RCR unter Verwendung von 5,0 &amp; mgr; g, 2,5 ug und 1,0 ug Mitochondrien. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52350/52350fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> ig5highres.jpg &quot;/&gt; Figur 5. Dies kann als eine Führung verwendet, um die Menge des mitochondrialen Protein, bezogen auf das ursprüngliche Muskel Einwaage Regressionsanalyse erwartenden abzuschätzen:. Der Menge des Muskels (mg) und die gesamten mitochondrialen Proteingehalt (mg). Wie erwartet gibt es eine direkte positive Korrelation zwischen der Menge des Muskels und der Gesamt mitochondrialen Protein erhalten.

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Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung.

Vorbereitung und Respirometrische Bewertung der Mitochondrien isoliert aus dem Skelettmuskelgewebe durch perkutane Nadelbiopsie Erhalten

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

19.5K Aufrufe.  Wake Forest School of Medicine.  Verfahren zur Biopsie des Vastus lateralis, Herstellung von gereinigtem Mitochondrien und respirometrischen Profiling beschrieben. Die Verwendung von kleinen Muskelvolumen macht diese Technik für klinische Forschung. 

Serie: Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-mechanischen Analyse von isolierten Skelettmuskel

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Forschung

Medizin

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of mitochondrial function in this tissue has become more prevalent. Although many technologies and assays exist that measure mitochondrial respiratory pathways in a variety of cells, tissue and species, there is currently a void in the literature in regards to the compilation of these assays using isolated mitochondria from mouse skeletal muscle for use in microplate based technologies. Importantly, the use of microplate based respirometric assays is growing among mitochondrial biologists as it allows for high throughput measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. Therefore, a collection of microplate based respirometric assays were developed that are able to assess mechanistic changes/adaptations in oxygen consumption in a commonly used animal model. The methods presented herein provide step-by-step instructions to perform these assays with an optimal amount of mitochondrial protein and reagents, and high precision as evidenced by the minimal variance across the dynamic range of each assay.

The methods presented provide step-by-step instructions for the performance of a collection of microplate based respirometric assays using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle. These assays are able to measure mechanistic changes/adaptations in mitochondrial oxygen consumption in a commonly used animal model.

Verwendung von isolierten Mitochondrien aus minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Entwicklungsbiologie

Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Skeletal Muscle Gender Dimorphismus von Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Biologie

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Isolation of Intact Mitochondria von Skeletal Muscle durch differentielle Zentrifugation für hochauflösende Messungen Respirationstest

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

High-Resolution Fluoro-Respirometry of Equine Skeletal Muscle

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring mitochondrial function is fundamental in biomedical research. Skeletal muscle is a robust source of mitochondria, particularly in animals with a very high aerobic capacity, such as horses, making them ideal subjects for studying mitochondrial physiology. This article demonstrates the use of high-resolution respirometry with concurrent fluorometry, with freshly harvested skeletal muscle mitochondria, to quantify the capacity to oxidize substrates under different mitochondrial states and determine the relative capacities of distinct elements of mitochondrial respiration. Tetramethylrhodamine methylester is used to demonstrate the production of mitochondrial membrane potential resulting from substrate oxidation, including calculation of the relative efficiency of the mitochondria by calculating the relative membrane potential generated per unit of concurrent oxygen flux. The conversion of ADP to ATP results in a change in the concentration of magnesium in the reaction chamber, due to differing affinities of the adenylates for magnesium. Therefore, magnesium green can be used to measure the rate of ATP synthesis, allowing the further calculation of the oxidative phosphorylation efficiency (ratio of phosphorylation to oxidation [P/O]). Finally, the use of Amplex UltraRed, which produces a fluorescent product (resorufin) when combined with hydrogen peroxide, allows the quantification of reactive oxygen species production during mitochondrial respiration, as well as the relationship between ROS production and concurrent respiration. These techniques allow the robust quantification of mitochondrial physiology under a variety of different simulated conditions, thus shedding light on the contribution of this critical cellular component to both health and disease.

Horses have an exceptional aerobic exercise capacity, making equine skeletal muscle an important tissue for both the study of equine exercise physiology as well as mammalian mitochondrial physiology. This article describes techniques for the comprehensive assessment of mitochondrial function in equine skeletal muscle.

Hochauflösende Fluoro-Respirometrie der Skelettmuskulatur von Pferden

Mitochondrial function-oxidative phosphorylation and the generation of reactive oxygen species-is critical in both health and disease. Thus, measuring ...

<meta charset="utf8"></head><body>Echtzeit-Quantifizierung der mitochondrialen Atmung in Muskelfasern

Measurement of Mitochondrial Respiration in Human and Mouse Skeletal Muscle Fibers by High-Resolution Respirometry

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle is linked to prevalent metabolic disorders (e.g., diabetes and obesity), muscular dystrophies, and sarcopenia. While there are many techniques to evaluate mitochondrial content and morphology, the hallmark method to assess mitochondrial function is the measurement of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) by respirometry. Quantification of mitochondrial OXPHOS provides insight into the efficiency of mitochondrial oxidative energy production and cellular bioenergetics. A high-resolution respirometer provides highly sensitive, robust measurements of mitochondrial OXPHOS in permeabilized muscle fibers by measuring real-time changes in mitochondrial oxygen consumption rate. The use of permeabilized muscle fibers, as opposed to isolated mitochondria, preserves mitochondrial networks, maintains mitochondrial membrane integrity, and ultimately allows for more physiologically relevant measurements. This system also allows for the measurement of fuel preference and metabolic flexibility - dynamic aspects of muscle energy metabolism. Here, we provide a comprehensive guide for mitochondrial OXPHOS measurements in human and mouse skeletal muscle fibers using a high-resolution respirometer. Skeletal muscle groups are composed of different fiber types that vary in their mitochondrial fuel preference and bioenergetics. Using a high-resolution respirometer, we describe methods for evaluating both aerobic glycolytic and fatty acid substrates to assess fuel preference and metabolic flexibility in a fiber-type-dependent manner. The protocol is versatile and applicable to both human and rodent muscle fibers. The goal is to enhance the reproducibility and accuracy of mitochondrial function assessments, which will improve our understanding of an organelle important to muscle health.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Enthüllung der mitochondrialen Funktion und der zellulären metabolischen Anpassung bei Stoffwechselerkrankungen

Here, we describe a comprehensive method for measuring mitochondrial oxidative phosphorylation in fresh permeabilized skeletal muscle fibers from either human or mouse muscle. This method allows for the real-time quantification of mitochondrial respiration and the assessment of fuel preference and metabolic flexibility while preserving existing mitochondrial networks and membrane integrity.

Messung der mitochondrialen Atmung in Skelettmuskelfasern von Mensch und Maus mittels hochauflösender Respirometrie

Mitochondrial function, a cornerstone of cellular energy production, is critical for maintaining metabolic homeostasis. Its dysfunction in skeletal muscle ...