Name: intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
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The authors are grateful for the support from the Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller and Jennifer Kraenzle) and Microbiology (Daniel Cramer and Julie Sotsky) Core Facilities. This work was supported by funding from the NIH (HHSN272201000033I to M.B.L and J.M.W.).

HINWEIS: Alle hier beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von der University of Louisville Institutional Biosafety Committee (Protokoll # 13-056) und Institutional Animal Care und Use Committee (Protokoll # 13-064) zugelassen. 1. Herstellung der Farbstoff <ol><li> Verdünnter 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS und filtersterilisieren Verwendung eines 0,45 um-Spritzenfilter. </li></ol> 2. Herstellung von Pseudomonas aeruginosa Kultur <ol><li> 15 Stunden vor dem Einträufeln, impfen 3 ml Kulturbrühe mit einem einzigen Bakterienkolonie. </li><li> Die Kultur 15 h bei 37 ° C auf einem Schüttler (200 rpm). </li><li> Zentrifuge 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen 12.000 × g für 30 sec. </li><li> Entfernen des Mediums und Resuspendieren des Pellets in 1 ml PBS. </li><li> Einen aliquoten des bakteriellen Stoffsuspension 1:10 in PBS und messen die OD 600 der verdünnten Bakteriensuspension auf die BestimmungBakterienkonzentration. </li><li> Verdünnen der Bakterienstammsuspension in PBS auf die gewünschte Konzentration der bakteriellen Impfkultur, mit einem Fördervolumen von 50 &amp; mgr; l für IMIT Inokulation. </li></ol> 3. IMIT Instillation <ol><li> Legen Sie eine Gruppe von Mäusen in Isofluran-Narkose Induktionskammer und betäuben mit einer 2 - 3% Isofluran / Sauerstoff-Gemisch. </li><li> Beim ersten Auftreten von Sedierung, scruff die Maus, die Maus aufrecht, und verwalten 10 ul einer 2% Lidocain-Lösung durch Sondennadel an der Rückseite des Halses und damit die Lösung auf der Epiglottis zu entleeren. Liefert die Maus an den Anästhesieraum. <ol><li> Warten Sie mindestens 5 Minuten, um das Lidocain erlauben volle Wirkung als Lokalanästhetikum zu nehmen. </li></ol></li><li> Bei Mäusen gewünschte Niveau der Sedierung erreicht (Atemgeschwindigkeit von ~ 60 min) und der Verringerung der Isofluran zu 2% bis Sedierung zu erhalten. </li><li> Preload Farbstoff oder Bakterieninokulum in einen 250 ul gasdichtePräzisionsspritze fit mit einem 22 G lange stumpfe Nadel. <ol><li> Zunächst erarbeiten 150 l Luft, durch die Teflon Kolben der Spritze gemessen. Als nächstes erstellen 50 ul Inokulum durch Vorschieben des Teflon Kolben aus der 150 ul Marke, die dem 200 ul Markierung auf dem Spritzenkörper. HINWEIS: Wenn die Probe in einem intubierten Maus ausgestoßen wird, wird das 50 &amp; mgr; l Suspension zuerst durch ein 150 &amp; mgr; Luftkissen, das Inokulum in der gesamten Lunge verteilt werden geliefert, gefolgt. </li></ol></li><li> Entfernen Sie eine Maus aus der Induktionskammer und lag auf dem Rücken auf einer Intubation Plattform. Sichern Sie die Maus auf die Plattform durch Einhaken seine Schneidezähne mit einem O-Ring, um Klettband befestigt und das Klettband befestigen an der Plattform. Heben Sie die Maus auf eine 45 ° Neigung. </li><li> Mit Hilfe eines Mikro Baumwolle Applikator, zurückzuziehen die Zunge mit einer rollenden Bewegung, mit der dominanten Hand. </li><li> Mit der nicht-dominanten Hand, verwenden Sie ein Operations-Otoskop fit mit einer Intubation Trichter sowohl maintain Zungenretraktion und Visualisierung der Stimmritze. </li><li> Mit der dominanten Hand, verwenden Sie ein Führungsdraht durch eine 20 G-Katheter eingeschraubt, um die Maus zu intubieren, Sitz den Katheter auf eine 10 mm Tiefe in die Maus Trachea (Katheter ist fit mit einer Silikonmanschette mit 10 mm der Katheter). Entfernen Sie das Otoskop / Spekula. </li><li> Bestätigen Sie, dass die Maus wurde korrekt durch die Sicherung der Katheter mit dem dominanten Hand, während kurz Anbringen eines Luer angeschlossenen Länge 1/16 &quot;durchsichtigen Schlauch enthält einen Farbstoff intubiert. HINWEIS: Der Farbstoff wird schnell hin und her wandern in Reaktion auf die Atmung. </li><li> Nicht mit den nachfolgenden Schritten fort, wenn eine Bestätigung der Intubation hat an dieser Stelle nicht etabliert. Wenn die Intubation fehlgeschlagen versuchten Zurücksetzen der Katheter und Führungsdraht für einen zusätzlichen Versuch Intubation. HINWEIS: Es ist nicht ratsam, mehr als zwei intubations einer Maus in einer Sitzung ohne Trauma der Maus versuchen. </li><li> Weitersichern Sie den Katheter mit dem dominanten Hand, während Sie den Präzisionsspritze / stumpfe Nadel, die die flüssige Suspension / Luftpolster. </li><li> Abgeben der Flüssigkeit / Luft direkt in die Lunge in einer einzigen fließenden Bewegung und entfernen Sie sofort die Nadel / Katheter von der Maus. </li><li> Liefert die Maus an einen Käfig und eine Wiederherstellung aus der Narkose. </li></ol> 4. Charakterisierung von IMT Liefer <ol><li> Nach IMIT Einträufeln einschläfern die Maus durch CO 2 Asphyxie zu einem geeigneten Zeitpunkt nach der Inokulation. </li><li> Sichern Sie die eingeschläfert Maus auf eine Dissektion Bord und genießen Sie die Brust und Bauch mit 70% EtOH mit Spritzflasche. </li><li> Wenn die Bewertung Verteilung eines Bildgebungsmittel in der gesamten Lunge, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik und zeigt die Lunge als angemessen für die Bildgebung. HINWEIS:. Lungs können für zusätzliche histologische Färbetechniken durch geeignete Fixierung oder Kryokonservierung vorbereitet werden &lt;/ Li&gt; <li> Wenn die Beurteilung der bakteriellen Belastung von infizierten Lungengewebe, entfernen Sie die Lunge aus dem Tier mit steriler Technik. Platz Lunge in eine sterile, vorgewogen 1 Unze Probenbeutel. Weigh und nimmt das Gewicht des Probenbeutel + Lunge. <ol><li> 1 ml sterilem 1x PBS zu jeder Probe bag + Gewebe. Reseal Probenbeutel. </li><li> Homogenisieren Geweben durch sanftes Rollen einer 25 ml serologische Pipette über dem Probenbeutel + Gewebe. </li><li> Generieren serielle Verdünnungen des Lungenhomogenat in sterilem PBS und Teller auf Agar-Platte (LB, oder gegebenenfalls an die Bakterienarten untersucht): <ol><li> Führen Sie eine sechsfache serielle Verdünnung in einem U-Boden 96 Well-Platte mit Mehrkanalpipette dann Platte dreifachen Proben von Mehrkanal auf der Agarplatte. </li></ol></li><li> Inkubieren Agarplatten über Nacht bei 37 ° C und aufzuzählen koloniebildenden Einheiten des nächsten Tages. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

IMIT Einträufeln bietet wichtige Verbesserungen an bestehenden Modellen Atemwegserkrankungen in der Fähigkeit, reproduzierbar einzuflößen Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle Annäherung, die ideal für ein Team von zwei Forschern, von denen man es schafft die Logistik der Anästhesie und Käfighaltung liegt, und die andere, die das IMIT Technik führt. 3 min pro Maus - Große Studien können unter Verwendung IMIT mit einem durchschnittlichen Zeitaufwand von 2 durchgeführt werden. Da der Ansatz nutzt Isofluran als Anästhetikum, Mäuse erholen sich rasch aus der Narkose, die Verringerung der Haltungszeit der Überwachung Tiere durch Erholung. Die technisch schwierigste Aspekt der IMIT Verfahren ist der erste Schritt der Intubation Mäusen. Menschen lernen IMIT auszuführen in der Lage sind, auf diesem ersten Schritt der Platzierung des Katheters und die Gewährleistung, dass die Intubation wurde durch die visuelle Bestätigung der Farbstoffbewegung erreicht konzentrieren. Der Vorteil des Ansatzes ist, dass Lungen-specific Einträufeln wird durch die Verwendung der Bestätigung der Intubation, die das Vertrauen sowohl der neue Forscher sowie der Experte versucht den schwierigen Tier intubieren erhöht garantiert. Die wichtigsten Elemente der Optimierung der Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation sind: i) Erreichung einer tiefen Sedierung, genügend Arbeitszeit zu ermöglichen, ii) die korrekte Platzierung des Trichtern in den Mund, um eine gute Visualisierung des Kehldeckels ermöglichen, iii) gute Tiefe Platzierung der Trichter, so daß die Zunge bleibt während des Verfahrens zurückgezogen wird, und iv) die Verwendung der Kipp-Plattform, um die Hände des Forschers zu unterstützen, so dass das Verfahren entspannt und mit einem stetigen Ansatz durchgeführt. Eine der Einschränkungen des IMIT Verfahren wird auf die Frequenz des IMIT Instillation Ereignissen. Aufgrund der möglichen Trauma mit einer verpassten Intubation verbunden sind, ist es nicht empfehlenswert, dass mehr als zwei Intubationsbemühungen (bis zu zwei Fehlschüsse) in einer einzigen Sitzung durchgeführt werden. IMIThat ein ausgezeichnetes Potenzial in seiner Fähigkeit verwendet werden, um Therapeutika in das murine Lungen liefern kann jedoch Therapieschemata, die Verwendung von sehr häufige Abgabe von Reagenz in die Lunge zu nicht geeignet für IMIT sein. Es ist möglich, dass IMIT konnte täglich verwendet, um Reagenzien in eine murine Lungen ohne bedeutende Trauma zu liefern, aber nur, wenn sie durch einen hochqualifizierten Forscher durchgeführt, da die Mehrheit der Trauma Intubation assoziiert ist gedacht, um mit einem verpassten Intubation Ereignis zugeordnet werden . Solche Hochfrequenz IMIT sollte mit lokalen Tierärzten und IACUC diskutiert werden. Eine zusätzliche Einschränkung des potentiellen IMIT ist die Größe der Maus, wobei intubiert wird. 22 g, bei einer 20-g-Katheter wurde gefunden, daß eine geeignete Größe für die Luftröhre von Mäusen in diesem Größenbereich sind - das oben beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung IMIT Mäusen von etwa 17 entwickelt. Größere Kathetern wurden erfolgreich in älteren Mäusen verwendet; die anfängliche Entwicklung von IMIT made Verwendung einer 18 G-Katheter in BALB / c-Mäusen, die&gt; 20 g sind. Wichtig ist, dass, wenn alternative Kathetergrößen verwendet werden, sollten stumpfen Nadeln stammen, welche das Lumen des Katheters zu passen und mit einer Länge, die gerade über die Katheterspitze 1 mm erstreckt getrimmt werden. Intubation von Mäusen kleiner als 17 g ist möglich, wird aber nicht durch die erforderliche Fachwissen empfohlen und würde die Verwendung von kleineren Kathetern und Spekula als oben beschrieben erforderlich. Wir haben IMIT für die Lieferung von mehreren Atemwegspathogene neben P. verwendet aeruginosa, einschließlich B. pseudomallei 9 und Klebsiella pneumoniae 10. Die IMIT Modell hat wichtige Fortschritte in unseren Studien von B. gemacht pseudomallei Atemwegserkrankungen, nachdem festgestellt, dass die intranasale Impfung bewirkt eine frühe, URT-Morbidität von Mäusen statt der systemischen Erkrankung Endpunkt in menschlichen Erkrankungen 9 beobachtet. B. pseudomallei ist ein Tier 1 Select Agent der Abwehr von Biowaffen Auswirkungen, und als solche, Modelle Atemwegserkrankungen werden für Aerosolexposition entwickelt, welche Modelle ein potenzieller Biodefense bezogenen Route der Eintrag für waffenKrankheitsErreger. Da aktuelle Aerosolmodelle führen zu Infektion sowohl der URT und LRT, das gleiche Potential früh Morbidität Phänotypen haben wir für die intranasale Modell von B. identifiziert pseudomallei Atemwegserkrankung kann dem Aerosol Modell anzuwenden. Eine zukünftige Anpassung der IMIT Modells könnte eine Intubation vermittelte Aerosolabgabe (IMAD), in dem Mäuse werden für die Zielaerosolabgabe nur in die Lunge intubiert werden. Mechanische Ventilatoren derzeit zur Verfügung stehen Isofluran-Narkose, die angepasst werden kann, um eine aerosolierten, anstatt auf Flüssigkeitsbasis, Erreger Herausforderung liefern zu halten. IMIT wurde zunächst als ein Ansatz entwickelt, um die Abgabe von Bakterien in der Lunge zu optimieren, sondern findet auch Anwendung für die Lieferung von anderen Reagenzien in der Mäuselunge. Als disoben diskutiert, intranasale Verabreichung von Verbindungen in Mäuse führt zu einer geringen Effizienz, sehr variable Lieferung von Reagenzien in das Zielorgan Lunge. Intranasale Verabreichung von Positronen-Emissions-Tomographie (PET) Bildgebung Reagenzien zu der Mäuselunge ergab eine 40% Liefereffizienz 11, während wir haben gezeigt, dass IMIT bietet eine hervorragende Alternative zu anderen Lungenliefer nähert mit&gt; 98% Liefer Wirksamkeit und multilobäre Verteilung. Diese Verbesserung in der zielgerichteten Abgabe an die Lunge hat das Potential, die Reproduzierbarkeit der therapeutischen Abgabe zur Behandlung von Lungenerkrankungen. IMIT könnte ähnlich Vorteile anbieten, um Studien über: i) die Auswirkungen von Umweltlungenreizstoffe, ii) Lungenkrebs phänotypische Studien, iii) lungenspezifischen siRNA knock-down.

Mäusen wurden verwendet, um zahlreiche menschliche Krankheitserscheinungen, einschließlich einer Vielzahl von Erkrankungen der Atemwege zu modellieren. Surrogatkrankheitsmodelle sind häufig nicht in der Lage, alle Aspekte eines modellierten Erkrankung rekapitulieren, typischerweise aufgrund von wichtigen physiologischen oder Immun Unterschiede in den beiden Aufnahmemodelle. Somit ist ein Ziel der Verbesserung der Modellsysteme, um Ansätze, die Surrogate, enger spiegeln einen Krankheitsprozess oder Gastgeber Antwort als in der ursprünglichen Host-System beobachtet ermöglichen zu entwickeln. Es gibt mehrere wichtige physiologische Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen in der Mechanismus, durch den sie Luft zu begeistern. In diesen Unterschieden gehören bedeutende ratiometrische Größenunterschiede zwischen den URT und LRT. Es wurde geschätzt, dass Mäuse besitzen&gt; 100 die URT Fläche bezogen auf den Menschen, normalisiert gegen totale Lungenkapazität 1,2 falten. Somit werden die Nasenmuscheln der Maus ermöglichen eine umfangreiche Filterung von eingeatmeten Luft, um eine viel größere Geschwindigkeit von breathi erleichternng, die einen erheblichen Einfluss auf Untersuchungen der Lungenentzündung aufweisen kann, wenn eine Infektion der Nasenhöhle spielt eine bedeutende Rolle bei der Progression der Erkrankung. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um Bakterien in den Lungen von Mäusen vermitteln, um menschenähnliche Atemwegserkrankungen zu untersuchen. Die häufigste dieser Ansätze ist die intranasale Impfung, bei dem eine flüssige Suspension wird auf einer oder beiden Nasenlöchern einer Maus aufgetragen. Während relativ einfach, Vorbehalte wie Einträufeln Volumen und Art der Anästhesie verwendet wird, kann die Effizienz der Instillation über intranasale Impfung 3-5 in die LRT auswirken. Insbesondere Miller et al. haben gezeigt, dass die intranasale Applikation von Francisella tularensis in Mengen von weniger als 50 &amp; mgr; l nicht in dem Einträufeln der Bakterien führen in die LRT 6 gezeigt. Sie weiterhin beobachtet besser LRT Instillation bei Verwendung inhalativen Isofluran im Gegensatz zu injiziert Ketamin / Xylazin für Anästhesie. Aber unsere experience mit Yersinia pestis intranasale Impfung zeigt konsequenter Impfung kann mit Ketamin / Xylazin erreicht im Vergleich zu Isofluran (MBL, unveröffentlichte Daten) werden. Diese Unterschiede könnten zurückzuführen verwendet Erreger oder bei Laborverfahren Vielfalt, aber wichtiger ist unterstreichen das Potenzial Variabilität in dieser Technik. Weiterhin Lungen kurz nach intranasaler Instillation zeigen, daß ein relativ geringer Prozentsatz der ursprünglichen bakteriellen Inokulums die Lunge erreicht geerntet (in dem Fall von Y. pestis, wurden nur 10% zurückgewonnen 1 h nach der Instillation 7), was darauf hindeutet, dass eine große Anzahl von Bakterien konnte in der URT beibehalten werden (oder in den GI-Trakt Verschlucken). In bestimmten Krankheitsmodellen kann dies signifikante Ablagerung von Bakterien auf der Schleimhaut URT unser Verständnis des Fortschreitens der Krankheit zu verwechseln, wenn der Organismus in der Lage, die Kolonisierung der murine Nasenhöhle in einer Weise, die dem menschlichen Krankheit ist. Zum Beispiel unter Verwendung von in vivo &lt;/ Em&gt; Bildgebung, wurde beobachtet, dass Burkholderia pseudomallei, die den menschlichen URT nicht besiedeln wird, bewirkt eine überwiegende opportunistische Infektion der Nasenhöhle, wenn murine die intranasale Instillation Methode 8 geliefert. Andere Verfahren zum Einträufeln Bakterien in den Lungen der Mäuse wurden auch in Infektionsforschung eingesetzt. Im Vergleich zu intranasale Instillation diese Methoden neigen jedoch dazu, mehr technisches Know-how und / oder teure Ausrüstung, ohne die Beseitigung der Potenzial für Infektion Einleitung an mehreren Standorten (zB Aerosol [URT und LRT] erfordern; transorale [Verdauungstrakt und LRT]; und chirurgische intratracheale [LRT und Blutstrom]). Angesichts der möglichen Komplikationen, die mit sekundären Standorten der Infektion in Verbindung gebracht werden konnte, haben wir versucht, eine intratracheale Ansatz, der die URT umgeht und liefert Erreger direkt in die Lunge von betäubten Mäusen zu entwickeln, sondern begrenzt auch unbeabsichtigte inoculatIon in den Blutstrom oder GI-Trakt. Zu diesem Zweck wurde Intubation vermittelte intratracheal (IMIT) Instillation als nicht-chirurgischen Verfahren, LRT Instillation Inokulum gewährleistet, indem ein Zwischenschritt zur richtigen Platzierung des Katheters vor dem Einträufeln überprüfen entwickelt. Dieses Verfahren wird unter Verwendung von Farbstoff-Instillation beschrieben visuell nachweisen breite Verteilung des Inokulums in der gesamten Lunge und P. aeruginosa Einträufeln in das hochwirksame Lieferung (&gt; 98% des Inokulums) dieses Verfahrens in die Lunge nachzuweisen. Wichtig ist, während ursprünglich für bakterielle Liefer entwickelt, bietet IMIT auch ein wirksames Instrument für: i) Instillation verschiedener Moleküle für die Untersuchung von anderen Krankheitsmodellen Atem, ii) lungenspezifischen therapeutischen Lieferung und iii) Grundlungenfunktion Studien, einschließlich gezielter siRNA in die Lunge.

<table><tbody><tr><td>Rodent, Tilting WorkStand</td><td>Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>Base should be detached when working in a BSC</td></tr><tr><td>Operating Otoscope Head</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscope 3.5 V Li Battery</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Intubation Specula short, Autoclaveable</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Incisor Loops</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Cotton fine tip applicator</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&amp;nbsp;</td><td>Used for tongue retraction</td></tr><tr><td>I.V. Catheter, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Optional: fit a silicon sleeve with 10 mm exposed catheter surface</td></tr><tr><td>Gas tight syringe, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Used for delivery of liquid inoculum by IMIT</td></tr><tr><td>Blunt Needle, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Trim to length to protrude 1 mm from 20 G catheter</td></tr><tr><td>Guide wire (Fiber optic wire, 0.5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Cut to 6&quot; length: used as guide wire for intubation</td></tr><tr><td>Tuberculin syringe, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Assemble with fiber optic wire as guide wire</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td><td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing, 1/16&quot;</td><td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Male Luer 1/16&quot; barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer 1/16&quot; barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidocaine into solution at 2%(w/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Sample bag, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>U-bottom 96 well plate, sterile</td><td>Greiner</td><td>650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubation-mediated intratracheal (imit) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system

Atemwegserkrankungen Studien beinhalten typischerweise die Verwendung von murinen Modellen als Ersatzsysteme. Es gibt jedoch signifikante physiologische Unterschiede zwischen dem murinen und menschlichen Atemwege, insbesondere in ihren oberen Atemwege (URT). In einigen Modellen können diese Unterschiede in der murinen Nasenhöhle einen signifikanten Einfluss auf den Krankheitsverlauf und die Darstellung in der unteren Atemwege (LRT) haben bei Verwendung intranasale Instillation Techniken, die Nützlichkeit der Mausmodell limitierender um diese Krankheiten zu untersuchen. Aus diesen Gründen wäre es vorteilhaft, ein Verfahren, um Bakterien direkt in den Mäuselungen um LRT Erkrankung in Abwesenheit der Beteiligung des URT studieren vermitteln zu entwickeln. Wir haben diesen Lungen bestimmte Liefer Technik Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation bezeichnet. Dieses nichtinvasive Technik minimiert das Potential zur Instillation in die Blutbahn, die während invasiver Servier auftreten kannonal chirurgischen intratrachealer Infektion Ansätze, und begrenzt die Möglichkeit der zufälligen Verdauungstrakt Lieferung. IMIT ist ein zweistufiges Verfahren, bei dem Mäuse werden zunächst intubiert, mit einem Zwischenschritt, um die korrekte Platzierung des Katheters in der Luftröhre zu gewährleisten, gefolgt von Einführen einer stumpfen Nadel in den Katheter zur direkten Abgabe von Bakterien in den Lungen zu vermitteln. Dieser Ansatz ermöglicht eine&gt; 98% Wirksamkeit der Zustellung in die Lunge mit hervorragenden Verteilung der Reagenzien in der gesamten Lunge. Somit stellt IMIT einen neuartigen Ansatz zur LRT Krankheit und therapeutische Abgabe direkt in die Lunge zu untersuchen, die Verbesserung bei der Fähigkeit, Mäuse als Surrogate für die menschliche Atemwegserkrankung zu untersuchen verwenden. Darüber hinaus macht die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit dieses Abgabesystem es auch zugänglich Good Laboratory Practice Standards (GLPS), sowie die Lieferung von einer Vielzahl von Reagenzien, die hohe Effizienz in der Lunge erforderlich.

Um die Verteilung des Materials über die instilliert IMIT Verfahren zu visualisieren, wurden 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue-Farbstoff in die Lungen eines anästhesierten Maus eingeimpft. Die Maus wurde sofort getötet und die Lungen wurden durch sterile Nekropsie entnommen. 1 zeigt, dass der Farbstoff zu allen Lappen der Lunge zugeführt. Um die Menge der Bakterien in die Lunge über den IMIT Verfahren geliefert, drei Gruppen von Mäusen (n = 3) wurden mit drei verschiedenen Konzentrationen von P. eingeflößt bestimmen, aeruginosa (1,21 x 10 8, 1.21x10 7, und 1,21 x 10 6 koloniebildenden Einheiten [CFU] pro 50 ul). Unmittelbar nach IMIT Instillation wurden die Mäuse getötet, die Lungen entfernt und Bakterienzahlen wurden gezählt und auf die Impfkulturen (2) verglichen. Lieferung des Inokulums ist hoch effizient mittels diesem Verfahren bei&gt; 98% des Inokulums von den Lungen zurückgewonnen von eingeflößtTiere. Weiterhin wurde IMIT Instillation unabhängig von der Konzentration des Inokulums (R 2 = 0,9951) hoch reproduzierbar. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: IMIT Instillation verteilt Inokulum in den Lungen von Lungen von Mäusen, die mit 50 ul 0,1% Coomassie Brilliant Blue zeigen blaue Farbstoff in allen Lappen verteilt tropft.. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Abbildung 2:. IMIT Einträufeln von Bakterien in die Lungen Mäuse wurden mit P. eingeflößt aeruginosa und die Anzahl der Bakterien in die Lunge eingeträufelt (Log 10 CFU - gewonnen) wurden auf die geschätzte Inokulum Vergleich (Log 10 CFU - geliefert). Jeder Kreis stellt die CFU / Lunge eines einzelnen Maus (n = 3 für jedeBakteriendosis).

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Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation vermittelte intratracheale (IMIT) Instillation von Reagenzien ist ein ausgezeichnetes, nicht-invasive Methode zur Untersuchung Atemwegserkrankungen, sowie ein Verfahren zum Einträufeln therapeutische Reagenzien direkt in die Lunge. Es ist eine schnelle und hoch reproduzierbare Methode, die sich für vorklinische Tests ist.

Intubation vermittelte Intratracheale (IMIT) Instillation: eine nichtinvasive, lungenspezifischen Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

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Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

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Serie: Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, in particular, are known to migrate to the lung draining lymph nodes (LDLNs) where they present inhaled antigens to T cells initiating an 
appropriate immune response to a variety of immunogens1,2. To model interactions between the lungs and airborne antigens in mice, antigens can be 
administered intranasally1,3,4, intratracheally5 or as aerosols6. Delivery by each route involves distinct technical skills and limitations that need to be 
considered before designing an experiment. For example, intranasal and aerosolized exposure delivers antigens to both the lungs and the upper respiratory 
tract. Hence antigens can access the nasal associated lymphoid tissue (NALT)7, potentially complicating interpretation of the results. In addition, swallowing, 
sneezing and the breathing rate of the mouse may also lead to inconsistencies in the doses delivered. Although the involvement of the upper respiratory tract may 
be preferred for some studies, it can complicate experiments focusing on events specifically initiated in the lungs. In this setting, the intratracheal (i.t) 
route is preferable as it delivers test materials directly into the lungs and bypasses the NALT. Many i.t injection protocols involve either blind intubation of the 
trachea through the oral cavity or surgical exposure of the trachea to access the lungs. Herein, we describe a simple, consistent, non-surgical method for i.t 
instillation. The opening of the trachea is visualized using a laryngoscope and a bent gavage needle is then inserted directly into the trachea to deliver the 
innoculum. We also describe procedures for harvesting and processing of LDLNs and lungs for analysis of antigen trafficking by flow cytometry.

We illustrate non-surgical delivery of test materials into the lungs of anesthetized mice via the trachea. This method permits lung exposure to bacterial and viral pathogens, cytokines, antibodies, beads, chemicals, or dyes. We further describe harvesting and processing of lungs and lung draining lymph nodes (LDLNs) for flow cytometry.

Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie

Phagocytic cells such as alveolar macrophages and lung dendritic cells (LDCs) continuously sample antigens from the alveolar spaces in the 
lungs. LDCs, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Nichtinvasive Intratracheale Intubation, die Pathologie und Physiologie der Maus Lung Study

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Medizin

Direct Tracheal Instillation of Solutes into Mouse Lung

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice. Using this approach, one can target delivery of test solutes or solids (such as lung therapeutics, surfactants, viruses, and small oligonucleotides) into the distal lung. Tracheal instillations may be the preferred methodology, over inhalation protocols that may primarily target the upper respiratory tract and possibly expose the investigator to potentially hazardous substances. Additionally, in using the tracheal instillation protocol, animals can fully recover from the non-invasive procedure. This allows for making subsequent physiological measurements on test animals, or reinstallation using the same animal. The amount of instillate introduced into the lung must be carefully determined and osmotically balanced to ensure animal recovery. Typically, 30-75 &mu;L instillate volume can be introduced into mouse lung.

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs. This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the lung, and is therefore often incorporated in studies aimed at studying alveoli. We provide a detailed survival protocol for performing intratracheal instillations in mice.

Direkte Instillation von gelösten Stoffen in Mauslunge

Intratracheal instillations deliver solutes directly into the lungs.  This procedure targets the delivery of the instillate into the distal regions of the ...

Biologie

Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer research. Although there are a number of methods that have been published showing how to intubate mice for pulmonary function measurements, none are without potential problems for rapid tracheal instillation in large cohorts of mice. In the present paper, a simple and quick method is described that enables an investigator to carry out such instillations in an efficient manner. The method does not require any special tools or lighting and can be learned with very little practice. It involves anesthetizing a mouse, making a small incision in the neck to visualize the trachea, and then inserting an intravenous catheter directly. The small incision is quickly closed with tissue adhesive, and the mice are allowed to recover. A skilled student or technician can do instillations at an average rate of 2 min/mouse. Once the cancer is established, there is frequently a need for quantitative histologic analysis of the lungs. Traditionally pathologists usually do not bother to standardize lung inflation during fixation, and analyses are often based on a scoring system that can be quite subjective. While this may sometime be sufficiently adequate for gross estimates of the size of a lung tumor, any proper stereological quantification of lung structure or cells requires a reproducible fixation procedure and subsequent lung volume measurement. Here we describe simple reliable procedures for both fixing the lungs under pressure and then accurately measuring the fixed lung volume. The only requirement is a laboratory balance that is accurate over a range of 1 mg&#8211;300 g. The procedures presented here thus could greatly improve the ability to create, treat, and analyze lung cancers in mice.

The goal of this paper is to describe simple methods that will greatly aid in the setup and analysis of mouse lungs with lung cancer or other pathologies. We present 3 protocols to simply and reliably carry out lung instillations, fixation, and lung volume measurements.

Instillation und Fixationsmethoden Nützlich in Maus Lung Cancer Research

The ability to instill live agents, cells, or chemicals directly into the lung without injuring or killing the mice is an important tool in lung cancer ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Ein verbessertes Verfahren zur schnellen Intubation der Luftröhre in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Intratracheal Administration of Dry Powder Formulation in Mice

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper introduces a noninvasive method of intratracheal delivery of dry powder formulation in mice. A dry powder loading device that consists of a 200 &#181;L gel loading pipette tip connected to an 1 mL syringe via a three-way stopcock is presented. A small amount of dry powder (1-2 mg) is loaded into the pipette tip and dispersed by 0.6 mL of air in the syringe. Because pipette tips are disposable and inexpensive, different dry powder formulations can be loaded into different tips in advance. Various formulations can be evaluated in the same animal experiment without device cleaning and dose refilling, thereby saving time and eliminating the risk of cross-contamination from residual powder. The extent of powder dispersion can be inspected by the amount of powder remaining in the pipette tip. A protocol of intubation in mouse with a custom-made light source and a guiding cannula is included. Proper intubation is one of the key factors that influences the intratracheal delivery of dry powder formulation to the deep lung region of the mouse.

Dry powder formulations for inhalation have great potential in treating respiratory diseases. Before entering human studies, it is necessary to evaluate the efficacy of the dry powder formulation in preclinical studies. A simple and noninvasive method of the administration of dry powder in mice through the intratracheal route is presented.

Intratrachealadministration der Trockenpulverformulierung bei Mäusen

In the development of inhalable dry powder formulations, it is essential to evaluate their biological activities in preclinical animal models. This paper ...

A Minimally Invasive Method for Intratracheal Instillation of Drugs in Neonatal Rodents to Treat Lung Disease

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered drug. This has direct translational impact because surfactant and drugs are administered locally into the lungs. Though the literature has many publications describing minimally invasive transoral intubation of adult mice and rats in therapeutic experiments, this approach in neonatal rat pups is lacking. The small size of orotracheal region/pharynx in the pups makes visualization of laryngeal lumen (vocal cords) difficult, contributing to the variable success rate of intratracheal drug delivery. We hereby demonstrate effective oral intubation of neonatal rat pup - a technique that is non-traumatic and minimally-invasive, so that it can be used for serial administration of drugs. We used an operating otoscope with an illumination system and a magnifying lens to visualize the tracheal opening of the rat neonates. The drug is then instilled using a 1 mL syringe connected to a pipette tip. The accuracy of the delivery method was demonstrated using Evans blue dye administration. This method is easy to get trained in and could serve as an effective way to instill drugs into trachea. This method could also be used for administration of inoculum or agents to simulate disease conditions in animals and, also, for cell-based treatment strategies for various lung diseases.

This technique of instilling drugs directly into the trachea of neonatal rodents is important in studying the impact of locally administered drugs or biologicals on neonatal lung diseases. Additionally, this method can also be used for inducing lung injury in animal models.

Eine minimal-invasive Methode zur intratrachealen Instillation von Medikamenten bei neonatalen Nagetieren zur Behandlung von Lungenerkrankungen

Treatment of neonatal rodent with drugs instilled directly into the trachea could serve as a valuable tool to study the impact of a locally administered ...

Simplifying Transcutaneous Intratracheal Drug Delivery in the Newborn Preterm Rabbit

Intratracheal (IT) drug delivery allows the direct delivery of pharmaceutical substances to the lung, maximizing potential pulmonary benefit and minimizing systemic drug exposure. The transcutaneous technique is simple and allows for the IT delivery of substances to the lung of prematurely born rabbits shortly after birth. Newborn pups are anesthetized with inhaled Isoflurane before being placed in a supine position with the neck extended. The larynx is identified and stabilized before transcutaneous placement of a 26-gauge (G) catheter into the trachea. Following catheterization of the trachea, a 30 G blunt needle attached to a Hamilton syringe is introduced into the IT catheter and is used for delivering a precise volume into the trachea during spontaneous respiration. After the IT injection is completed, the needle and catheter are withdrawn, and the pup is allowed to recover from anesthesia. Transcutaneous IT injection delivers a large proportion of the injected substance to the lung, with the majority remaining in the lung 3 hours after the intervention. The injections are well tolerated from the day of birth and can be repeated for multiple consecutive days without influencing survival. This technique can be used to investigate the effect of pharmaceutical agents on lung development and in the prevention of neonatal lung injury in preterm rabbits.

Transcutaneous intratracheal injection allows for effective intrapulmonary drug delivery during spontaneous respiration. Single and multiple injections are well tolerated with no effect on survival. The technique is simple to perform and can examine the effect of substances on lung development and the prevention of lung injury in newborn rabbits.

Intratracheal (IT) drug delivery allows the direct delivery of pharmaceutical substances to the lung, maximizing potential pulmonary benefit and ...

Noninvasive Intratracheal Lipopolysaccharide Instillation in Mice

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of acute lung injury or acute inflammation. The current most commonly used methods in acute lung injury mouse models are an intraperitoneal injection of LPS and tracheostomy for the tracheal infusion of LPS. However, the former method lacks lung targeting and damages other organs, and the latter method induces operative trauma, infection risk, and a low survival rate. Here, we recommend a noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation method for LPS instillation in mice. In this method, LPS is noninvasively introduced into the trachea through the oropharyngeal cavity to be instilled into the lung with the help of an apparatus for endotracheal intubation. This method not only assures lung targeting but also avoids damage and the risk of death in the animals. We expect that this approach will become widely used in the field of acute lung injury.

Here, we propose a protocol for intratracheal lipopolysaccharide (LPS) delivery via noninvasive oropharyngeal endotracheal intubation. This method minimizes the trauma of the surgical procedure for the animal and accurately delivers LPS to the trachea and then to the lungs.

Nichtinvasive intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation bei Mäusen

The acute lung injury (ALI) mouse model induced by lipopolysaccharide (LPS) or endotoxin is still among the most commonly used models in animal studies of ...