The authors have nothing to disclose.

Alle Verfahren und Verhaltenstests wurden von MacEwan University Animal Research Ethics Board unter Protokollnummer 06-11-12, die nicht im Einklang mit dem kanadischen Rat für Richtlinien Animal Care ist für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren ist genehmigt. 1. Bereiten Dosierbehälter, Lösungen und Applikationsplan <ol><li> Bereiten Sie eine Verabreichungsschema, so dass die Tiere in der gleichen Umgebung und während der gleichen Zeit des Tages, um alle verwechselt der Zeit oder Vorspann auf visuelle Reize zu vermeiden dosiert. </li><li> Zu erhalten, wie viele identische, 1,5 L, klare Polypropylen Laichbehältern für die Anzahl der Gruppengrößen wie nötig. Verwenden Sie Gruppen von 8 Fischen pro Behälter, die für 2 Gruppen von Fischen erlaubt, pro Tag später im Verfahren geprüft werden (siehe Schritt 3). Verwenden Sie eine Haltetank und ein Dosierbehälter pro Gruppe (2x Gesamtzahl der Gruppen). <ol><li> Zeigen 400 um Laich Einsätze in allen Haltetanks. Fill die Tanks mit Lebensraum Wasser oder Umkehrosmosewasser bei der richtigen Temperatur (für Zebrafisch, 25-28 ° C), die im Einklang mit der Temperatur Fisch ist in der Regel bei untergebracht. HINWEIS: Es können unerwünschte chemische Wechselwirkungen zwischen einigen Drogen und die chemischen Komponenten der gepufferten Lebensraum Wasser sein. In dieser Situation verwenden Umkehrosmose mit minimalen oder keinen Aquarium Salze zur Verabreichung des Arzneimittels gepuffert, als auch für die Kontrollgruppen. </li><li> Sicherzustellen, daß die Behälter in einer neutralen Umgebung Anlage Fisch externe visuelle Reize bei der Dosierung zu vermeiden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Medikamentenlösung. Mischen Sie die entsprechende Menge des Arzneimittels mit Lebensraum Wasser in den Laichbehältern. Bereiten Sie die 0,2% ige Ethanollösung durch die Kombination von 3 ml einer hochgradigen Ethanol (95% nicht denaturierten Ethanol) mit 1497 ml Wasser. Vorbereitung der 1,4% igen Ethanollösung durch Kombinieren von 21 ml Ethanol mit 1,479 ml Wasser. </li></ol> 2. Netting Fische und Ethanol Verwaltungsordnung <ol><li> Sorgfältig Netto Fische aus ihrem Lebensraum Tanks und Überführung in die entsprechenden Vorratstank, der die Laicheinsatz. Idealerweise beherbergen die Fische in der Laich Einlage zusammen beseitigen Netting. </li><li> Mit aller Fische in ihren jeweiligen Haltetanks, heben die Laicheinsatz aus dem Auffangbehälter und legen Sie sie in den entsprechenden Tank Wirkstofflösung (Abbildung 1A). <ol><li> Notieren Sie die Dosierzeit nach Bedarf. Verwenden 30 min in der Ethanol-Lösung für das hier beschriebene Verfahren. </li><li> Wenn möglich, haben Assistenten helfen bei der Übertragung aller Versuchsgruppen auf die Arzneimittellösung gleichzeitig auf eine genaue Dosierung zu gewährleisten. Alternativ übertragen eine Gruppe zu einem Zeitpunkt und zu verfolgen, einzelne Gruppen &#39;Dosierzeiten (Abbildung 1A). </li></ol></li><li> Am Ende der erforderlichen Dosierungsperiode, entfernen Sie den Fisch aus der Ethanollösung durch vorsichtiges Anheben des Laicheinsatzaus der Wirkstofflösung und Platzierung sanft zurück in den Vorratsbehälter. </li><li> Sanft Netto die Fische in den Haltetanks und legen Sie sie zurück in ihren Lebensräumen bis zum nächsten geplanten Dosierung Zeit, oder legen Sie das Laich einfügen zurück in den Vorratsbehälter zu Netting beseitigen. </li><li> Wie vorher, wenn möglich innerhalb der Parameter der Tierhaltungsgeräte, Haus die Tiere in demselben Tank und Laicheinsatz, der als Haltetank verwendet wird erwähnt. Dies wird zusammen beseitigen während der Verwaltungsverfahren Netting. </li></ol> 3. Behavioral Testing <ol><li> Besorgen Sie sich eine hell / dunkel-Arena 9,5 cm breit und 55 cm lang und 9,5 cm tief mit einem weißen wasserdichten Boden (Abbildung 1B). Bringen weiß und schwarz wasserdicht entspiegeltes Papier an den Innenwänden der Arena mit Klettverschluss, mit der Hälfte der Arena abgedeckt in weiß und halb in schwarz abgedeckt. Füllen Sie die Arena zu einer Tiefe von 5 cm mit Lebensraum Wasser mit einer Temperatur von 25-28 ° C. Maintain diese Temperatur während des Tests. </li><li> Minimalize externe visuelle Reize, indem er eine weiße dreiseitigen Gehäuse für die Arena in entfernt werden. Stellen Sie sicher, das Testgebiet hat diffundieren Deckenbeleuchtung, die nicht Reflexionen auf der Wasseroberfläche hervorruft, noch ausreichend hell für die Bewegung Tracking-Software, oder senden -hoc manuelle Quantifizierung von Videobildern. </li><li> Legen Sie die Arena in das Gehäuse und setzen Sie die Aufzeichnung und Bewegungsanalyseparameter des Verhaltens-Tracking-Software. Legen Sie die Testdauer auf 5-15 min, je nach Fragestellung. HINWEIS: Hier verwendeten wir 5 min. </li><li> Transportieren Sie die Gruppe der Fische auf den Forschungsbereich in den Lebensraum Tank getestet werden und legen Sie sie außerhalb der Arena Gehäuse. Akklimatisieren Sie den Fisch für 10 min. </li><li> Sanft Netto ein Fisch aus der entsprechenden Gruppe und in der Mitte der Hell / Dunkel-Arena, wobei Sie auf den Fisch zu lösen, wenn sie parallel zu der langen Achse der Arena positioniert, um AVOid Vorspannen der Fisch auf den hellen oder dunklen Zone. </li><li> Starten Sie die Aufnahme Verhalten sofort nachdem das Tier losgelassen wird. Achten Sie auf jegliche Softwareprobleme bei der Verfolgung der Fisch oder für Fische springen oder Gefrieren. Drehen der Arena 180 ° nach der Hälfte der Probanden wurden getestet, alle verwechselt zu verhindern wegen Verzerrungen, die sich aus dem Ende der Arena wird zum offenen Ende des Gehäuses ausgerichtet ist. </li><li> Nach Ablauf der Test hat, sanft net beendet und entfernen Sie den Fisch aus der Arena in einen Vorratstank oder Lebensraum Tank. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Untersuchen Zeit in Licht verbrachte gegen Dunkelzonen. Für jede Gruppe und jeden Fisch, erhalten die relative Zeit in den hellen und dunklen Zonen verbracht und zu analysieren, mit einem eine Probe t-Test (oder Wilcoxon-Test für nicht-parametrische Daten; Unterschied (die Hälfte der gesamten Probezeit) 150 sec) zu ermitteln, ob Gruppen ein Bereich über den anderen deutlich bevorzugen. </li><li> Um Einstellungen zu vergleichen, berechnen preferenzIndex durch Subtrahieren der Zeit entsprechend der Zone von der Zeit, in der dunklen Zone aufgewendet und vergleichen Unterschiede zwischen den Gruppen. t- Tests können verwendet werden, um zwei Gruppen zu vergleichen. Vergleichen Sie mehrere Gruppen mit einer Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten). </li><li> Vergleichen Geschwindigkeit, Anzahl der Zonenübergänge, mäandernden, und Unbeweglichkeit in Gruppen. Verwenden Sie Einwegvarianzanalyse unter Verwendung von Tukey HSD post hoc Test, wo notwendig (oder Kruskal-Wallis-Test mit Dunn-Mehrfachvergleichs post hoc Test für nicht-parametrische Daten). </li></ol>

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Die Autoren danken Joshua Gallup für die Verwendung seiner Fotoausrüstung 1 verwendet wird. Diese Arbeit wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council (NSERC) Kanada Entdeckung Zuschuss (bis TJH) unterstützt.

Vorherige Studien mit Medikamentenverabreichung im Zebrafisch haben einfach auf Netting Fische, um sie aus ihrer Heimat Tank in der Arzneimittellösung 12,16 transportieren verlassen. Netting ist nicht immer konsistent und dauert oft länger als aufgrund der Fluchtreaktion der Zebrafisch, die erhebliche individuelle Variabilität hat erwartet. Traditionelle Methoden der Übertragung, während nützlich, können auf durch Verringern der Menge der Gesamtzeit der Fisch außerhalb des Wassers zu verbringen, als auch die Verringerung der Menge der Veränderlichkeit der Übertragungszeit zwischen den Tieren verbessert werden. Zusätzlich zur Verbesserung der Funktionalität, gibt diese Methode Forscher die Fähigkeit, große Fischgruppen gleichzeitig in einer Lösung für eine präzise Zeitmenge zu dosieren. Bisherige Verfahren erfordern entweder Dosierung einer einzigen Fisch, oder der Versuch, Fischgruppen gleichzeitig net Ganzes. Ersteres ist langsam und verringert den Durchsatz, während das letztere ist eine unangenehme und schwierige Aufgabe. Weiterhin bewegungs Tracking-Systeme, ceine Beurteilung des Verhaltens mehrerer Fische auf einmal von der Genauigkeit dieses Verfahrens profitieren. Fisch könnte direkt aus dem Laich Einsatzes in den Schwarm Arena, die in der Nähe von gleichzeitiger Einwirkung der Arena für alle Fische sicherstellen würde übertragen werden. Mit Hilfe dieser neuen Methode signifikante Ergebnisse, wenn sie auf drei Gruppen von Zebrafisch über einen Zeitraum von 21 Tagen durchgeführt. Kontrollfische erhielten kein Alkohol, täglich moderate Fisch erhielt eine kleine Menge Alkohol einmal pro Tag, und Wochen-binge Fisch erhielt eine große Dosis Alkohol einmal pro Woche über den Zeitraum von 21 Tagen. In der Hell / Dunkel-Aufgabe, die Dosierung Verfahren nicht den normalen Präferenz des Zebrafisch für die dunkle Zone unter Kontrollbedingungen zu ändern. , Nach 2 Tagen Ethanolentzug, Zebrafisch in der täglichen moderaten Gruppe bevorzugt jedoch die Lichtzone der Arena, eine Umkehr der Präferenz. Die statistische Analyse bestätigt eine signifikante Veränderung der Zonenpräferenz. Es ist möglich, dass die Dosierung proceduRe in Ethanol sucht Verhalten aufgrund einer konditionierten Platzpräferenz (CPP), mit dem Fisch sucht Ethanol (ein appetitive Reiz), und lieber die weiße Zone aufgrund seiner relativen Ähnlichkeit mit dem hellen Dosierung Bereich geführt. Jüngste Forschungsergebnisse zeigen, dass CPP kann im Zebrafisch und in Gebieten auftreten, wo Zebrafisch werden mit Ethanol 17,18 dosiert. Wöchentliche Binge-Fische zeigten keine Präferenz 2 Tage nach Ethanol, und obwohl Beweise über neuronale Mechanismen Bilanzierung von dieser Erkenntnis fehlt, ist es möglich, dass selten, aber hohe Dosen von Alkohol kann das Gehirn schädigen, möglicherweise verlassen Fische nicht zwischen den Zonen zu unterscheiden. Ein weiterer Vorteil, dass diese Dosierungsverfahren verleiht Forscher ist ihre Verallgemeinerbarkeit. Wie beschrieben, erzeugt das Verfahren klar und nützliche Ergebnisse im Zebrafisch. Jedoch ist das Verfahren nicht nur auf Zebrafisch beschränkt. Die Einschränkungen über das Verfahren sind für die Größe und Grenzen der Dosierungsbehälter, Tiere und Testi bezogenenng Vorrichtung, sowie die Fähigkeit, Daten zu analysieren. Mit der Verwendung von Motion-Tracking-Software, haben neuere Studien viele zusätzliche Variablen während eines Probesucht. Weiß Vermeidung Gewöhnung, Plätze gekreuzt, Fortbewegung Gewöhnung, Latenz auf die weiße Zone, erratische Schwimmen, Thigmotaxis (Zeit in der Nähe der Arena Mauern verbracht) und Risikobewertung kann auch quantifiziert 14 werden. Es ist denkbar, dieses Verfahren in anderen Modellorganismen wie Goldfischen, die bisher verwendet wurden, um die Rolle von Toleranz und Entzugs 19 untersuchen zu verwenden. Forscher hoffen, die Auswirkungen von anderen pharmakologischen Mitteln oder Umweltgifte zu untersuchen, die Verwendung von anderen Verhaltenstests oder andere Meeres- oder Süßwassertiere, könnte auch nutzen diese grundlegende Methodik. Mit diesem Protokoll ist einfach und effektiv. Allerdings, wenn die Ergebnisse nicht wie erwartet, sollten Problembehandlung der Bewegungsverfolgungssystem, um eine ordnungsgemäße Datenerfassung zu gewährleisten. Tracking sollte glatt und präzise über die Studien sein. Das Tracking-System sollte die Aufzeichnung der Bewegung des Körpermitte des Fisches zu allen Zeiten. Alle Springen oder erratische Bewegung der Spur dot aufgrund visuelle Artefakte wie Lichtreflexe auf dem Wasser Wellen, oder unsachgemäße Tracking-Einstellungen können die Ergebnisse zu verwechseln. Einige Unstimmigkeiten in Ergebnisse können von kleinen Unterschieden in der Arena Design oder Dosierung Umgebungen entstehen. Um sicher zu der Replikation sein, sollte die Arena als beschrieben werden, insbesondere im Hinblick auf Verwendung eines weißen Boden, um Tracking Effizienz im Zebrafisch zu maximieren. Bei anderen Fischen, die in der Farbe heller sind, sollte ein dunkler Boden verwendet werden, um in Motion-Tracking zu unterstützen. In ähnlicher Weise ist die Dosierung der Fische in einer Umgebung, die frei von visuellen Reizen, die möglicherweise vorspannen kann der Fisch ist extrem wichtig. Jede unterschiedliche Farbe, Muster oder Farbe, die wahrnehmbar ist, um den Fisch könnte Ergebnisse zu verwechseln. Eine neutrale, helle Hintergrund ähnlich wie in dem Gehäusesystem empfohlen. &lt;/ P&gt; Während es möglich ist, diese Methode für andere Fischarten nach Bedarf zu ändern, können die Ergebnisse in Bezug auf die angeborenen Hell / Dunkel-Präferenz 20-21 variieren. Es ist auch wichtig zu beachten, auch die hier beschriebene Vorgehensweise immer noch verursacht einigen Stress. Obwohl Netting wird deutlich reduziert, das Verfahren immer noch mit einem sehr kurzen Zeitraum, wo die Fische müssen aus dem Wasser zu sein, möglicherweise eine Stressantwort induziert wird. Ramsay und Kollegen festgestellt, dass 22 saldierten Zebrafisch im Vergleich zu denen, die nicht verrechnet wurden, hatten mindestens das Doppelte der Cortisolspiegel in ihrem Körper. Da Cortisol ist ein Hormon, um Stress 11 verknüpft dies die Verhaltensreaktion, die gemessen wird, zu ändern. Während unsere Methode reduziert Netting, bedeutet es nicht beseitigen. , Gibt es aber Forschern die Möglichkeit, die Häufigkeit von Netting zu beseitigen, wenn sie wünschen, durch Gehäusezebrafisch in den Laich Einsätze. Zukünftige Studien sollten untersuchen, ob die Nutzung des Laich Insert für den Transfer von Fischen können die Stress-Reaktion in Bezug auf Netting verringern. Darüber hinaus ist es von entscheidender Bedeutung, um eine genaue Dosierung Zeiten zu erhalten und Transferzeiten zwischen den Gruppen. Änderungen der Dosierung Zeiten oder große Unterschiede in der Zeit aus dem Wasser verbracht könnten Ergebnisse verändern. Mögliche zirkadianen Wirkung zu reduzieren, ist es auch wichtig, den Fisch während ähnliche Tageszeiten dosieren. Im aktuellen Experiment Fische wurden dosiert und von 10.00 bis 14.00 Uhr getestet. Genaue und zuverlässige Replikation dieses Verfahrens beruht auf Wiederholung des Protokolls mit Präzision.

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein kleines Knochenfisch-Arten mit Ursprung in Indien, die eine sinnvolle Modellorganismus für Verhaltens 1 und medizinischen Forschung 2,3 ist. Zebrafische sind auch häufig bei der Prüfung von verschiedenen pharmakologischen Substanzen eingesetzt, um deren Auswirkungen auf das Verhalten zu charakterisieren. Verschiedenen Dosierungen und Zeitpläne der Arzneimittelverabreichung verwendet worden, um das Verhalten der Zebrafisch nach der Verabreichung von Verbindungen, wie Stimulanzien 4, Anxiolytika 5 und Ethanol 6-8 zu untersuchen. Unser Labor hat die Auswirkungen der unterschiedlichen Zeitpläne der Ethanol-Administration an Zebrafischen Angst und Fortbewegung in der gut validierten Hell / Dunkel-Assay 9, 20, auch gemeinhin als scototaxic Assay bezeichnet sucht. Eine neue Methode der Ethanol-Verabreichung wurden entwickelt, um die Effizienz für wiederholte tägliche Verabreichung über einen langen Zeitraum (21 Tage) 6 zu erhöhen </sup&gt;. Bisher verwendete Methoden waren praktisch, allerdings haben wir versucht, eine Methode, die Netting reduziert, mit den damit verbundenen Einmalkosten entwickeln und erlaubt die gleichzeitige, zeitgenaue Verabreichung des Arzneimittels von Interesse, eine große Anzahl von Fischen. In der traditionellen Forschung mit Ethanol, Zebrafisch saldiert und von einem Tank zum anderen, die die geeignete Mischung aus Ethanol und Wasser 10-12 übertragen. Während diese Methode ist weitgehend akzeptiert, kann Netting Zebrafisch die Variabilität in der Zeit, die die Einführung und entfernen Sie den Fisch aus der Wirkstofflösung zu erhöhen. Daher kann die genaue Exposition gegenüber der Verbindung von Interesse im Verlauf eines Experiments mit wiederholter Dosierung variieren. Eine Methode, die Fehlerquellen die sich aus Schwankungen der Transportzeiten reduziert ist daher wünschenswert. Mit unserer Methode können wir alle Fische gleichzeitig zu bewegen, was zu identischen Dosierung Zeit in jedem Fisch. Nach Ethanolexposition (hier beschrieben), können Zebrafisch in jeder numbe getestet werdenr von Verhaltenstests, einschließlich derjenigen, die Angst zu bewerten. Dosierungsgruppen von Fischen mit der neuen Methode hat praktische Anwendungen jenseits der Fähigkeit, genau zu replizieren und zu standardisieren Dosierung zwischen Subjekten und zwischen Gruppen von Fischen. Das Aufkommen der neuen Software, die für die Verfolgung mehrerer Fisch ermöglicht auf einmal sehen können Forscher nutzen unsere Methoden, um Reproduzierbarkeit und Genauigkeit in ihren Experimenten zu gewährleisten. Angesichts der weit verbreiteten Einsatz von Zebrafisch als Modellorganismus für Behavioral Neuroscience, wird diese Methode Effizienz und Praktikabilität in Zukunft pharmakologische Studien zu erhöhen. Im vorliegenden Paradigma wurde eine wiederholte Dosierungsschema verwendet, dass etwa spiegelt menschliche Trinkpläne. Anlage, täglicher-mäßig oder Wochen-Binge: Die Fische wurden randomisiert einer von drei Gruppen zugeordnet. Das Dosierungsschema war 21 Tage in der Dauer, gewählt, weil es deutlich Belichtungszeiten in früheren Studien 7 überschritten. Kontrollfische erhielten Null alcohol, erhielten täglich mäßiger Fisch 0,2% Alkohol einmal pro Tag, und Wochen-binge Fische erhielten 1,4% Alkohol einmal pro Woche. Der Hell / Dunkel Aufgabe wurde verwendet, um Angst nach 2 Tagen Widerrufs beurteilen. Dies ist ein relativ einfacher Test, um zu verwalten, welche einen rechteckigen Arena, in der die Wände auf einer Seite weiß und auf der anderen Seite sind dunkel 9 verwendet. Erwachsenen Zebrafisch lieber robust die dunkle Seite der Arena unter Kontrollbedingungen 6,9,13. Erhöhte Angst operational als deutlich mehr Zeit in der dunklen Zone verbracht definiert und verminderte Angst kann davon ausgegangen, wenn die Fische relativ mehr Zeit in der Lichtzone verbracht verbringt werden. Mit bewegungs Tracking-Software können auch andere informative Variablen auch quantifiziert werden, einschließlich Durchschnittsgeschwindigkeit, Immobilität, mäandernden und Zonenübergänge 14. Die in unserem Labor entwickelt Dosierverfahren kann zu jeder Forschungs in denen wasserlösliche Verbindungen sind, eine oder mehrere zebrafi verabreicht geltensh. Viele andere pharmakologische Mittel, die von dieser Methode profitieren können, sind derzeit im Zebrafisch getestet. Häufigsten getesteten Verbindungen umfassen Nikotin, Chlordiazepoxid, Buspiron und Scopolamin, die in ähnlicher Weise wie in Ethanol gelöst; durch Vermischen der geeigneten Menge der Chemikalie in Wasser. Deshalb ist die allgemeine Aufgabe der vorliegenden Verfahren viel breiter und nicht beschränkt auf Ethanol. Außerdem nach der Gabe von Medikamenten für mehrere Tage, ist die Hell / Dunkel-Aufgabe nur eine von vielen Verhaltenstests, die eingesetzt werden könnten. Nach Verabreichung des Arzneimittels oder bei der Entnahme, anderen beliebten Assays, die verwendet werden können, gehören die neuartigen Tank Tauchtest 15 und Tests des Sozialverhaltens wie shoaling 16. Das folgende Verfahren wird ein effizientes Verfahren zum wiederholten Übertragung Fischgruppen oder einzelne Fische in Lösungen, die eine pharmakologische Verbindung von Interesse zu skizzieren. Zusätzlich wird der Prozess der Prüfung Angst mit der Hell / Dunkel-Testin Gruppen von Fischen, die, nachdem sie lange Listen der Alkoholverwaltung ausgesetzt, der zur Rücknahme sind, beschrieben.

<table><tbody><tr><td>Three shelf benchtop housing system</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/research-systems/z-hab-system/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.5 L Spawning tank w/400 &amp;mu;m baffle</td><td><a href="http://aquatichabitats.com/consumables/tanks-lids-and-baffles/info/nursery-tank-and-baffles/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Aquatic Habitats</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pure Grain Ethanol</td><td><a href="http://www.luxco.com/brands/vodka-neutral-spirits-neutral-spirits-everclear" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Luxco, INC</a></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ethovision XT Motion tracking software</td><td><a href="http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Noldus Information Technology</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td><a href="http://eshop.eppendorf.ca/categories/1" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Eppendorf Canada</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light/Dark Arena</td><td>Custom</td><td></td><td>Construct as per procedure description. 9.5 cm wide, 9.5 cm deep, 55 cm long.</td></tr></tbody></table>

a novel method of drug administration to multiple zebrafish (danio rerio) and the quantification of withdrawal

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely netted and transported between home aquaria and dosing tanks. In order to enhance the ease of compound administration, a novel method for transferring fish between tanks for drug administration was developed. Inserts that are designed for spawning were used to transfer groups of fish into the drug solution, allowing accurate dosing of all fish in the group. This increases the precision and efficiency of dosing, which becomes very important in long schedules of repeated drug administration. We implemented this procedure for use in a study examining the behavior of zebrafish in the light/dark test after administering ethanol with differing 21 day schedules. In fish exposed to daily-moderate amounts of alcohol there was a significant difference in location preference after 2 days of withdrawal when compared to the control group. However, a significant difference in location preference in a group exposed to weekly-binge administration was not observed. 
This protocol can be generalized for use with all types of compounds that are water-soluble and may be used in any situation when the behavior of fish during or after long schedules of drug administration is being examined. The light/dark test is also a valuable method of assessing withdrawal-induced changes in anxiety.

Um die Genauigkeit und die Steuerung in pharmakologischen Studien mit Zebrafisch ist es wichtig, wenn die Dauer der Verabreichung Ethanol konsequent und genau wie oben beschrieben erhalten. Unsere Vorgehensweise kann die Leichtigkeit und den Durchsatz des Dosierungsverfahren zu erhöhen. Die Verabreichung von Ethanol auf entweder eine wöchentliche-binge oder täglich mäßiger Plan führte zu veränderten Angst Ebenen, mit der Hell / Dunkel-Test gemessen, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wenn zwei Tage nach der letzten Dosierung getestet, Zebrafisch in der Kontrollgruppe (wer keinen Alkohol erhalten, waren aber noch zu Dosieren Tanks bewegt) angezeigt das erwartete Muster des Verhaltens, mit Kontrollfische Ausgaben deutlich mehr Zeit auf der dunklen Seite der Arena ( 2A) ähnlich naive Zebrafisch in anderen Studien 6,9,13. Fisch in der Wochen Binge-Gruppe zeigte keine Präferenz für entweder die helle oder dunkle Zonen in der Aufgabe bei der Prüfung zwei Tage nach ihrem letzten Ethanol Verwaltung (2B </strong&gt;). Interessanterweise Fisch im täglichen moderaten Gruppe signifikant bevorzugt die helle Seite der Arena (2C); im Gegensatz zu der Kontrollgruppe. Die Präferenz-Index zeigte einen signifikanten Unterschied zwischen den Kontroll- und tägliche moderate Gruppen (Figur 2D). Es gab keine signifikanten Unterschiede in der Schwimmgeschwindigkeit oder Unbeweglichkeit in Gruppen (Tabelle 1), und daher war dieser Effekt nicht auf eine motorische Defizite in den Fisch. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51851/51851fig1highres.jpg" /> Abb. 1: Übertragungsverfahren und die Hell / Dunkel-Arena Diese Fotos zeigen die Übertragungsverfahren (A) Zuerst werden die Fische in der Transferbehälter (links) entfernt.. Dosierbehälter Ethanol enthält, wird im Bild (rechts). (BC) Verschieben Sie den Fisch aus der Übertragung Tank zur Ethanollösung erfordert die researcher um die Laich Einsatz aus dem Transferbehälter und in den Tank der Ethanollösung zu heben. (d) der Hell / Dunkel-Arena, wie dargestellt, 9,5 cm breit und 9,5 cm tief und 55 cm lang gemessen. Weiß Böden verwendet wird, zusammen mit schwarzen Wänden auf der Hälfte der Arena (links) und weiße Wände auf der anderen Hälfte, die Schaffung eines hellen und dunklen Zone. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51851/51851fig2display.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse und trackplots Ethanol Dosierungsverfahren auf drei Gruppen von Zebrafisch nach 2 Tage Widerrufsrecht. (A) Ein Vertreter trackplot eines einzigen Steuerzebrafisch Bewegungsbahn im ganzen 5 Minuten Licht / Dunkel-Studie. Unten ist der gleiche Zebrafisch trackplot als Heatmap, die eine farbige Darstellung der Zebrafisch Bewegung in der ganzen Studie ist, bezogen auf die Zeit in der Lage von jedem Pixel dargestellt der Fisch verbrachte vertreten. (B) A Representative trackplot eines einzigen Zebrafisch von der Wochen-Binge-Gruppe in der gesamten 5 Minuten Licht / Dunkel Aufgabe. Unten ist die Heatmap aus demselben Zebrafisch. (C) Ein Vertreter trackplot einer einzigen täglichen moderaten Zebrafisch Bewegung in der ganzen 5 Minuten Licht / Dunkel-Studie. Unten ist die Heatmap aus demselben Zebrafisch. (D) Die Präferenz-Index wurde für alle Gruppen durch Subtraktion der Zeit angesichts Zone von Zeit in der dunklen Zone verbracht verbracht berechnet. Negative Zahlen zeigen Vorliebe für die dunkle Zone. Positive Zahlen zeigen Vorliebe für die Lichtzone. Die Ergebnisse zeigen einen signifikanten Unterschied in Präferenz zwischen Kontrolle und tägliche moderate Gruppen bei 2 Tage Widerrufsrecht * p &lt;0,05 (one-way ANOVA). Hinweis: Es gibt auch eine signifikante Präferenz für dunkle in der Kontrollgruppe, p &lt;0,05 (eine Probe t-Test, differenz von 0) und eine signifikante Präferenz für Licht im täglichen moderate Gruppe, p &lt;0,05 (eine Probe &lt;em&gt; t-Test, Differenz 0). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51851/51851fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="21"><td height="43" rowspan="2" style="height:42px;width:125px;"></td><td style="width:89px;"> Geschwindigkeit </td><td style="width:100px;"> Immobilität </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:89px;"> (Cm / sec) </td><td style="width:100px;"> (Sec) </td></tr><tr height="42"><td height="42" style="height:43px;width:125px;"></td><td style="width:89px;"> 2-Tage Wd </td><td style="width:100px;"> 2-Tage Wd </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Kontrolle (n = 13) </td><td style="width:89px;"> 9,1 ± 0,6 </td><td style="width:100px;"> 1,9 ± 0,6 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Binge (n = 14) </td><td style="width:89px;"> 9,8 ± 0,5 </td><td style="width:100px;"> 0,8 ± 0,2 </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;width:125px;"> Chronische (n = 15) </td><td style="width:89px;"> 10,3 ± 0,5 </td><td style="width:100px;"> 2,5 ± 1,0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Durchschnittliche Geschwindigkeit und Unbeweglichkeit während der Hell / Dunkel-Test. Die durchschnittliche Schwimmgeschwindigkeit (cm / s) und Unbeweglichkeit (sec) einer repräsentativen Gruppe von Zebrafisch nach 2 Tagen Widerrufs (Mittelwert ± SEM). Hier keine signifikanten Unterschiede in beiden Geschwindigkeit oder Unbeweglichkeit gefunden. Verwendet mit Erlaubnis von Holcombe et al., (2013).

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A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish Danio rerio and the Quantification of Withdrawal

A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Eine neue Methode der Drug Administration auf mehrere Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Und die Quantifizierung der Widerrufs

Anxiety testing in zebrafish is often studied in combination with the application of pharmacological substances. In these studies, fish are routinely ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish (Danio rerio) and the Quantification of Withdrawal

12.1K Aufrufe.  MacEwan University. A novel method for reducing variability when exposing fish to drugs is explained. Fish exposed to various patterns of ethanol exposure were found to have altered anxiety levels during withdrawal in a light/dark scototaxic assay.

Serie: A Novel Method of Drug Administration to Multiple Zebrafish Danio rerio and the Quantification of Withdrawal

Behavioral Approaches to Studying Innate Stress in Zebrafish

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of stress-related diseases and psychiatric disorders, yet further studies into the genetic and neuronal regulation of stress are still required to develop better therapeutics. The zebrafish provides a powerful genetic model to investigate the neural underpinnings of stress, as there exists a large collection of mutant and transgenic lines. Moreover, pharmacology can easily be applied to zebrafish, as most drugs can be added directly to water. We describe here the use of the 'novel tank test' as a method to study innate stress responses in zebrafish, and demonstrate how potential anxiolytic drugs can be validated using the assay. The method can easily be coupled with zebrafish lines harboring genetic mutations, or those in which transgenic approaches for manipulating precise neural circuits are used. The assay can also be used in other fish models. Together, the described protocol should facilitate the adoption of this simple assay to other laboratories.

This manuscript describes a simple method to measure stress behaviorally in adult zebrafish. The approach takes advantage of the innate tendency that zebrafish prefer the bottom half of a tank when in a stressful state. We also describe methods for coupling the assay with pharmacology.

Verhaltensweisen für den Studierenz-Stress in Zebrafischen

Responding appropriately to stressful stimuli is essential for survival of an organism. Extensive research has been done on a wide spectrum of ...

Forschung

Verhalten

Optimized Intravenous Injection in Adult Zebrafish

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in mammalian research models. However, its application in adult zebrafish for drug delivery, stem cell transplantation, and regenerative and cancer studies has been limited due to the challenges posed by their small body size and intricate blood vessels. To overcome these limitations, alternative injection techniques such as intracardiac and retro-orbital (RO) injection have been explored in the past for stem cell transplantation in adult zebrafish. However, these techniques have their drawbacks, including the need for meticulous injection techniques or increased risk of mortality.
In this study, we have developed a refined and optimized IV injection procedure specifically tailored to adult zebrafish, addressing the challenges associated with their unique anatomy. To demonstrate the effectiveness of this technique, we performed successful IV injections of whole kidney marrow cells from Tg(mpo: EGFP) fish and FITC-dextran dye into adult Casper fish. The subsequent visualization of injected cells and dyes using a fluorescence microscope confirmed their successful delivery and engraftment within the zebrafish. Furthermore, we demonstrated that compared with the intracardiac and RO injections, the IV injection resulted in improved survival rates and engraftment efficiency in treated zebrafish. This approach enables precise delivery and localization of substances and holds great potential for large-scale drug and chemical screening using adult zebrafish. Additionally, the ability to visually track the injected cells and dyes provides invaluable insights into their engraftment, migration, and interactions with host tissues, enabling a more comprehensive evaluation of therapeutic effects and biological processes in zebrafish models.

Here, we present an optimized and effective protocol for the intravenous injection of cells or pharmacological agents into adult zebrafish, resulting in enhanced cell engraftment and increased survival rates of the treated zebrafish.

Optimierte intravenöse Injektion bei adulten Zebrafischen

Intravenous (IV) injection is widely recognized as the most effective and commonly utilized method for achieving systemic delivery of substances in ...

Krebsforschung

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

Orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch: ein Modell für die Bewertung der intestinalen Aufnahme von bioaktiven Substanzen

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water ...

Immunologie und Infektion

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging Adult Zebrafisch

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Biologie

Rapid Evaluation of Toxicity of Chemical Compounds Using Zebrafish Embryos

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has transparent embryos and rapid external development. Zebrafish embryos can, therefore, also be used for the rapid evaluation of toxicity of the drugs that are precious and available in small quantities. In the present article, a method for the efficient screening of the toxicity of chemical compounds using 1-5-day post fertilization embryos is described. The embryos are monitored by stereomicroscope to investigate the phenotypic defects caused by the exposure to different concentrations of compounds. Half-maximal lethal concentrations (LC50) of the compounds are also determined. The present study required 3-6 mg of an inhibitor compound, and the whole experiment takes about 8-10 h to be completed by an individual in a laboratory having basic facilities. The current protocol is suitable for testing any compound to identify intolerable toxic or off-target effects of the compound in the early phase of drug discovery and to detect subtle toxic effects that may be missed in the cell culture or other animal models. The method reduces procedural delays and costs of drug development.

Zebrafish embryos are used for evaluating the toxicity of chemical compounds. They develop externally and are sensitive to chemicals, allowing detection of subtle phenotypic changes. The experiment only requires a small amount of compound, which is directly added to the plate containing embryos, making the testing system efficient and cost-effective.

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

The zebrafish is a widely used vertebrate model organism for the disease and phenotype-based drug discovery. The zebrafish generates many offspring, has ...

Medizin

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Verhaltenstestbatterie zur Bewertung neurotoxischer Wirkungen bei adulten Zebrafischen

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autor im Rampenlicht: Bewertung umwelt- und arzneimittelinduzierter Verhaltensänderungen bei adulten Zebrafischen 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. ...

Neurowissenschaften

High-throughput Measurement of Gut Transit Time Using Larval Zebrafish

Zebrafish are used as alternative model organisms for drug safety testing. The gastrointestinal (GI) tract of zebrafish has genetic, neuronal, and pharmacological similarities to that of the mammals. GI intolerance during clinical testing of drug candidates is common and may pose a serious threat to human health. Testing for GI toxicity in preclinical mammalian models can be expensive in terms of time, test compound, and labor. The high-throughput method presented here may be used to predict GI safety issues. Compared to mammalian models, this method allows for more expedient assessment of test compound effects on GI transit while using low quantities of compound. In this method, larval zebrafish (7 days post fertilization) are fed food containing a fluorescent label. After feeding, each larval fish is placed into a well of a 96-conical-bottom-well plate and dosed with test compound (dissolved in water) or the vehicle. As gut transit occurs, fecal matter accumulates on the bottom of the wells, and the rate at which this happens is monitored by measuring fluorescence from the bottom of the well repeatedly over time using a plate spectrophotometer. The fluorescence from larvae in a given treatment group are averaged and these values are graphed along with standard error, for each measurement time, yielding a curve representing average transit of food over time. Effects on gut transit time are identified by comparing the area under the curve for each treatment group to that of the vehicle-treated group. This method detected changes in zebrafish GI transit time induced by drugs with known clinical GI effects; it can be employed to interrogate dozens of treatments for GI effects per day. As such, safer compounds can be quickly prioritized for mammalian testing, which expedites discovery and proffers 3Rs advancement.

The goal of this protocol is to measure the transit time of fluorescently labeled food through the gut of larval zebrafish in a high throughput fashion.

Eine neue Methode der Drug Administration auf mehrere Zebrafisch (

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Verhaltensweisen für den Studierenz-Stress in Zebrafischen

Optimierte intravenöse Injektion bei adulten Zebrafischen

Orale Intubation Erwachsenen Zebrafisch: ein Modell für die Bewertung der intestinalen Aufnahme von bioaktiven Substanzen

Gavaging Adult Zebrafisch

Schnelle Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen

Hochdurchsatz-

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Bewertung der Neurotoxizität bei erwachsenem Danio rerio mit einer Reihe von Verhaltenstests in einem einzigen Tank

Hochdurchsatz-Messung der Darm Transitzeit mit Larven Zebrafisch