Name: specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

1. Herstellung von Peptidarrays <ol><li> Programmieren der Peptidsequenzen <ol><li> Gestalten Peptidsequenzen für die Synthese mit dem MultiPep Spotter Software. Geben Sie die Peptidsequenzen in Einzelbuchstabencodes. Peptid 1: TARKSTGGKA </li><li> Gene Alanin oder Arginin Spaziergang Bibliotheken mit einem bestimmten Befehl (.replace, A), die für die Anerkennung der einen definierten Untergrund erforderlich wichtigen Aminosäuren zu untersuchen. Zum Beispiel in dem folgenden Beispiel wird die erste Zeile ist der Wildtyp-Sequenz und die aus der zweiten Zeile jeder Aminosäure in einem Peptid mit Alanin sequentiell verändert. ersetzen, A TARKSTG Ein -ARKSTG T- A -RKSTG TA-A -KSTG TAR- A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> Verwenden Sie ähnliche Befehle (.replace R,.ersetzen N etc.), wie in 1.1.2 mit allen natürlich vorkommenden Aminosäureresten (schließlich Weglassen Cystein, Methionin und Tryptophan beschrieben, weil diese Rückstände sind anfällig für Oxidation und manchmal niedriger Syntheseausbeute), um eine Peptidanordnung zur Bestimmung der Konsensus synthetisieren Substrat Sequenzmotiv für ein Enzym. HINWEIS: Wie in 4A gezeigt ist, stellt die horizontale Achse die gegebene Peptidsequenz und die vertikale Achse repräsentiert die Aminosäuren, die für die Befehls ausgewählt sind. Ähnlich zu der in 1.1.2 gezeigt durch A auf der vertikalen Achse bedeutet, daß ein Ala sequentiell jede Position der gegebenen Reihenfolge in der ersten Reihe in Fig ersetzt. 4A. Ähnlich Arginin nacheinander ersetzt jede Aminosäure in der zweiten Reihe und so weiter bei den anderen Aminosäuren. Komplette Peptidarray-Bibliotheken werden von systematisch in die bereitgestellten Peptidsubstrats Folge Ersetzen jedes Rückstand mit jedem th synthetisierte andere natürlich verfügbaren Aminosäureresten, das hilft, den Einfluss von jedem Rest an jeder Position des gegebenen Sequenz zu verstehen. </li><li> Alternativ kann die Methylierung von bekannten oder vorhergesagten Peptidsubstrate leicht verifiziert werden Synthetisieren von Peptid-Bibliotheken mit den Zielpeptide der PKMT zusammen mit positiven und negativen Kontrollen Methylierung (dh Peptide, die methylierte bekannt oder bekannten nicht methyliert sind). Synthetisieren Peptide durch Austausch des mutmaßlichen Ziel Lysin zu Alanin auf Methylierung des Ziel Lysin zu bestätigen, wie unten durch manuelle Programmierung angezeigt. Wildtyp-Peptid: StGG K PRQFL Mutant Peptid: StGG A PRQFL HINWEIS: Die Software ist auch inhärent Skripte verschiedenen Bibliotheken zu erstellen, wie Epitop-Kartierung mit einer gewünschten Rahmenverschiebung der Sequenz wichtig für eine Interaktion erforderlichen Aminosäuren abzubilden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der Membran, Aminosäuren eind Reagenzien <ol><li> Pre-schwellen die SPOT-Membran in DMF (N, N-Dimethylformamid) für 10 Minuten und dann die feuchte Membran auf der SPOT-Synthesizer Rahmen ohne Luftblasen oder Falten. </li><li> Dreimal mit 100% Ethanol waschen Membran. Man trocknet die Membranen vollständig mindestens 10 min vor Beginn der Syntheseprogramm. </li><li> Parallel frisch zubereiten 0,5 M Arbeitskonzentrationen von kommerziell erhältlichen Fmoc-geschützten Aminosäuren in NMP löst sie und auch den Aktivator und Base herzustellen, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Stellen Sie sicher, dass alle Abfalllösungsbehälter des SPOT-Synthesizer geleert wurden und füllen Sie die Lösungsmittelbehälter mit dem DMF, Ethanol und Piperidin. HINWEIS: Das Gerät ist nun bereit für die Synthese. </li></ol></li><li> Spotten von der ersten Aminosäure <ol><li> Um die Amidbindung mit der freien Aminogruppe auf der Membran zu erzeugen, aktivieren Sie die Carboxy-Gruppe der ankommenden Aminosäure des Anbietersding der Aktivator (N, N &#39;-Diisopropylcarbodiimide) und Basenlösung (Ethyl hydroxyimino cyanoacetat) zu dem Aminosäurederivat. </li><li> Finde die gewünschten Volumina der aktivierten Aminosäuren an die Amino-PEG funktionalisierten Membran unter Verwendung der programmierbaren Roboter. HINWEIS: Dadurch wird der C-Terminus der Aminosäure an die Aminogruppe der Membran gekoppelt ist. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang drei Mal, um eine bessere Kopplung der ersten aktivierten Aminosäure zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Membran für 20 Minuten und waschen mit DMF zu abgekoppelt Aminosäuren entfernen Sie dann. </li></ol></li><li> Das Blockieren der freien Plätze auf Non-Spot Bereiche HINWEIS: Nach der Kupplung der ersten C-terminalen Aminosäure aller Peptide an der Aminogruppe der Membran, werden die Aminogruppen zwischen den Flecken und einige der Aminogruppen in den Punktbereichen keine Bindungen mit den Aminosäuren bilden. <ol><li> Blockieren diese freien Aminogruppen durch Inkubation mit dem Capping-Lösung (20% Essigsäureanhydrid in DMF)für 5 min. ANMERKUNG: Dies vermeidet die Kupplung der Aminosäuren in den weiteren Zyklen mit der Membran anstatt der wachsenden Peptidkette. </li></ol></li><li> Die Entfernung der Fmoc-Gruppe <ol><li> Nach der Blockierung, Waschen der Membran mit DMF 4 mal und dann inkubiert mit 20% Piperidin in DMF für 20 Minuten, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Anmerkung: Dieser Schritt führt zu einer Entfernung der Aminoschutzgruppe Fmoc-Gruppen, und es heißt Entschützung. </li><li> Danach waschen Sie die Membran zweimal mit DMF und zweimal mit Ethanol und lassen Sie ihn trocknen. HINWEIS: Nun ist die Membran ist für die Kopplung der nächsten Aminosäuren. </li></ol></li><li> Kettenverlängerung HINWEIS: Die Zugabe jeder Aminosäure wird als ein Zyklus bezeichnet. Abgesehen von der Kopplung der ersten Aminosäure, beginnt der Zyklus mit der Abspaltung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe der gekoppelten Aminosäure und es wird durch die Kopplung der aktivierten Carboxylgruppe einer ankommenden Aminosäure an die Aminogruppe der wachsenden pep gefolgtFlut Kette. <ol><li> Schritte 1.3 und 1.5, bis die gewünschte Peptidlänge erreicht wird. </li></ol></li><li> Färbung HINWEIS: Nach dem letzten Zyklus werden die Peptidarrays mit Bromphenolblau gefärbt, um die erfolgreiche Synthese von Peptiden zu bestätigen. Bromphenolblau bindet mit den freien Aminogruppen der Peptide. Peptid-Spots zeigen hellblaue Farbe nach dem Färben, aber die Intensität der Flecken variiert abhängig von der Peptidsequenz. Diese Färbung kann die Bestätigung der vollständigen Entfernung des Piperidin, weil in Gegenwart von Piperidin Bromphenolblau nicht die Peptide zu färben. Außerdem hilft dies auch, um die Peptid-Arrays für die weitere Verwendung zu markieren. <ol><li> Nach der Entfernung der Schutzgruppe Fmoc-Gruppe im letzten Synthesezyklus, waschen Sie die Membran mit DMF und 100% Ethanol. Dann behandeln die Membran mit Bromphenolblau (0,02% Bromphenolblau in DMF) für mindestens 5 Minuten, bis es vollständig blau. </li><li> Danach waschen Sie die Membran mit DMF und ethanol gefolgt von Trocknen für 10 min. Nun nehmen Sie die Membran aus dem Synthesizer und durchzuführen, Seitenkettenschutzgruppenentfernung (Abschnitt 1.8) von Hand. Falls benötigt, fotografieren der Membran, um die Ergebnisse des Peptid-Synthese (Fig. 2) zu dokumentieren. </li></ol></li><li> Side Chain Entfernung der Schutzgruppe <ol><li> Behandlung der Membran mit 20 bis 25 ml der Seitenkettenschutzgruppenabspaltung Mischung bestehend aus 95% Trifluoressigsäure (TFA), um die Seitenkettenschutzgruppen und Reagenzien Scavenger (2,5% Wasser und 2,5% Triisopropylsilan), um die Seitenketten von Aminosäuren aus schützen spalten Änderung bei diesem Schritt. Nehmen Sie eine ausreichende Menge an Entschützung Mischung, um sicherzustellen, dass er die Membran vollständig in einem dicht geschlossenen chemikalienbeständige Box und inkubieren Sie für 1-2 Stunden unter leichtem Schütteln. </li><li> Sechsmal Waschen der Membran mit 20-25 ml DCM (Dichlormethan), jeweils 2 min und schließlich zweimal mit 100% Ethanol und trocknet es im Exsikkator über Nacht. HINWEIS: Jetztkann die Membran für Experimente verwendet werden. Ein Schema der Peptidsynthese-Array ist in 1 bereitgestellt. </li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Protein Expression von PKMTs als GST Fusions <ol><li> Verwendung von Standardtechniken, klonen die über die gesamte Länge PKMT oder seine katalytische Domäne in einen bakteriellen Expressionsvektor (wie pGEX-6p2), um sie als GST-Fusionsprotein zu exprimieren kodierenden Gens. </li><li> Übertragen Sie den Vektor mit dem gewünschten PKMT einfügen in BL21 oder BL21-Codon und E. coli-Zellen durch das Hitzeschock-Methode oder jede andere Methode. </li><li> Vorbereiten einer Vorkultur in 30 ml Luria-Bertani (LB) Medium am Tag der Expression und Inkubation bei 37 ° C für 7 bis 8 Stunden unter kontinuierlichem Schütteln. </li><li> Als nächstes über 10 ml der Vorkultur in einen 2 l großen Schikane-Kolben mit 1 l LB-Medium und bei 37 ° C im Brutschrank unter ständigem Schütteln bis die Kultur die Reichweitees eine definierte optische Dichte bei 600 nm. Anmerkung: Dies kann zwar für jedes Protein optimiert werden wir routinemäßig bei einer OD 600 nm von etwa 0,8 zu induzieren. Die Induktionstemperatur muss für jedes Protein einzeln optimiert werden einige Proteine ​​zeigen eine gute Ausdrucks 22 ° C und einige bei höheren Temperaturen. </li><li> Verschieben die Zellen an den Induktionstemperatur für 15 min, dann mit 1 mM Isopropyl- &amp; beta; -D-thiogalactopyranosid induziert und damit der Kultur für 10-12 Stunden bei Induktionstemperatur wachsen. </li><li> Danach Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 xg für 15 Minuten und schließlich Waschen des Pellets mit 30 ml STE-Puffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA) resuspendiert und bei -20 ° C für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Proteinreinigung <ol><li> Auftauen Zellpellet und resuspendiere in 30 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) und stören durch Beschallung. HINWEIS: Dieser Puffer needs für jedes Protein schließlich optimiert werden. </li><li> Zentrifugieren Sie das Zelllysat bei 22.000 · g für 1 Stunde und später den Überstand zu sammeln und durch eine Säule, die 600 &amp; mgr; an Glutathion Sepharose 4B-Harz. </li><li> Mit 50 ml Beschallungspuffer und anschließend mit 100 ml Hochsalzpuffer (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT und 5% Glycerin) unspezifisch gebundene Proteine ​​zu entfernen Die Säule. Eluieren des gebundenen Proteins mit 5 ml Hochsalzpuffer, enthaltend 40 mM Glutathion. </li><li> Dialysieren des eluierten Proteins in 2 l Dialysepuffer mit niedrigem Glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 10% Glycerin) für 2 Stunden und dann in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCl, 0,5 mM DTT und 70% Glycerin 8 Stunden oder über Nacht. Achten Sie darauf, alle Reinigungspuffer bei 4 ° C und führen Sie die Proteinreinigung im Kühlraum, um Proteindenaturierung zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 3. Peptid-Array-Methylierung <ol><li> Pre-incuBewährung von Peptidarrays <ol><li> Führen Peptidanordnung Methylierung entweder in einem Feld mit der entsprechenden Größe oder in einem Kunststoffbeutel, die Verschwendung des teuren Enzyms und radioaktiv markiertem AdoMet vermeiden. Pre-Inkubation der Peptidarray-Membran in versiegelten Plastikbeutel mit dem jeweiligen Methylierungspuffer ohne Enzym und mit [Methyl-3H] -AdoMet 10 min. Das Puffervolumen ist abhängig von der Größe des Arrays, beispielsweise verwenden 8 ml Methylierungspuffer für eine volle Spezifität Profil Peptidanordnung. Optimieren der Menge und Konzentration der AdoMet für jedes Enzym. </li></ol></li><li> Die Methylierung von Peptidarrays <ol><li> Entsorgen Sie die Vorinkubation Puffer und Inkubation der Membran in 8 ml Methylierungspuffer, der die jeweilige PKMT und mit [Methyl-3H] -AdoMet für 1 bis 2 Stunden. HINWEIS: Die Enzymmenge, für eine Methylierungsreaktion erforderlich ist, hängt von der Aktivität des speziellen PKMT initiieren wir unserem Screening-Experimente in der Regel mit 50 nM Enzym final-Konzentration. </li></ol></li><li> Das Waschen von Peptidarrays <ol><li> Danach verwerfen Methylierungspuffer in einer radioaktiven Abfallbehälter und waschen die Peptidarrays 5 mal mit 20 ml Puffer, enthaltend 100 mM Ammoniumbicarbonat und 1% SDS für 5 Minuten, um das gebundene Protein zu entfernen. Entsorgen Sie den Waschpuffer in einem radioaktiven Abfallbehälter. </li></ol></li><li> Detektion der radioaktives Signal <ol><li> Nach den Wäschen Inkubieren der Membran für 5 Minuten in 10 ml Lösung Amplify (NAMP100V). </li><li> Dann werfen Sie die amplify Lösung in die radioaktive Abfälle Behälter für organische Lösemittel, dichten den Peptidarray in einer Plastiktüte und legen Sie sie in einer Autoradiographie Kassette. </li><li> Platzieren Sie die Autoradiographie-Film auf dem Peptidarray in den dunklen Raum. Schließen Sie die Kassette vorsichtig und setzen Sie es bei -80 ° C für die erforderliche Zeit. Dann entwickeln die Folie, um die Ergebnisse zu analysieren. Nehmen Sie das Bild mehrmals mit unterschiedlichen exposition-mal, um eine Sättigung von stark methylierten Peptidsubstrate zu vermeiden. </li></ol></li></ol> 4. Datenverarbeitung und -analyse <ol><li> Densitometrische Analyse der Spotintensitäten <ol><li> Scannen Sie den Film in einem konventionellen Scanner und die Spotintensitäten analysieren densitometrisch. Tun Sie dies mit ImageJ (die Freeware ist) oder ein kommerzielles Programm. BEMERKUNG: Wir verwenden Phoretix Software für diese Aufgabe. </li></ol></li><li> Normalisierung und Mittelwertbildung der Ergebnisse aus verschiedenen Membranen <ol><li> Führen Sie die Peptidarray-Methylierungsexperimente zumindest in dreifacher Ausfertigung. Normalisieren die gescannten Intensitäten für jedes Experiment durch Subtraktion des Hinter und Einstellung der Tätigkeit bei einer Referenzsubstrat als 1,0. Der Mittelwert der Daten für die einzelnen Punkte und melden sie als Mittelwerte und Standardabweichungen. </li></ol></li><li> Datenanalyse und Anzeige <ol><li> Zeichnen Sie die Daten in 2D mit einem Graustufen- oder Farbschema, um die relative Tätigkeit hinweisen. Tun Sie dies with Excel oder Sigmaplot wie hier gezeigt. Auch bereiten eine graphische Darstellung der Verteilung der Standardabweichungen der wiederholten Versuchen, um die Qualität der Daten zu analysieren. </li><li> Vergleichen und zeigt die Genauigkeit der Erkennung von jedem Rest in dem Substrat Peptid quantitativ berechnen die relative Präferenz der PKMT für jede Aminosäure i an Position x durch ein Diskriminierungsfaktor D 16,17: D X; i = &lt;V j ≠ i&gt; / V i - 1 Wobei v i ist die Geschwindigkeit der Methylierung der Peptidvariante trägt Aminosäure i an Position x und &lt;v j ≠ i&gt; ist der Durchschnittskurs der Methylierung aller 19 Peptiden mit unterschiedlichen Aminosäure j ≠ i an der Position x (einschließlich der Wildtyp-Sequenz). HINWEIS: Das Diskriminierungsfaktor dadurch definiert, hängt von der Hintergrundebene. Wenn nur ein Rückstand an einer bestimmten Position mit einem Hintergrund von 3%, eine Diskriminierung akzeptiertFaktor von 32,3 erhalten wird. Keine Präferenz in einer Position ergibt sich eine Diskriminierungsfaktor von 0. </li></ol></li></ol>

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SPOT-Synthese, wie hier beschrieben ist eine leistungsfähige Methode zur Karte Protein-Protein-Interaktionsstellen und untersuchen die Substraterkennung von Peptid-modifizierende Enzyme. Jedoch hat SPOT Synthese noch bestimmte Nachteile, denn obwohl die Peptide von der SPOT-Verfahren synthetisiert wird berichtet, daß mehr als 90% Reinheit 21 haben, ist dies schwierig, in jedem Fall zu bestätigen. Deshalb müssen Ergebnisse, die durch andere Methoden zum Beispiel mit Proteindomänen oder mit gereinigten Pep...

In den letzten zwei Jahrzehnten, zeigen mehrere Berichte die Bedeutung der post-translationale Modifikationen (PTM) in zellulären Entwicklung und mehrere Krankheiten wie Krebs, aber vor kurzem Protein Lysin-Methylierung hat sich als eine andere lebenswichtige PTM entstanden. Während zunächst Histon Lysin-Methylierung wurde festgestellt, eine wesentliche Chromatin Marke werden, zeigten spätere Arbeit auch Lysin-Methylierung von mehreren Nicht-Histon-Proteine ​​1-4. Die sequentielle Übertragung der Methylgruppe von S-Adenosyl-L-methionin zu der ε-Aminogruppe der Lysinreste wird durch eine Familie von Enzymen, genannt Protein Lysin-Methyltransferasen (PKMTs), die mehr als 60 Proteine, die in das menschliche Genom enthält katalysiert. PKMTs wurden zunächst als Histon-modifizierenden Enzymen, die spezifisch Lysinrest methylieren aber später Berichte gezeigt, dass sie auch zu methylieren Nicht-Histon-Proteine ​​5 entdeckt. Bisher wurden etwa 5.000 Lysin Methylierungsstellen auf verschiedenen Proteinen 6 ermittelten </sup&gt;, aber die Enzyme, die für diese Änderungen verantwortlich sind oft nicht identifiziert. Ein Grund dafür ist, dass die Spezifität der meisten PKMTs nicht ausführlich untersucht worden. Daher ist es immer wieder vor, dass neuartige Substrate PKMTs entdeckt werden. Das Fehlen einer detaillierten Kenntnis der Substratspezifität PKMTs behindert Verständnis ihrer biologischen Funktion und Rolle. Um die Spezifität einer PKMT im Detail zu untersuchen, müssen die Methylierung Geschwindigkeiten vieler Peptidsubstrate, die in einer oder einigen Aminosäuren unterscheiden, gemessen und verglichen werden, die im Idealfall unter Verwendung von Peptid-Arrays durchgeführt wird werden. Basierend auf den erhaltenen Spezifität Profile können potentielle Substrate PKMTs identifizieren, die weiter untersucht werden können. Peptid-Arrays werden häufig verwendet Werkzeuge für die biochemische Analyse von Antikörpern, Peptid modifizierende Enzyme und Kartierung von Protein-Protein-Interaktionsstellen (Antikörper-Antigen, Rezeptor-Ligand) 7-9. Mehrere hundert Peptide zur suc erforderlichh Anwendungen. Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung für die Peptidsynthese, unter ihnen die Peptidsynthese am Harz wird sehr häufig verwendet, aber es kann nur eine beschränkte Durchsatz und relativ teuer ist. Diese Probleme wurden mit der Einführung des SPOT-Syntheseverfahren von Frank und seine Kollegen 10 gelöst. Die SPOT-Syntheseverfahren erlaubt die Synthese von mehreren hundert Peptide parallel und im Mittel er preiswert ist, verglichen mit der Harzsynthese. Die synthetisierten Peptide auf Cellulosemembran kann entweder direkt für verschiedene Anwendungen oder Peptide verwendet werden, können aus der Membran geschnitten und als freie Peptide in Lösung Assays verwendet werden oder Peptid-Mikroarrays 10-13 vorzubereiten. SPOT-Synthese ist eine Variante des Festphasen-Peptidsynthese, die eine Cellulose-Membran als fester Träger verwendet und verwendet den Standard-Fmoc-Chemie 10-13. Daher ist die Synthese der Peptidketten beginnt am C-terminalen Ende und schreitet in Richtungdie N-terminalen Ende im Vergleich zu der biologischen Synthese in Ribosomen. Cellulosemembranen sind für die Befestigung des ersten aktivierten Aminosäuren (Fig. 1) funktionalisiert. Der Spot-Verfahren basiert auf der sequentiellen Abgabe aktivierten Aminosäuren in einem Tröpfchen von Lösungsmittel zu definierten Spots auf der Membran unter Verwendung eines automatisierten Pipettiersystems bezogen. Die Flüssigkeitströpfchen auf der porösen Membran, wo sie eine Kreis nassen Fleck, der später wirkt als offener Reaktor für die chemischen Reaktionen bei der Peptidsynthese bildet verzichtet. Die Fleckgrße wird durch das Volumen abgefüllt und die Absorptionskapazität der Membran bestimmt wird, werden Vielfache von solchen Stellen als Arrays angeordnet sind. Der Synthesemaßstab korreliert mit der Punktgrße und die Belastbarkeit der Membran. Der Abstand zwischen den Flecken und der Dichte des Arrays werden durch Variation der Punktgrßen verwaltet. Cellulosemembran hat mehrere Vorteile, wie Festphasenpeptidsynthese, preiswert, tolerant gegenüber dem chemic ist esals in der Peptidsynthese verwendet, in wässrigen Lösungen stabil ist und leicht zu handhaben. Darüber hinaus macht seine hydrophile Natur es für verschiedene biologische Testsysteme geeignet. SPOT-Synthese kann manuell oder automatisiert (für 1000 von Peptiden), je nach der gewünschten Anzahl von Peptiden werden. Eine vollautomatische SPOT-Synthesizer von Intavis (Köln, Deutschland) ist für unsere Anwendungen. Es ermöglicht die Synthese von Peptiden in unterschiedlichen Mengen und von unterschiedlicher Länge. Lineare Peptide sind regelmäßig mit 15 bis 20 Aminosäuren Länge synthetisiert, zusätzlich Peptiden von bis zu 42 Aminosäuren können auch durch stufenweise Synthese 14,15 hergestellt werden. Eine Erhöhung der Anzahl von Aminosäuren führt zu einer Verringerung in der Gesamtkopplungsausbeuten, die die Qualität der Peptide beeinträchtigen. Wegen der geringen Menge an Peptiden pro Spot, die Produkte sind oft schwierig zu reinigen, und die Qualität der einzelnen Peptide können nicht einfach beurteilt werden. Daher sind die Ergebnisse von SPOT Pept erhaltenenide Arrays müssen entweder mit Peptiden nach Standardverfahren in größerem Maßstab, die gereinigt und nach Standards in der Peptidsynthese oder durch Synthese der Proteine, die die gewünschten Peptidsequenzen analysiert werden können synthetisiert bestätigt werden. Dennoch fanden wir die SPOT-Synthese durch hohe Zuverlässigkeit und führt in der Regel reproduzierbar sein. SPOT-Synthese ist nicht beschränkt auf Aminosäuren, mehreren kommerziell erhältlichen modifizierten Aminosäuren können auch für die Synthese verwendet werden proteinogenen, wodurch Peptide, die vor und nach der abschließenden Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppe und ferner modifiziert werden, sondern ermöglicht auch den Einbau von phosphoryliert, methyliert oder acetyliert Aminosäuren 11. Immobilisierte Peptidbibliotheken durch die SPOT-Verfahren synthetisiert können direkt für viele biologische und biochemische Assays verwendet werden. Wir verwendeten Peptidarrays, umfassend 300-400 Peptide, die Substratspezifität von PKMTs untersuchen. Für enzymatische modifiKationen werden die Peptid-Arrays mit den entsprechenden PKMT inkubiert und mit [Methyl- 3 H] -AdoMet in einem geeigneten Puffer. Die Methylierung des jeweiligen Substrats durch folgenden die enzymatische Übertragung von radioaktiv markierten Methylgruppen von AdoMet auf das Peptidsubstrat über Autoradiographie (Fig. 3) untersucht. Durch dieses Verfahren werden die Peptid-Arrays erlauben das Studium der Methylierung von verschiedenen Peptidsubstrate gleichzeitig. Ein wichtiger Vorteil dieses Verfahrens ist, dass alle Peptide in Konkurrenz methyliert, so dass während der linearen Phase der Methylierung Kinetik, ist die relative Methylierungs jedes Peptids proportional zu der katalytischen Geschwindigkeitskonstante geteilt durch die Dissoziationskonstante (k cat / K D) des Enzyms für die jeweiligen Peptidsubstrat. Daher wird die Menge an Radioaktivität in jedem Spot einge direkt mit der enzymatischen Aktivität gegenüber dem jeweiligen Peptids korreliert. Mit derErgebnisse einer Peptidarray-Methylierung Experiment kann die Spezifität Profil des PKMT definiert und basieren auf dieser neuartige Substrate ausgesagt werden. Peptidarrays ermöglichen die schnelle und kostengünstige Überprüfung der Methylierung neuartige Substrate in Peptiden. Hierzu werden Arrays hergestellt, die die vorhergesagten neuen Substrate mit modifizierten Peptide, die eine Ala anstelle von Lys an den Zielorten sowie positive und negative Kontrollpeptide enthalten. Schließlich können die erfindungsgemäßen Proteine ​​als Substrate zusammen mit Mutanten, in denen das Ziel Lys Ala verändert und die Methylierung kann auf Proteinebene zu bestätigen, hergestellt werden. Je nach Ergebnis wird diese dann von biologischen Studien zu möglichen Rollen der Methylierung der neu beschriebenen Proteinsubstraten gefolgt.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

Lysin-Methylierung ist ein aufstrebendes posttranslationale Modifikation und es hat auf mehreren Histon und Nicht-Histon-Proteine ​​identifiziert worden, wo er eine entscheidende Rolle bei der Zellentwicklung und viele Krankheiten spielt. Rund 5.000 Lysin Methylierungsstellen wurden auf verschiedene Proteine, die von einigen Dutzenden von Protein Lysin-Methyltransferasen eingestellt werden identifiziert. Dies deutet darauf hin, dass jede PKMT methyliert mehrere Proteine ​​jedoch bis jetzt nur ein oder zwei Substrate wurden für mehrere dieser Enzyme identifiziert worden. Um dieses Problem anzugehen, die wir eingeführt haben Peptidarray basierte Substratspezifität Analysen PKMTs. Peptidarrays sind mächtige Werkzeuge, um die Spezifität PKMTs charakterisieren, da die Methylierung der mehrere Substrate mit verschiedenen Sequenzen können auf einem Array getestet werden. Wir Peptidarrays auf Cellulosemembran mit einem Intavis SPOT-Synthese und analysiert die Spezifität der verschiedenen PKMTs. Basierend auf den Ergebnissen aus mehreren dieser Enzyme, neuartige substrates identifiziert werden. Zum Beispiel kann für NSD1 durch Verwendung Peptidarrays, zeigten wir, dass es methyliert K44 H4 statt der berichteten H4K20 und zusätzlich H1.5K168 ist stark bevorzugt Substrat über dem vorbekannten H3K36. Daher Peptid-Arrays sind leistungsfähige Werkzeuge, um biochemisch charakterisieren die PKMTs.

Peptidarrays wurden erfolgreich eingesetzt, um biochemisch charakterisieren die Spezifität PKMTs, und mehrere neue Histon und Nicht-Histon-Substrate PKMT identifiziert durch diesen Ansatz 5,16-19. Definieren der richtigen Substrat-Spektrum einer PKMT (oder einem Enzym), ist ein wesentlicher Schritt in Richtung auf das Verständnis des molekularen Mechanismus und zellulären Funktionen. Als ein Beispiel für die Anwendung der Peptidfleckenanordnung Methylierungsmethode beschreiben...

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Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Aufrufe.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Serie: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Forschung

Biochemie

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

Biologie

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Neurowissenschaften

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Zusammenfassung

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Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl-_L-Homocystein-bindende Proteine von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Spezifitätsanalyse von Protein Lysin Methyltransferasen Mit SPOT Peptidarrays

Zusammenfassung

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Analyse der Histon-Antikörper-Spezifität mit Peptid-Microarrays

Die Bestimmung der Protease Spezifität im Maus-Gewebe extrahiert durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie: PH um Spezifität Änderungen führen zu manipulieren

Ein massenspektrometrie-basierter Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse

Probenvorbereitung und relative Quantifizierung mittels reduktiver Methylierung von Aminen für Peptidomik-Studien

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl- L-Homocystein-bindende Proteine ​​von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

Die Anwendung des MassSQUIRM für quantitative Messungen von Lysin-Demethylase

Ermittlung von Protein-Protein-Interaktionsstellen unter Verwendung von Peptid-Arrays

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Quantifizierung der standortspezifischen Protein Lysin Acetylierung und Succinylation Stöchiometrie mittels Massenspektrometrie Daten-unabhängige Übernahme

Gleichzeitige Affinitätsanreicherung von zwei posttranslationalen Modifikationen für Quantifizierung und Standortlokalisierung

Profiling von Methyltransferasen und andere S-Adenosyl-_L-Homocystein-bindende Proteine von Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)