Name: surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
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This work is supported by an R21 grant from the National Institutes of Health and by a grant from Hearing Research, Incorporated.

HINWEIS: Alle Verfahren und Behandlung der Tiere mit NIH Ethikrichtlinien und genehmigte Protokoll Anforderungen der Institutional Animal Care und Verwenden Committee der University of California, San Francisco eingehalten werden. 1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie <ol><li> Führen Sie chirurgische Eingriffe an einem sauberen, gewidmet Raum. Autoklavieren alle chirurgischen Instrumenten, sterilisieren mit einer Glasperlen Sterilisator vor der Operation. HINWEIS: In diesem Protokoll verwenden postnatalen Tag 10 bis 12 (P10-12) FVB Mäusen. Unterschiedlichen Alters und Mäusestämme können verwendet werden, um die Bedürfnisse einer bestimmten Projekt zu erfüllen. Mäuse älter als P40 kann eine Herausforderung sein, weil die Bulla Knochen wird härter. </li><li> Anesthetize die Mäuse intraperitoneale Injektion einer Mischung von Ketamin-Hydrochlorid (100 mg / kg), Xylazinhydrochlorid (10 mg / kg) und Acepromazin (2 mg / kg). Beginnen chirurgische Vorbereitung erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. Wo notwendigy, zu verwalten eine Auffrischimpfung (ein Fünftel der ursprünglichen Dosis) des Anästhetikums Cocktail, um das ursprüngliche Anästhesieebene wiederherzustellen. HINWEIS: Achten Sie darauf, bei diesem Schritt, weil die meisten der in diesem Alter beobachtet Sterblichkeit durch Narkoseüberdosierung verursacht. </li><li> Bedeckung Augen des Tieres mit einer Schutzaugensalbe, die Augen während der Anästhesie feucht zu halten, unterdrückt Lidschlusseflexes des Tieres. </li><li> Bewegen Sie die Maus mit Hals auf einem Heizkissen während des gesamten Verfahrens verlängert, bis die Maus ganz wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. </li><li> Rasieren Sie die links nach Ohrregion mit einer Schneidemaschine und Desinfektion mit 70% Ethanol und PVP-Jod vor der chirurgischen Manipulation. </li></ol> 2. Chirurgisches Verfahren und Vector Injection <ol><li> Verwenden Sie einen Post-Ohrenansatz, um die Bulla tympanica aussetzen. Inzision das subkutane Gewebe mit einer kleinen Schere, um die Post-Ohrmuskel aussetzen. Nach dem Zurückziehen des Fettgewebes zu the posterioren Seite des Einschnitts, trennen die Muskeln, um die rechte und linke Seite senkrecht zum Einschnitt, um die zeitliche Knochen freizulegen. Stellen Sie sicher, dass dieser Schnitt ist lang genug, um bequem mit ausreichender Visualisierung zu arbeiten. </li><li> Perforieren die Bulla tympanica mit einer 25 G-Nadel und erweitern Sie das Loch bei Bedarf mit einer Zange durch Abziehen der Knochen zurück, um Zugang zum basalen Windung der Cochlea zu ermöglichen, und dann erweitern ausreichend, um das Steigbügel Arterie und die Rundfenstermembran zu visualisieren (RWM) . </li><li> Punktion der RWM sanft in der Mitte mit einem Borosilikat Kapillarpipette. Beachten Flüssigkeit Ausfluss durch die RWM an dieser Stelle; das ist normal. Warten Sie, bis die Auslauf stabilisiert hat (die effluxed Flüssigkeit aus der Cochlea ist mit einem sterilen Filterpapier getrocknet). HINWEIS: Achten Sie beim Halten und Vorschieben der Glasnadel, so dass der RWM Perforation ist so klein wie möglich. Abhängig von dem Mikroskop verwendet wird, halten die Pipetten mit Hilfe eines Mikromanipulators oder von Hand mit einer PipetteHalter. </li><li> Bereiten Sie die Pipetten für die Injektion mit einer Pipette Abzieher die gleiche Weise Patch-Clamp-Pipetten werden vorbereitet. Sicherzustellen, dass der Kopfkreisdurchmesser groß ist (etwa 15 &amp; mgr; m im Durchmesser), so dass Pipettieren des Virus in die und aus leicht gemacht. </li><li> Erstellen Sie 1-2 ul AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP oder AAV2-GFP in eine Injektionspipette. Nachdem der Ausfluß stabilisiert (5 bis 10 min), microinject diese feste Volumen in die Scala tympani durch das gleiche Loch zuvor in RWM hergestellt. </li><li> Verschließen Sie den RW Nische schnell nach dem Herausziehen der Pipette mit einem kleinen Stecker des Muskel- und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Gewebekleber auf den Muskel platziert, um ein Auslaufen aus dem runden Fenster zu vermeiden. HINWEIS: Verschließen Sie das Loch sehr gut, nachdem die Nadel mit einem kleinen Stecker des Muskel entfernt, um jede Leckage aus Perilymphe der Cochlea-diesem Schritt verhindern, ist entscheidend für die Anhörung zu bewahren. Nicht versiegeln komplett die RWM in Hörverlust im Laufe der Zeit führen. </li><li> Nach der Injektion decken dieLoch im Gehör Bulla mit Fettgewebe, geben die Post-Ohrmuskulatur und Fettgewebe in ihre normale Position und Naht der Wunde in Schichten mit einer 6-0 oder kleiner Chrom resorbierbaren Nahtmaterial. </li><li> Desinfizieren Sie die Wunde mit PVP-Jod. </li></ol> 3. Postoperative Behandlung <ol><li> Zeigen Mäuse in einem warmen Käfig und lassen Sie sie nicht unbeaufsichtigt, bis sie sich vollständig erholt, dann verschieben Sie sie zurück mit der Mutter. Es wird empfohlen, die männliche aus dem Käfig, bevor die Welpen wieder mit der Mutter entfernen. </li><li> Verwalten subkutane Carprofen (2 mg / kg) zur Analgesie postoperativ und jeder 24 Stunden danach für 3 Tage, um Entzündung und Schmerz zu verwalten. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Not, abnorme Gewichtsverlust, Schmerzen oder Infektionen. Allgemein mit der 3. Tag nach der Operation alle Mäuse normalerweise handeln. Falls irgendwelche Anzeichen von Leiden oder Krankheiten werden in einer Maus nach dem 3. Tag, sollten euthanizing ter Maus nach den Richtlinien des Instituts. </li></ol> 4. Bewertung der Cochlear Funktion Folgende Viral Lieferung Mit Hirnstammaudiometrie (ABR) Aufnahmen HINWEIS: Die akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) ist ein akustisch evozierte Potenzial aus der laufenden elektrischen Aktivität im Gehirn extrahiert und über Elektroden unter der Kopfhaut platziert aufgezeichnet. Das Tier wird mit Ton stimuliert. Die resultierende Aufzeichnung besteht aus fünf Wellen, die die elektrische Aktivität des aufeinanderfolgenden Punkten in der Hörbahn in den ersten 10 ms nach Beginn eines auditorischen Reizes zu reflektieren. <ol><li> Anesthetize Mäusen durch intraperitoneale Injektion eines Gemisches von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen in der gesamten Hörtest bis die Maus ist völlig wach, um Post-Anästhesie Unterkühlung zu verhindern. HINWEIS:die folgenden Klangreize in diesem Experiment: klicken (5 ms Dauer; 31 Hz Präsentation Rate). </li><li> Zeigen subdermale Nadelelektroden an der Spitze, unter der Ohrmuschel des linken Ohrs (Referenz), und unter dem Gegenohr (Masse) und starten Sie die Aufnahme ABRs wie zuvor in einer schalldichten Kammer 27,28 beschrieben. Nehmen ABR-Wellenformen in 5 Intervallen unten von maximalen Amplitude dB Schalldruckpegel. </li><li> Bestimmen ABR Schwellen postoperativ bereits 4 Tage nach der viralen Lieferung HINWEIS: Threshold wird als die niedrigste Reizniveau, bei dem die Antwortpeaks für Wellen definiert I-V waren eindeutig und wiederholt auf Sichtkontrolle vor. </li><li> Messen Welle I, um die Aktivität des Cochlea-Nervs analysieren. Die niedrigste Anregungspegel, der ein nachweisbares ABR-Wellenform liefert als Schwellwert definiert. </li></ol> 5. Cochlear Transgene Proteinexpression mittels Immunfluoreszenz <ol><li> Anesthetize Mäuse durch eine Überdosis intraperitoneal Injektion einer Mischung von Ketaminhydrochlorid und Xylazinhydrochlorid, wie in Abschnitt 1.2 dieses Protokoll beschrieben, nur ohne Acepromazin. </li><li> Enthaupten den Kopf erst nach dem Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize, wie Spur Prise. </li><li> Präparieren Sie die cochleae heraus und Verfahren für ganze-mount Immunfluoreszenz wie beschrieben 26. Ein detailliertes Protokoll Cochlea ganze Montage Immunfluoreszenz unter Verwendung von Anti-VGLUT3 und Anti-Myosin Antikörper 7a in Akil et al., 2013 29 beschrieben. </li><li> Für GFP-Markierungen, brüten die Cochlea Ganz Halterungen über Nacht bei 4 ° C mit einem Kaninchen-Anti-GFP-Antikörper bei 1: 250-Verdünnung. </li><li> Zweimal Spülen der Cochlea für 10 min mit PBS gewaschen und dann für 2 Stunden inkubieren in Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert Cy2, verdünnt 1: 4.000 in PBS. </li><li> Zweimal spülen cochleae mit PBS für 10 Minuten inkubieren sie mit DAPI für 15 min. </li><li> Montieren Sie den cochleae auf Glasobjektträgern und beobachten under ein Mikroskop mit konfokaler Immunfluoreszenz. </li></ol>

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M., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li><li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain.">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

In dieser Arbeit beschreiben wir im Detail eine Technik, die für Cochlea-Gentherapie eingesetzt werden können, mit dem Ziel der Wiederherstellung oder der Rettung normaler Gehörfunktion, die durch einen genetischen Defekt beeinträchtigt ist. Da es in der Regel atraumatisch ist, ist dieser Ansatz sicher für Cochlea-Gentransfer oder andere potenzielle molekulare Therapien 30. Andere Ansätze für Cochlea-Therapie beschrieben worden, einschließlich eines Bauchansatz 24, Cochleostomie 31,32 und Saccus Liefer 33 in der Maus und Meerschweinchen. Nach unserer Erfahrung ist die post-Ohrenansatz schneller, einfacher und mit reduzierten Verletzungen und Tier Mortalität. Darüber hinaus bietet die Post-Ohrenansatz verbesserte Visualisierung des RWM mit weniger Chancen, Trauma und die damit verbundenen Verlust des Gehörs 34,35,36. Dieser Bericht dokumentiert die technischen Aspekte und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie durch den Nachweis der Lieferung AAV1-VGLUT3 umge Innenohr über die RWM, was zu transgenen Expression von sowohl VGLUT3 und GFP (Abbildung 1 und Abbildung 2 und 3A) und Gehörrettungs in diesem Mausmodell der angeborenen Hörverlust. Frühere Studien, die Verfahren für den Gentransfer zeigten nur geringe transgene Expression in kritischen Bereichen des Corti-Organ 12,37,38,39,40,41. Diese Unterschiede können aufgrund der Qualität des Viruspräparats, der Titer des viralen Vektors, Serotyp verwendet oder einfach unzureichend virale Abgabe in die Cochlea sein. Im Gegensatz dazu, mit dieser Post-Ohrenansatz konnten wir sehr gut Transfektionsraten beide inneren und äußeren Haarzellen und den Vertrieb eines Reportergens (GFP) nach AAV2-GFP Transfektion (Abbildung 2 und Abbildung 3 A) in der gesamten Cochlea erhalten. Auf der Grundlage der Anteil der IHZ mit AAV1-VGLUT3 (3B) transfiziert, empfehlen wir, dass die Transfektion über RWM ist effektive und einheitlich durch den gesamten Cochlea als andere Methoden, einschließlich der in der Meerschweinchen, die höher Transfektionsraten in der basalen Windung, in der Nähe der Stelle des Virusanwendung 42 berichtet beschrieben. Die langfristige Expression des GFP / VGLUT3 in der Cochlea, für mindestens ein Jahr und eine Hälfte, die mit Daten aus anderen Tiermodellen und verschiedene Organsysteme 38,43 erhalten. Zusätzlich histologische Analyse der transfizierten Cochlea zeigte keine Anzeichen einer Entzündungsreaktion, mit ausgezeichneter Erhaltung der Zellarchitektur des Organes der Corti, einschließlich der Stria vascularis und Corti&#39;-Ganglionneuronen 26. Weiterhin, im Gegensatz zu Verfahren, die eine Cochleostomie eingesetzt, die RWM Transfektion in der vorliegenden Studie verwendete nicht verursacht Cochlea Schäden und höhere Mengen konnten injiziert 31,32 werden. Mangelnde Trauma unter Verwendung dieser Technik wurde durch den Nachweis äquivalente ABR thresho verifiziertlds zwischen Betrieb und Steuerung Ohren, ein Befund ähnlich dem von Xia gesehen et al. 4 schließlich AAV-VGLUT3 Auslieferung über die RWM führte ABR Schwellen, die der von WT-Mäusen (4A und 4B) 26 gesehen. Wir haben diese Technik in allen Altersgruppen von Mäusen verwendet, aber es ist technisch anspruchsvoll bei Mäusen, die älter als P40, weil die Bulla Knochen wird schwieriger zu durchbohren und die gebrochenen Knochen aus der Bulla ist schärfer bei älteren als bei jüngeren Mäusen. Im höheren Alter kann, wenn Vorsicht nicht genommen Blutungen auftreten, wenn ein Stück der Bulla Knochen zerreißt den Hals Gewebe. Abschließend dokumentiert dieser Bericht erfolgreiche Gentransfer in verschiedene Arten von Cochlea-Zellen in der Maus mit einem AAV-basierten Vektor, wie oben gezeigt wurde. Diese Technik der Genübertragung minimiert Trauma, nicht zu Gehörschäden führen und kann weitverbreitet Transfektion einer Vielzahl von Zelltypen in der Cochlea, inc führenLuding Haarzellen und Spiralganglienneuronen. Es hat ein großes Potenzial Anwendung für andere Arten von angeborenen und erworbenen Formen von Hörverlust, und könnte auch auf eine Vielzahl von molekularen Therapien in Mausmodellen von Hörverlust angewendet werden.

Die Gentherapie ist seit langem als mögliche Behandlung für genetische Schwerhörigkeit vorgeschlagen worden, aber der Erfolg in diesem Bereich schwer zu 1 blieb. Bisher wurden viral vermittelten Methoden aufgrund der theoretischen Möglichkeit, bestimmte Zelltypen innerhalb des relativ unzugänglich Cochlea gezielt überwogen. Beide Adenovirus (AV) und Adeno-assoziierten Virus (AAV) wurden für Cochlea-Genübertragung verwendet. AAVs sind vorteilhaft in der Cochlea für eine Reihe von Gründen. Sie sind replikationsdefizienten Viren und effizient transgenen Moleküle zu übertragen, um verschiedene Zelltypen, einschließlich Neuronen, ein wichtiges Ziel für eine Reihe von Ursachen für Hörverlust. AAV Eintritt in die Zelle durch spezifische Rezeptoren vermittelt 2; Somit muss die Wahl eines bestimmten Serotyps kompatibel sein mit den Zelltypen zu transduzieren. AAVs effektiv transfizieren Haarzellen 3 und enthalten in das Wirtsgenom, was zu einer stabilen, langfristige Expression des transgenic Protein und phänotypische Veränderungen in der Zelle 4. Obwohl nicht unbedingt für kurzfristige Anwendungen wie Haarzellenregeneration vorteilhaft, eine langfristige Expression für stabile Rettung von genetischen Defekten sehr wichtig. Da AAVs sind nicht mit einem menschlichen Krankheit oder Infektion assoziiert und zeigen keine Ototoxizität 5,6,7, sind sie ein idealer Kandidat für den Einsatz in der Gentherapie für vererbte Formen von Hörverlust 8. Transfer von exogenem genetischen Material in den Säugetierinnenohr mittels viraler Vektoren ist im letzten Jahrzehnt untersucht und ist als vielversprechende Methode zur Behandlung von sowohl genetische und erworbene Formen von Hörverlust 9 entstehen. Die Cochlea ist potentiell ein ideales Ziel für die Gentherapie aus mehreren Gründen: 1) seines kleinen Volumens eine begrenzte Menge des Virus notwendig erfordert; 2) ihre relative Isolierung von anderen Organsystemen Grenzen Nebenwirkungen; und 3) ihre fluidgefüllten Kammern erleichtern viralenLieferung in ganz Labyrinth 10, 11,12,13,14, 15. Mausmodelle für angeborene Taubheit ermöglichen den Einsatz von vielen Methoden der Untersuchung der Entwicklung des Innenohrs in einem systematischen, replizierbar Weise überwachen. Während die geringe Größe der Maus cochleae nicht präsentieren einige chirurgische Schwierigkeit dient die Maus als ein äußerst wichtiges Modell in der Studie der genetischen Hörverlust, mit mehreren experimentellen Vorteile gegenüber anderen Arten 16. Mausmodelle ermöglichen Einschätzung einer Reihe von Eigenschaften durch genetische Kopplungsanalyse, Sammlung von detaillierten morphologischen Beobachtungen und Simulation pathogenen Szenarien; als solche sind sie gute Kandidaten für die viral vermittelten Gentherapie. Umfangreiche genetische Studien an Mäusen in Kombination mit technologischen Fortschritte haben es möglich gemacht, gentechnisch veränderten Mäusen reproduzierbar über Labors 17,18, 19, 20,21 erzeugt. Furthermore, gibt es zahlreiche Modelle für sowohl erworbene und vererbte Schwerhörigkeit Phänotypen bei Mäusen, so dass strenge Tests in diesem Tiermodell 22, 23,24. So korrigieren Anhörung mit viral vermittelten Gentherapie in einem Mausmodell ist eine geeignete erste Schritt bei der Suche nach einem Heilmittel für Erkrankungen des Menschen. Wir haben bereits gezeigt, dass transgene Mäuse, denen vesikulären Glutamattransporter 3 (VGLUT3) werden taub geboren wegen des Mangels an Glutamatfreisetzung an der IHC Bandsynapse 25. Da diese Mutation nicht auf eine Primär Degeneration der Haarsinneszellen führen, sind diese mutierten Mäusen möglicherweise ein ausgezeichnetes Modell, in der Cochlea Gentherapie für angeborene Hörverlust testen. Bisher wurde eine Reihe von viralen Abgabetechniken für Cochlea Gentherapie beschrieben wurden, einschließlich runden Fenstermembran Diffusion runde Fenstermembran Injektion und Abgabe über einen Cochleostomie. Es gibt starkeial Vor- und Nachteile von jedem dieser Ansätze 9. Hier berichten wir über eine chirurgische Methode für viral vermittelte Genübertragung auf die VGLUT3 KO Maus Innenohr durch die Rundfenstermembran (RWM). Die Post-Ohr RWM-Einspritzverfahren ist minimal-invasiv mit ausgezeichneten Anhörung Erhaltung und ist relativ schnell. Wie wir bereits veröffentlicht, in dem Bemühen, wiederhergestellt in diesem Mausmodell Gehör ein AAV1 Vektor, der das Gen VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) in die Cochlea dieser taub Mäusen am postnatalen Tag 12 eingeführt (P! @), Was die Wiederherstellung des Gehör 26. Anhörung im VGLUT3 KO-Mäusen wurde von akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) überprüft, während transgene Protein-Expression wurde mittels Immunfluoreszenz (IF) überprüft. Diese Methodik somit zeigt, dass viral-vermittelte Gentherapie kann einen genetischen Defekt, die ansonsten Ergebnisse würden in Taubheit zu korrigieren.

<table><tbody><tr><td>Ketamine</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carprofen analgesia</td><td>Provided by UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25G needle</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate capillary pipette</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Suture PDS*plus Antibacterial</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Tissue glue (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-GFP antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Flaming/ Brown Micropipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puller Model P-97&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TDT BioSig III System&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;Tucker-Davis Technologies</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

surgical method for virally mediated gene delivery to the mouse inner ear through the round window membrane

Die Gentherapie, verwendet werden, um die funktionelle Erholung von Innenohrschwerhörigkeit zu erreichen, verspricht besseres Verständnis der zugrunde liegenden molekularen und genetischen Mechanismen, die zu Gehörverlust zur Folge gewähren. Einführung von Vektoren in das Innenohr sind in einer Weise, die weit verteilt das Agens durch die Cochlea und minimiert eine Schädigung der bestehenden Strukturen erfolgen. Diese Handschrift beschreibt eine postOhr chirurgischen Ansatz, der für Maus Cochlea-Therapie mit molekular, pharmakologischen und virale Lieferung an Mäusen postnatalen Tag 10 Jahren über die Rundfenstermembran (RWM) verwendet werden kann. Diese chirurgischen Ansatz ermöglicht die schnelle und direkte Lieferung in die Scala tympani und minimiert den Blutverlust und die Vermeidung von Tiersterblichkeit. Diese Technik beinhaltet vernachlässigbare oder keine Schäden an wesentlichen Strukturen des inneren und des Mittelohres und Nackenmuskulatur, während hundert Erhaltung Anhörung. Um die Wirksamkeit dieser chirurgischen Technik wird der vesikulären glutam demonstrierenaß transporter 3 Knockout (VGLUT3 KO) Mäusen wird als ein Beispiel von einem Mausmodell für angeborene Taubheit, die Erholungsfähigkeit nach Abgabe VGLUT3 zum inneren Ohres unter Verwendung eines adeno-assoziierten Virus (AAV-1) verwendet werden.

Um die technischen Merkmale und die Nützlichkeit der Post-Ohrenansatz für Cochlea molekularen Therapie zu verifizieren, wurden AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP und AAV2-GFP in P10-12 Mäuse Innenohr über die RWM geliefert. Dieser Ansatz zeigt erfolgreiche Expression des Transgens im inneren Haarzellen (IHC) (VGLUT3 Abbildung 1 und Abbildung 2 GFP und GFP 3A), äußeren Haarzellen (OHC) (GFP Abbildung 2) und Stützzellen (GFP Abbildung 2 und Abbildung 3 A) 26 ohne nennens Corti-Organ Verletzungen. Die Beobachtung der verschiedenen Zelltypen, die GFP in den cochleären ganze Montage Immunofluoreszenz Bilder (Abbildung 2 und Abbildung 3A) gesehen zeigt, dass die Wahl des AAV Serotyp müssen die Zelltypen zu transduzieren kompatibel sein. Figur 1, Figur 2 und 3A 26 zeigen eine sehr gute transfection in beiden IHZ und OHC sowie Verteilung des Transgens Protein (GFP / VGLUT3) in der gesamten Cochlea nach AAV1 oder AAV2-GFP oder AAV1-VGLUT3 Transfektion. Die Verteilung IHCs exprimieren VGLUT3 nach AAV1-VGLUT3 Transfektion (3B) 26 zeigt, dass die Transfektion mittels der RWM ist effektiver und gleichmäßiger über die gesamte Schnecke als andere Verfahren, die eine höhere Transfektion Raten näher an der Stelle des viralen Abgabe berichtet. Wir haben gefunden, dass die Transfektion Raten kann effizienter durch Erhöhung des Volumens des Virus in das Innenohr eingespritzt (Figur 1) 26 erfolgen. Unsere Beobachtung erfolgreicher VGLUT3 Ausdruck in VGLUT3 KO-Maus IHC ohne Cochlea Schäden führte uns zu testen, durch Messung ABRs in der geretteten KO-Mäusen zu hören. 4A und 4B 26 Dokument die Fähigkeit der post-Ohr RWM Lieferung AAV1-VGLUT3 in der Innen ear der VGLUT3 KO-Mäuse zu erzeugen hören Rettungs in diesem Mausmodell der angeborenen Hörverlust. Hirnstammaudiometrie (ABR) Spuren wurden im VGLUT3 gerettet KO (4A) wiederhergestellt, und die ABR Schwellen waren messbar und vergleichbar mit denen in Wildtyp-Mäusen (4B) zu sehen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig1highres.jpg" /> Abb. 1: VGLUT3 IHC Transfektion nach RWM virale Lieferung an P10-P12 KO-Mäusen Die transfizierte cochleae wurden bei P30 durch Immunfluoreszenz mit Anti-MYO7A Antikörper, ein Haar-Zell-Marker, und einen Antikörper gegen VGLUT3 sucht. MYO7A und VGLUT3 wurden in allen IHC nur im WT exprimiert, während IHC von KO-Mäusen ausgedrückt nur MYO7A. Die geretteten Maus cochleae zeigte einige IHC Ausdruck VGLUT3 und alle IHC ausgedrückt MYO7A (Zeile 3) IHC:. Inneren Haarzellen. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von26. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52187/52187fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: Maus Cochlea ganze-mount Immunfluoreszenz nach RWM AAV2-GFP Lieferung an Wildtyp-P10-P12 Mäusen AAV2-GFP wurde verwendet, um virale Lieferung zu bewerten mit dem Post-Ohrenansatz der Maus Cochlea.. AAV2-GFP wurde bei Lieferung P10-12 getan und transgene GFP-Expression in der Cochlea bei P21 unter Verwendung eines anti-GFP-Antikörper untersucht. GFP-Expression (grün) in WT-Mäusen Cochlea ganze-mount zeigen stärkere GFP-Expression in äußeren Haarzellen (OHC) als inneren Haarzellen (IHC). <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52187/52187fig3highres.jpg" /> Abbildung 3: Maus coc<html> hlear ganze-mount Immunfluoreszenz nach RWM AAV1-GFP Lieferung an Wildtyp-P10-P12 Mäusen. Nach AAV1-GFP-Lieferung an der Cochlea Expression von GFP in inneren Haarzellen (IHC) und Stützzellen (A), aber nicht OHCs gesehen , während AAV1-VGLUT3 Lieferung an die Cochlea des VGLUT3 KO-Mäusen (B) führte VGLUT3 Expression lediglich in IHZ. Die Anzahl der IHCs exprimieren VGLUT3 VGLUT3 im KO Mäusen Cochlea nach AAV1-VGLUT3 Anlieferung hängt von der Menge des Virus in das Innenohr zugeführt wird; beispielsweise 40% der IHCs ausgedrückt VGLUT3 bei 0,6 ul des Virus injiziert wurde, während 100% der IHCs ausgedrückt VGLUT3 nach 1 ul des Virus geliefert wurde. Es gab keinen Unterschied in VGLUT3 Expression zwischen dem Scheitelpunkt, Mitte wiederum oder Base, als 0,6 &amp; mgr; l Virus injiziert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von 26. g &quot;/&gt; . Abbildung 4: akustisch evozierte Hirnstamm (ABR) Bewertungs Vertreter ABR-Wellenformen nach AAV1-VGLUT3 Lieferung waren zwischen gerettet und Wildtyp-Mäusen; im Gegensatz dazu wurden keine ABR-Wellenformen in KO-Mäuse (A) gesehen. Gerettet KO Mäuse zeigten auch messbare ABR Schwellen. Diese ABR Schwellenwerte waren vergleichbar mit denen in WT-Mäusen für alle Frequenzen gemessen (B) gesehen. I:. ABR Welle I. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von 26 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52187/52187fig4large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

surgical-method-for-virally-mediated-gene-delivery-to-mouse-inner-ear

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.4K Aufrufe.  University of California, San Francisco. The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane. 

Serie: Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Canalostomy As a Surgical Approach to Local Drug Delivery into the Inner Ears of Adult and Neonatal Mice

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) has been shown to be a useful approach to local drug delivery into the inner ear. The goal of this article is to describe, in detail, the surgical techniques involved in canalostomy in both adult and neonatal mice. As indicated by fast-green dye and adeno-associated virus serotype 8 with the green fluorescent protein gene, the canalostomy facilitated broad distribution of injected reagents in the cochlea and vestibular end-organs with minimal damage to hearing and vestibular function. The surgery was successfully implemented in both adult and neonatal mice; indeed, multiple surgeries could be performed if required. In conclusion, canalostomy is an effective and safe approach to drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice and may be used to treat human inner ear diseases in the future.

Here we describe canalostomy procedure which allows local drug delivery into the inner ears of adult and neonatal mice through the semicircular canal with minimum damage to hearing and vestibular function. This method can be used to inoculate viral vectors, pharmaceuticals, and small molecules into the mouse inner ear.

Canalostomy als ein chirurgisches Vorgehen zu Local Drug Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen

Local delivery of therapeutic drugs into the inner ear is a promising therapy for inner ear diseases. Injection through semicircular canals (canalostomy) ...

Genetik

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gentransfer an sich entwickelnden Maus Innenohr<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Elektroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Neurowissenschaften

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central nervous system. We demonstrate a stereotaxic injection technique that allows targeted gene expression or silencing in the dorsal horn of the mouse spinal cord. The surgical procedure is brief. It requires laminectomy of a single vertebra, providing for quick recovery of the animal and unimpaired motility of the spine. Controlled injection of a small vector suspension volume at low speed and use of a microsyringe with beveled glass cannula minimize the tissue lesion. The local immune response to the vector depends on the intrinsic properties of the virus employed; in our experience, it is minor and short-lived when a recombinant adeno-associated virus is used. A reporter gene such as enhanced green fluorescent protein facilitates monitoring spatial distribution of the vector, and the efficacy and cellular specificity of the transfection.

Viral vectors allow for targeted gene manipulation. We demonstrate a method for conditional gene expression or ablation in the mouse spinal cord, using stereotaxic injection of a viral vector into the dorsal horn, a prominent site of synaptic contact between primary somatosensory afferents and neurons of the central nervous system.

Stereotaktische Injektion eines viralen Vektors für Conditional Gene Manipulation im Maus-Rückenmark

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Direkte Visualisierung der Murine Rücken Cochlear Nucleus für optogenetische Stimulation der Hörbahn

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.

Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.

Limbus-Ansatz-Subretinale Injektion von viralen Vektoren für die Gentherapie bei Mäusen Retinapigmentepithel

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Die Maus Round-Fenster-Ansatz für Ototoxische Agent-Lieferung: eine schnelle und zuverlässige Technik zur Induktion Cochlear Zelldegeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medizin

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset (Callithrix jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small, easy-to-handle New World monkey which has a similar anatomy of the temporal bone, including the middle ear ossicular chains and inner ear to humans, than in comparison with that of rodents. Here, we report a reproducible, safe, and rational surgical approach to the cochlear round window niche for the drug delivery to the inner ear of the common marmoset. We adopted posterior tympanotomy, a procedure used clinically in human surgery, to avoid manipulation of the tympanic membrane that may cause conductive hearing loss. This surgical procedure did not lead to any significant hearing loss. This approach was possible due to the large bulla structure of the common marmoset, although the lateral semicircular canal and vertical portion of the facial nerve should be carefully considered. This surgical method allows us to perform the safe and accurate administration of drugs without hearing loss, which is of great importance in obtaining pre-clinical proof of concept for translational research.

A Surgical Procedure for the Administration of Drugs to the Inner Ear in a Non-Human Primate Common Marmoset Callithrix jacchus

We report a surgical method to administrate drugs to the inner ear of a non-human primate, the common marmoset (Callithrix jacchus), via the round window membrane.

Ein chirurgischer Eingriff für die Verwaltung der Medikamente an das Innenohr in eine nicht-menschliche Primaten Weißbüschelaffe (Callithrix Jacchus)

Hearing research has long been facilitated by rodent models, although in some diseases, human symptoms cannot be recapitulated. The common marmoset ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Posterior Semicircular Canal Ansatz für Innenohr-gen Lieferung in Neugeborenen Maus

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. The first procedure consists of perforation of the tympanic bulla, termed bullostomy; the second one is a transtympanic injection. Both emulate human clinical intratympanic procedures.
Chitosan-glycerophosphate (CGP) and Ringer&#180;s Lactate buffer (RL) were used as biocompatible vehicles for local drug delivery. CGP is a nontoxic biodegradable polymer widely used in pharmaceutical applications. It is a viscous liquid at RT&#160;but it congeals to a semi solid phase at body temperature. RL is an isotonic solution used for intravenous administrations in humans. A small volume of this vehicle is precisely placed on the Round Window (RW) niche by means of a bullostomy. A transtympanic injection fills the middle ear and allows less control but broader access to the inner ear.
The safety profiles of both techniques were studied and compared by using functional and morphological tests. Hearing was evaluated by registering the Auditory Brainstem Response (ABR) before and several times after microsurgery. The cytoarchitecture and preservation level of cochlear structures were studied by conventional histological techniques in paraformaldehyde-fixed and decalcified cochlear samples. In parallel, unfixed cochlear samples were taken and immediately frozen to analyze gene expression profiles of inflammatory markers by quantitative Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR).
Both procedures are suitable as drug delivery methods into the mouse middle ear, although transtympanic injection proved to be less invasive compared to bullostomy.

A Comparative Study of Drug Delivery Methods Targeted to the Mouse Inner Ear: Bullostomy Versus Transtympanic Injection

Two microsurgery approaches for local drug delivery to the inner ear are described here and compared in terms of impact on hearing parameters, cochlear cytoarchitecture and expression of inflammatory markers.

Eine vergleichende Studie von Drug-Delivery-Methoden Gezielte an die Maus Inner Ear: Bullostomy<em&gt; Versus</em&gt; Transtympanale Injection

We present two minimally invasive microsurgical techniques in rodents for specific drug delivery into the middle ear so that it may reach the inner ear. ...

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Zusammenfassung

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