Name: microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery
Uploaded: 2014-08-07T20:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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Diese Arbeit wird von der Rowland Junior Fellow-Programm unterstützt. Die Autoren möchten Dankbarkeit für die Wissenschaftler und Mitarbeiter des Rowland Institute der Harvard auszudrücken: Chris Stokes für seine Hilfe bei der Entwicklung der kundenspezifischen, computergestützte Druckregelung Setup, Diane Schaak, Ph.D. für ihren Beitrag für die biologische Probenhandhabung, Winfield Hill für die Entwicklung der elektrischen Einrichtung, Alavaro Sanchez, Ph.D. für den Zugang zum Durchflusszytometer, Scott Bevis, Kenny Rogers und Don Spencer für die Bearbeitung von mechanischen Komponenten für die Sanitär-Druck-Setup erforderlich Gewährung. Mikrofluidik-Meister wurden am Zentrum für Nanoscale Systems (ZNS) an der Harvard University hergestellt.

1. Zellpräparation <ol><li> Platte 1 × 10 5 Zellen / ml von metastatischen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 in einem Volumen von 10 ml pro Gewebekultur T75-Kolben in Leibovitz L-15-Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. </li><li> Inkubieren MDA-MB-231-Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C bei 0% CO 2-Umgebung. </li><li> Ernten der Zellen für Experimente 2 Tage nach der Saat, indem man die Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA für 2 min und Inaktivierung der enzymatischen Aktivität von Trypsin durch Zugabe von 8 ml Wachstumsmedium. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 200 × g und Resuspendieren in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS, 1x, ohne Ca 2 + und Mg 2 +) zu einer Endkonzentration von 5 × 10 5 Zellen / ml. </li></ol> 2. Geräte Konstruktion und Herstellung HINWEIS: Die Maske, Masterform Erfindungen und dieMikrokanal umschließenden Verfahren sind in einem Reinraum durchgeführt, während die Polydimethylsiloxan (PDMS) Mikro Gießverfahren auf einem normalen Labortisch durchgeführt werden kann. <ol><li> Entwerfen Sie ein Mikrofluidik-Gerät wie in Abbildung 1 veranschaulicht mit AutoCAD. Die Vorrichtung sollte aus einem Einlass mit mehreren Einspritzöffnungen, Grobfilter und zwei parallelen geraden rechtwinkligen Trägheitsfokussierungskanäle bestehen (L = 7 mm, W = 40 um und H = 70 um). Einzelnen geraden Kanal besteht aus 5 Elektroporation Kammern, die platziert werden 800 um auseinander (W C = 400 um) mit zwei über Löcher für Aluminiumelektroden. Zwei in Querrichtung benachbarten Elektroporation Kammern teilen die Bohrung für die negative Elektrode. Zwei gerade Kanäle gehen in einem Auslaß an dem stromabwärts gelegenen Bereich der Elektroporation. </li><li> Konvertieren Sie die CAD-Datei mit Mikrogefüge zu einer GDSII-Datei mit LinkCAD. Schreiben Sie die Mikro-Muster auf einem 5 &quot;x 5&quot; Photomaskenrohlingmit einem Laser-Maskenschreiber. Entwickeln Sie die Maske durch folgende Protokoll des Herstellers. HINWEIS: Die Maske Entwicklungsprozess umfasst Fotolackentwicklung, Chrom Ätzen und Lackentfernen. Alternativ Mikromuster auf einem hochauflösenden Transparenz gedruckt (&gt; 20.000 dpi) kann von einem Dritten Hersteller gekauft werden und als Photomaske verwendet. Endgültige Mikromerkmale auf einer Photomaske sollte transparent, um die Polarität eines negativen Photoresist-Spiel. </li><li> Herstellung der Gussform des Gerätedesign mit Standardsoftlithographie-Techniken 23 mit einem negativen Photoresist gesponnen Mantel auf einem 4-Zoll-Silizium-Wafer bei 2.000 Umdrehungen pro Minute, um die endgültige Dicke von 70 um haben. </li><li> Vorbacken des Wafers mit Negativlack für 20 Minuten bei 95 ° C aufweist. </li><li> Kontaktieren Sie die Maske mit dem Wafer und setzen auf eine UV-Quelle (17,4 mJ / cm 2) für 80 Sekunden mit einem Mask Aligner. </li><li> Entwicklung des belichteten Wafers für 4 min in einer SU-8-Entwickler. </li><li> Messen Sie dieentwickelten Photolackdicke mit einem Profilometer Oberfläche. </li><li> Rigoros mischen Sie einen 10: 1-Verhältnis von Elastomer-Härter (Silikon-Elastomer-Kit) und gießen Sie die Mischung auf der Gussform zu PDMS Repliken zu generieren. Entgast Gießelastomer für 30 min und Aushärten der Gussform mit entgastem Elastomer in einem Ofen bei 70 ° C für 2 Stunden. </li><li> Ablösen geheilt PDMS-Nachbildung mit Mikrokanalmuster aus der Form und Stanzlöcher für Buchten, Steckdose und Elektrodeninsertionen mit einem Schraubstock. HINWEIS: Die normale Schneidendurchmesser des Stiftes Schraubstock sollte 0,76 mm, geeignet für fest an Ort und Stelle hält PEEK-Schlauch (Außendurchmesser von 1/32 &quot;) und Aluminium-Elektroden (OD von 0,029&quot;) sein. </li><li> Erstellen geschlossenen mikrofluidischen Kanälen durch Kleben PDMS Replikate auf einem Glasobjektträger in einer Sauerstoff-Plasmareiniger für 7 Sekunden lang bei einer Hochfrequenzleistung und einem Sauerstoffpartialdruck von 75 W und 500 mTorr sind. </li></ol> 3. Durchflussversuche <ol><li> EinsatzAluminiumelektroden (0,029 &quot;OD) und einem Auslass PEEK-Schlauch (1/32&quot; OD) in bestimmten Orten über Löcher in den Mikrokanal (siehe Bild 3b). </li><li> Schließen Sie die elektrische Ausrüstung zur Erzeugung von Hochspannungs kurzen Rechteckimpulsen zu den Aluminiumelektroden 18 verantwortlich (siehe Abbildung 3C), die in Kontakt mit fließenden Lösungen in der PDMS-Form sind. HINWEIS: Die Ausrüstung sollte aus einem Impulsgenerator und einer In-Haus gebaut Hochspannungsverstärker bestehen 18. </li><li> Planen vier 50 ml Zentrifugenröhrchen einzeln DPBS enthaltenden Lösungen mit Zellen und Biomolekülen und befestigen jedes Rohr mit seinem jeweiligen Ampullenhalter zum pneumatischen Durchflusssteuerungssystem verbunden sind (siehe 3A). 18 </li><li> Verbinden Einlass PEEK-Kapillare auf den Flaschenhalter in die jeweiligen Einlaßöffnungen in der mikrofluidischen Vorrichtung. </li><li> Stellen Sie die Grße der Rechteckimpulse, V, 100 V, um die elektrische FIE habenld Stärke, E = V / L e, über die Elektroporationskammer äquivalent zu 0,7 kV / cm. HINWEIS: Hier ist L E der Abstand zwischen zwei Punkten, wo die positiven und negativen Elektroden in Kontakt mit der fließenden Lösung sind (siehe Abbildung 1). </li><li> Stellen Sie den Druckregler auf 40 psi. 18 Eine einzelne manuell einstellbar Stickstoffquelle wird verwendet, um gleichmäßig Druck alle Probenfläschchen und eine High-Speed-Verteiler genutzt, um rechtzeitig aktivieren individuelle Lösung Ports mit der kundenspezifischen Software LabVIEW: Hinweis. </li><li> Für die Ventilsteuerung, öffnen Sie die maßgeschneiderte Software LabVIEW markiert Ventil Runner, und klicken Sie auf Run im Dropdown-Menü mit dem Titel arbeiten. </li><li> Schalten Sie Ventile, indem Sie auf jedem entsprechenden Ventil-Symbol. HINWEIS: Das Ventil Symbol wird grün, wenn es aktiviert wird. Ein Klick auf die aktive Symbol deaktivieren und das Ventil schließen. Das geschlossene Ventil Symbol sollte grau. </li><li> Öffnen Sie das Ventil für die DPBS Behälter (dh., Waschlösung) an Minister der Strömungsgeschwindigkeit für stabile Zell-Trapping Wirbelbildung erforderlich für 1,5 min. </li><li> Umschalten der aktiven Lösung Port aus der Waschlösung zu der Zelllösung zu stoppen Zellen in der Elektroporation Kammer 30 s (dh die Zellfangschritt). </li><li> Fließen sowohl Wasch-und Zell Lösungen durch das Gerät gleichzeitig für 10 Sekunden vor der Zell-Trapping-Schritt, um ungestörten Strömung während der Lösung-Schaltschritt zu gewährleisten. HINWEIS: Diese kurze Zusammenfluss Schritt sollte bei jeder Lösung-Schaltschritt wiederholt werden. </li><li> Schalten Sie den Waschhafen und spülen Sie das Gerät für 20 Sekunden, um nicht gefangen kontaminierenden Zellen zu entfernen. </li><li> Injizieren Sie die Lösung, die das erste Molekül von Interesse (0,2 mg / ml 3000 Da neutrale und anionische Dextranmolekülen oder 1,5 mg / ml von 70.000 Da neutral Dextranmolekül) in das Gerät. </li><li> Gelten fünf kurze Impulse (t = 30 ms mit 2 Sekunden-Intervallen) unverzüglich nach der Injektion derMolekularlösung und Überwachung der Größe und Dauer des angelegten elektrischen Impulse in Echtzeit unter Verwendung eines Oszilloskops. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 3.10 so oft wie die Anzahl von zusätzlichen Molekülen geliefert werden. Für jede Lieferung Molekular, Inkubation Zellen für 100 s in der molekularen Lösung dann spülen Sie das Gerät mit der Waschlösung für 100 s, um überschüssige Moleküle zu entfernen. </li><li> Lassen Sie die Zellen in einer 96-Well-Platte für nachgeschaltete Analyse durch Senken der Betriebsdruck unter 5 bar. HINWEIS: Etwa 100 ul Lösung mit 100 Zellen von jedem Release gesammelt. </li><li> Führen Sie die experimentellen Schritte 3.9 bis 3.16 drei Mal, um genügend Zellen für die Durchflusszytometrie zu sammeln. </li><li> Zentrifugieren der 96-well-Platte, die verarbeiteten Zellen 5 min bei 228 × g. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, die überschüssige fluoreszierende Moleküle enthält. </li><li> Die Zellen in DPBS für die Durchflusszytometrie-Analyse. </li><li> Lastzellen im Durchflusszytometer für die molekulare uptake Effizienzanalyse. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit der neuen Plattform parallelisiert Elektroporation, 10-fache Verstärkung in Durchsatz und Effizienz von Multi-Molekül Lieferung wurde zusätzlich zu all den Vorzügen, die die zuvor entwickelten Ein-Kammer-System bietet erreicht. Bisher 18 verfügbar Verdienste umfassen (i) Vorreinigung Zielzellen mit einheitlicher Größenverteilung für die Lebensfähigkeit Verbesserung, (ii) präzise und individuelle molekulare Dosierungssteuerung, und (iii) geringe Betriebs elektrischen Strom. Fluoreszierend markierte Dextrane wurden als Moleküle von Interesse ausgewählt, weil sie in einem breiten Bereich von Molekulargewichten, konjugierten Fluorophor Typen und elektrischen Ladungen leicht verfügbar sind. Diese Makromoleküle sind gute Kandidaten für eine derartige Untersuchung, da sie inhärent undurchlässige Membran für lebende Zellen und keine Zytotoxizität aufweist. 24 optimale Konzentration des fluoreszierenden Dextran, Inkubationszeit und die elektrischen Parameter wurden für das aktuelle System vor t identifizierto die Elektroporation Experimenten. Der Optimierungsprozess war ziemlich einfach und effizient durch, um die Plattform in der Lage ist, die molekulare Aufnahmeprozess in Echtzeit überwachen. Visualisierung dieses Verfahrens ist sehr vorteilhaft, wenn ein Molekül oder Zelltyp mit wenig bis gar keine Kenntnisse der Elektroporation Parameter getestet wird. Die Inkubationszeit für alle getesteten Moleküle wurde auf 100 s, durch die Zellen in allen 10 Kammern gefangen zeigen nachweisbaren Fluoreszenzintensität Signale in Echtzeit, die über den erfolgreichen Abschluss der molekularen Lieferung. Beachten Sie, dass dies nicht der für die molekulare Lieferung erforderlichen Mindestdauer der Inkubation. Es hat eine langjährige Debatte über die molekularen Lieferprozess mit Elektroporation, ob es ausschließlich durch Diffusion 4,19,25 oder durch Elektrophorese vermittelt. 26. Bezeichnung des dominierenden Mechanismus der molekularen Lieferung beinhaltet eine Reihe von mühsamen Einzeltests, verglichen ter Ziele je nach Molekülgrößen, elektrische Ladungen und Elektroporation Parameter. Nach bestem Wissen der Autoren wurden diese mühsame Optimierungsprozesse mit herkömmlichen Elektroporation Systeme berichtet. 4,26-28 einfache Parameteroptimierung Fähigkeit der entwickelten Systems erlaubt für die Identifizierung der molekularen dominant Lieferung Mechanismus, durch die Untersuchung Variationen in der Effizienz der Elektroporation abhängig von molekularen und elektrischen Parameter. Die Ergebnisse zeigten, daß die Effizienz der anionischen 3000 Da Dextran war nicht signifikant verschieden von der seiner neutralen Gegenstück (83 und 75%, jeweils), was darauf hindeutet, dass das beobachtete Molekularaufnahme wurde möglicherweise durch Diffusion vermittelt. Im Gegensatz zu anderen Systemen Elektroporation, verarbeitete Zellen wurden kontinuierlich während der Elektroporation in diesem System bewegt. Schrittweise Erhöhung der Fluoreszenzsignale des umlaufenden Zellen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Diffusion würde die Domina seinnt Liefermechanismus. Hohe Effizienz Molekularaufnahme (90%) neutral 70.000 Da Dextranmoleküle weiter beinhaltet, dass selbst bei hohen Molekulargewichten der Lieferprozess tritt als Folge der Diffusion. Schließlich erfolgreiche sequentielle Lieferung von 3000 Da anionische und neutrale Dextranmolekülen erstarrt die Behauptung, dass molekulare Lieferung trotz der Moleküle Ladung auftritt. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass Membran Wiederverschließen nicht innerhalb von 3 min von Elektroporation (100 sec pro Molekular Lieferung) abgeschlossen. Die vorgestellte Molekular-Delivery-Plattform können nacheinander liefern weite Bereiche der Molekülgrößen, unabhängig von ihrer elektrischen Ladungen. Rechtzeitige Feinabstimmung und Änderung einzelner Parameter können mit wenig Aufwand durch die Echtzeit-Prozessüberwachungsfähigkeit gestützte erreicht werden. Größe basierende Zellreinigungsverfahren des Systems eliminiert die Notwendigkeit für mühsame Probenvorbereitung und zeitaufwendig Zentrifugation vor und nach der ElektroporationSchritte. Außerdem niedrigen Betriebsstrom des Systems erheblich reduziert Zellmortalität.

In den letzten Jahren hat die Verwendung von elektrischen Impulsen an das cytosolische Abgabe von extrazellulären Molekülen erleichtern zu einem attraktiven Mittel zum Manipulieren Säugerzellen. 1 Dieses, auch als Elektroporation bekannt ist, reversibel permeabilisiert der Zellmembran, so dass für inhärent Membran undurchlässig Moleküle um Zugang zu erhalten intrazellulären Milieu der Zellen. Da praktisch jedes Molekül in das Cytosol über temporäre erzeugt Poren in der Membran von jeder Art von Zellen unter Verwendung von Elektroporation eingebracht werden, ist die Technik, wie berichtet, wobei reproduzierbarer, universell einsetzbar und effizienter als andere Verfahren, einschließlich Virus-vermittelten chemischen und optische Methoden. 2-3 Diese Technik wurde verwendet, um fluoreszierende Moleküle einzuführen, 4 Medikamente 5 und Nukleinsäuren 6-7, während Zellen lebensfähig und intakt. Angesichts dieser Vorteile hat die Elektroporation als eine gemeinsame Arbeits verabschiedetAtory Technik zur DNA-Transfektion in vivo Gentherapie und Zell 8 Vakzinierungsstudien. Es ist jedoch immer noch schwierig für herkömmliche Systeme Elektroporation, gleichzeitig eine praktische Effizienz und Rentabilität für Proben mit großen Heterogenität in der Größe, da die elektrische Feldstärke für eine erfolgreiche Elektroporation erforderlich eng mit Durchmesser der Zelle korreliert. Hinzu kommt, dass diese Systeme nicht erlauben präzise Steuerung der mehreren molekularen Mengen, die durch die Abhängigkeit von Groß stochastischen Molekularlieferprozess geliefert. 9 Um diese Probleme anzugehen, haben viele Gruppen mikrofluidischen Elektroporation Plattformen entwickelt und bietet den Vorteil der geringeren Körperschaftsteuer Spannungen, bessere Transfektionseffizienz, eine große Reduktion der Zellsterblichkeit, und die Fähigkeit, mehrere Moleküle liefern. 10-13 Diese Vorteile wurden möglich durch die kleinen Fußabdrücke von Mikrosystemen, deren Elektroporation ElektrodenabstandLängen sind Unter Millimeter, dramatisch sinkende Spannungen für erfolgreiche Zustellung erforderlich. Darüber hinaus können diese Mikrosysteme Elektroporation einheitliche elektrische Feldverteilung zu erreichen und schnell erzeugte Wärme abzuführen, was reduzierter Zellmortalität und gleichzeitig die Liefereffizienz. Die Nutzung von transparenten Materialien für diese Mikrochips ermöglicht ferner in situ Beobachtung der Elektroporation Prozesses für eine schnelle Parameteränderungen. 2,12 jedoch präzise Dosierung Steuerung und molekular und zellulären abhängigen Parametersteuerung, für die Schwellen Forschung und therapeutische Anwendungen, 6 erforderlich, 14-16 immer noch ungelöst. In dieser Arbeit wird eine mikrofluidische Wirbelgestützte Elektroporation System liefern kann mehrere Moleküle sequentiell in einer vorgewählten identische Population von Zielzellen. Zellen, die mit gleichmäßigen Größenverteilung vor der Elektroporation isoliert mit zuvor berichteten size-selektive Fangmechanismus. 17-18 Durch eine gleichmäßige Größenverteilung, weniger Schwankungen bei der Elektroporation Effizienz und verbesserte Rentabilität pro gegebenem elektrischen Feldstärke erreicht. 19. Darüber hinaus kontinuierlich gerührt gefangen Zellen unter Verwendung von Mikrowirbel für gleichmäßige Abgabe von Molekülen über die erlaubte gesamte Cytosol, in Übereinstimmung mit den zuvor berichteten Ergebnisse mit einem anderen wirbel unterstützt Elektroporation Plattform. 20. Um zu zeigen, dass dieses System wäre für eine breite Palette von Molekülen in biologischen Anwendungen häufig genutzt, Makromoleküle mit einer breiten Palette von Molekulargewichten wurden geliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Darüber hinaus mit Hilfe von Echtzeit-Prozessüberwachung, bietet diese Arbeit mehr Beweise, um ein Ende während electrporation auf die langjährige Debatte über den Mechanismus der molekularen Lieferung setzen, wobei überwiegend Elektrophorese-vermittelte gegenüber diffusions vermittelt. 14 </sup&gt; Im Gegensatz zu anderen Systemen Elektroporation, bietet diese Plattform eindeutig die kombinierten Vorteile der präzisen Multi-Molekül Lieferung, hohe Molekular Lieferung Effizienz, minimale Zellsterblichkeit, einer breiten Spanne von Größe und Kosten der gelieferten Moleküle, sowie Echtzeit-Visualisierung der Elektroporation Prozess. Angesichts dieser Möglichkeiten hat das System entwickelt Elektroporation praktische Potenzial als vielseitiges Werkzeug für die zelluläre Reprogrammierung Studien 6,14,21-22 Drug-Delivery-Anwendungen und Anwendungen, die 10,19 für ein tiefes Verständnis der molekularen Elektroporation Liefermechanismen.

<table><tbody><tr><td>MDA-MB-231 cancer cell line</td><td>American Type Culture Collection (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 Medium</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>10-045-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Cellgro, Mediatech, Inc.</td><td>21-030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer easyCyte HT</td><td>Millipore</td><td>0500-4008</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Cleaner</td><td>Technics Micro-RIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dektak 6M surface profiler</td><td>Veeco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KMPR 1050</td><td>Microchem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compressed Nitrogen gas</td><td>Airgas</td><td>NI 300</td><td></td></tr><tr><td>High Pressure Regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>6162K22</td><td></td></tr><tr><td>Downstream regulator</td><td>McMaster-Carr</td><td>4000K563</td><td></td></tr><tr><td>High-speed 3/2way-8 valve manifold</td><td>Festo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inline Check Valve</td><td>Idex Health and Science</td><td>CV3320</td><td></td></tr><tr><td>5/32&quot; OD x 3/32&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-156F-0</td><td></td></tr><tr><td>1/4&quot; OD X 0.17&quot; ID Polyurethan tubes</td><td>Pneumadyne</td><td>PU-250PB-4</td><td></td></tr><tr><td>1/16&quot; PEEK tubings</td><td>Festo</td><td>P1533</td><td></td></tr><tr><td>1/32&quot; PEEK tubings</td><td>Idex Health and Science</td><td>P1569</td><td></td></tr><tr><td>PEEK tubing unions</td><td>Idex Health and Science</td><td>P881</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Generator</td><td>HP</td><td>8110A</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Wire</td><td>Bob Martin Company</td><td>6061 ALUM</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Agilent</td><td>DSO3062A</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tube</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>T75 culture flask</td><td>VWR</td><td>82050-862</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 3,000 MW, Anionic</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3307</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&amp;nbsp;</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D1819</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, Texas Red, 3,000 MW, Neutral</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>D3329</td><td></td></tr></tbody></table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

Elektroporation wurde zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren erhalten, weil es ein sehr leistungsfähiges Verfahren zum physikalischen Einführen nicht-durchdringenden exogenen molekulare Sonden in Zellen. Diese Arbeit berichtet über eine mikrofluidische Plattform Elektroporation der Lage ist, mehrere Molekül Lieferung an Säugetierzellen mit präzisen und molekularen abhängigen Parametersteuerung. Die Fähigkeit des Systems, um Zellen mit einheitlicher Größenverteilung zu isolieren lässt weniger Variation in Elektroporationseffizienz pro gegebenem elektrischen Feldstärke; damit verbesserte Probenfähigkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Beobachtung des Fluoreszenzmolekularaufnahmeprozess in Echtzeit, die prompt Molekular Lieferung Parametereinstellungen zur Effizienzsteigerung ermöglicht in situ seine Prozessvisualisierungsfunktion. Um die riesigen Möglichkeiten der Plattform gemeldet zeigen, Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen (zB Dextran mit MW von 3.000 und 70.000 Da) warengeliefert metastasierendem Brustkrebs-Zellen mit hoher Fördereffizienzen (&gt; 70%) für alle getesteten Moleküle. Die entwickelte Plattform wurde das Potenzial für den Einsatz in den Ausbau der Forschungsfelder, wo auf dem Chip Elektroporationstechniken von Vorteil sein kann bewiesen.

Der entwickelte parallele mikrofluidische Elektroporator geliefert Makromoleküle mit verschiedenen Größen und elektrische Ladungen in lebende metastasierendem Brustkrebs-Zellen. Erfolgreiche Molekularliefer wurde qualitativ durch Überwachung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität des elektroporierten umlaufenden Zellen in situ bestimmt und durch quantitative Messungen mittels Durchflusszytometrie-Analyse bestätigt. 4A zeigt, dass 90% der behandelten Zellen Auffassung 70.000 Da neutral Dextran. Für die statistische Analyse wurde eine Intensitätsschwelle für jedes Fluorophor derart eingerichtet, dass die Mehrheit (&gt; 99%) der unbearbeiteten lebenden Zellen unter dem Schwellenwert gezählt (siehe 4 (c)). Der Wirkungsgrad ist als Verhältnis der Anzahl von Zellen definiert erfolgreiche Aufnahme der Moleküle von Interesse auf der Gesamtzahl der verarbeiteten Zellen. 4B zeigt, dass die Effizienz nicht wesentlich variieren, abhängig vom MolekularGewicht oder elektrische Ladungen (P&gt; 0,1). Alle getesteten Dextran-Moleküle in das Cytosol mit Wirkungsgrad größer als 70% erzielt. Zusätzlich zeigt Figur 4D daß sequentielle Molekular Lieferung erfolgreich mit einem Dual-Molekül Abgabeeffizienz von 56% mit Hilfe des anionischen und neutralen Dextrane mit identischem Molekulargewicht (MW = 3000 Da) durchgeführt. Das gegenwärtige System kann Zellen mit Verfahren 10-fach höheren Durchsatz und Multi-Molekül Abgabeeffizienz als die zuvor berichtet System 18 und diese Verbesserung nicht beeinträchtigen Einzelmolekül-Lieferung (82% und 70% für die anionische und neutrale Dextran, jeweils). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig1highres.jpg" /> Figur 1 (A) Eine schematische Darstellung des mikrofluidischen Elektroporation System, bestehend aus Einlässen für Zellen (als C bezeichnet)-Moleküle (wie M1 und M2 bezeichnet) und eine bündig solutIon (als F bezeichnet), zwei geraden Kanälen, wo Trägheits Fokussierung auftritt, 10 Kammern Elektroporation mit Elektroden und einer Steckdose. (B) Lösung Austausch Demonstration am Einlass mit einem 1 uM FITC-Lösung und einen Flush-Lösung (DPBS) zeigt, dass der Wirkstofflösung gleichmäßig auf alle Anordnungen von Kammern stromabwärts eingespritzt werden. Bildkontrast durch Einstellen Look-up-Tabelle (LUT) verbessert. Maßstabsbalken sind 250 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Eine Fotografie des 15-Pin-Elektrode für Kurzpuls-Hochspannung verwendet wird, die aus 10 positiv (+) und fünf negative Elektroden (-). Jede positive Elektrode 2 mm entfernt von einer negativen Elektrode beabstandet ist, und each Elektrode der gleichen Polarität 1,35 mm voneinander entfernt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig3highres.jpg" /> Abbildung 3 Schematische Darstellung der Versuchsvorrichtung, bestehend aus (A) der Fluidsteuereinheit, (B) die mikrofluidische Elektroporators und (C) der elektrischen Ausrüstung. (A) Vials enthaltend Lösung mit Molekülen, Zellen und sauberen Puffer einzeln unter Druck auf Nachfrage mit der LabView gesteuerten pneumatischen Strömungssystem. Die Lösung aus dem Gefäß unter Druck in die mikrofluidische -Elektroporator durch PEEK-Kapillare mit einem Rückschlagventil installiert injiziert. (B) und (C) Die elektrischen Signale werden an 15-Pin-Elektroden in Kontakt mit der F geschicktgende Lösung in dem mikrofluidischen System während der Elektroporation Schritt. Die elektrischen Impulse mit der Dauer programmiert werden mit dem Impulsgenerator und die Stärke des elektrischen Impulses auf 100 V durch den Hochspannungsverstärker erzeugt. Alle angelegten elektrischen Parameter werden in Echtzeit mit einem Oszilloskop überwacht. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51702/51702fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Repräsentative Durchflusszytometrie Daten. (A) Fluoreszenzsignale von MDA-MB-231-Zellen, die erfolgreich nahm die 70.000 Da anionische Molekül Dextran im Vergleich zu der der Kontrollgegenstück. (B) die Wirkungsgrade für die einzelnen übertragenen Dextranmoleküls zeigen keine signifikanten MolekularabhängigenVariation (p&gt; 0,1). (C) Repräsentative Durchflusszytometrie-Profile für Zellen, die nicht mit Elektroporation (Kontrolle) behandelt wurden. Die Leuchtstoffschwelle, welche das erfolgreiche molekulare Lieferung wird aus den Daten, dass die Signale aus Kontrollproben werden unter dem Schwellenwert gefunden gesetzt. (D) Vertreter Durchflusszytometrie Daten zum sequentiellen elektroporiert Zellen. Grünen, roten und gelben Kästchen in der Durchflusszytometrie Handlung und fluoreszierenden Streifen Bilder auf der rechten Seite repräsentieren Fluoreszenzsignale von den Zellen Fluidaufnahme 3000 Da neutral Dextran allein, anionischen Dextran-only und beide Dextran-Moleküle sind. Maßstab beträgt 100 m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51702/51702fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.5K Aufrufe.  Harvard University.  Eine mikrofluidische Vortex Assisted Elektroporation Plattform wurde für die sequentielle Übertragung mehrerer Moleküle in Zellpopulationen identisch mit präzisen und unabhängigen Steuer Dosierung entwickelt. Größe basiert Zielzelle Reinigungsschritt voran Elektroporation des Systems geholfen, um molekulare Lieferung Effizienz und verarbeitet die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. 

Serie: Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

Taking Advantage of Reduced Droplet-surface Interaction to Optimize Transport of Bioanalytes in Digital Microfluidics

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; platforms. Often, droplet motion relies on the wetting of a surface, directly associated with the application of an electric field; surface interactions, however, make motion dependent on droplet contents, limiting the breadth of applications of the technique.
Some alternatives have been presented to minimize this dependence. However, they rely on the addition of extra chemical species to the droplet or its surroundings, which could potentially interact with droplet moieties. Addressing this challenge, our group recently developed Field-DW devices to allow the transport of cells and proteins in DMF, without extra additives.
Here, the protocol for device fabrication and operation is provided, including the electronic interface for motion control. We also continue the studies with the devices, showing that multicellular, relatively large, model organisms can also be transported, arguably unaffected by the electric fields required for device operation.

The protocol for fabrication and operation of field dewetting devices (Field-DW) is described, as well as the preliminary studies of the effects of electric fields on droplet contents.

Vorteilhafte Reduzierte Droplet-Oberflächen-Wechselwirkung, um den Transport Bioanalyten in Digitale Mikrofluidik Optimieren

Digital microfluidics (DMF), a technique for manipulation of droplets, is a promising alternative for the development of &#8220;lab-on-a-chip&#8221; ...

Forschung

Ingenieurwesen

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Genetik

High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

High Speed ​​Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biologie

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

Biotechnik

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and morphology of the obtained microsphere. A microsphere copolymerized with an acrydite-DNA probe was successfully fabricated. Different methods such as asymmetric PCR, exonuclease digestion, and isolation on streptavidin-coated magnetic beads can be used to synthesize single-stranded DNA (ssDNA). However, these methods cannot efficiently use large amounts of highly purified ssDNA. Here, we describe a microsphere-PCR protocol detailing how ssDNA can be efficiently amplified and separated from dsDNA simply by pipetting from a PCR reaction tube. The amplification of ssDNA can be applied as potential reagents for the DNA microarray and DNA-SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) processes.

This work provides a method for the fabrication of droplet-based microfluidic platforms and the application of polyacrylamide microspheres for microsphere-PCR amplification. The microsphere-PCR method makes it possible to obtain single-stranded DNA amplicons without separating double-stranded DNA.

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic regulatory circuits. The analysis of synthetic genetic regulatory networks in vivo is time consuming and suffers from a lack of environmental control, with exogenous synthetic components interacting with host processes resulting in undesired behavior. To overcome these issues, cell-free characterization of novel circuitry is becoming more prevalent. In vitro transcription and translation (IVTT) mixtures allow the regulation of the experimental environment and can be optimized for each unique system. The protocols presented here detail the fabrication of a multilayer microfluidic device that can be utilized to sustain IVTT reactions for prolonged durations. In contrast to batch reactions, where resources are depleted over time and (by-) products accumulate, the use of microfluidic devices allows the replenishment of resources as well as the removal of reaction products. In this manner, the cellular environment is emulated by maintaining an out-of-equilibrium environment in which the dynamic behavior of gene circuits can be investigated over extended periods of time. To fully exploit the multilayer microfluidic device, hardware and software have been integrated to automate the IVTT reactions. By combining IVTT reactions with the microfluidic platform presented here, it becomes possible to comprehensively analyze complex network behaviors, furthering our understanding of the mechanisms that regulate cellular processes.

The fabrication process of a PDMS-based, multilayer, microfluidic device that allows in vitro transcription and translation (IVTT) reactions to be performed over prolonged periods is described. Furthermore, a comprehensive overview of the hardware and software required to automate and maintain these reactions for prolonged durations is provided.

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

The limitations of cell-based synthetic biology are becoming increasingly apparent as researchers aim to develop larger and more complex synthetic genetic ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

The Fabrication and Operation of a Continuous Flow, Micro-Electroporation System with Permeabilization Detection

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is accompanied by high manufacturing costs, which has brought about an interest in using alternative methods for gene delivery. Electroporation is an electro-physical, non-viral approach for the intracellular delivery of genes and other exogenous materials. Upon the application of an electric field, the cell membrane temporarily allows molecular delivery into the cell. Typically, electroporation is performed on the macroscale to process large numbers of cells. However, this approach requires extensive empirical protocol development, which is costly when working with primary and difficult-to-transfect cell types. Lengthy protocol development, coupled with the requirement of large voltages to achieve sufficient electric-field strengths to permeabilize the cells, has led to the development of micro-scale electroporation devices. These micro-electroporation devices are manufactured using common microfabrication techniques and allow for greater experimental control with the potential to maintain high throughput capabilities. This work builds off a microfluidic-electroporation technology capable of detecting the level of cell membrane permeabilization at a single-cell level under continuous flow. However, this technology was limited to 4 cells processed per second, and thus a new approach for increasing the system throughput is proposed and presented here. This new technique, denoted as cell-population-based feedback control, considers the cell permeabilization response to a variety of electroporation pulsing conditions and determines the best-suited electroporation pulse conditions for the cell type under test. A higher-throughput mode is then used, where this 'optimal' pulse is applied to the cell suspension in transit. The steps for fabricating the device, setting up and running the microfluidic experiments, and analyzing the results are presented in detail. Finally, this micro-electroporation technology is demonstrated by delivering a DNA plasmid encoding for green fluorescent protein (GFP) into HEK293 cells.

This protocol describes the microfabrication techniques required to build a lab-on-a-chip, microfluidic electroporation device. The experimental setup performs controlled, single-cell-level transfections in a continuous flow and can be extended to higher throughputs with population-based control. An analysis is provided showcasing the ability to electrically monitor the degree of cell membrane permeabilization in real-time.

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Current therapeutic innovations, such as CAR-T cell therapy, are heavily reliant on viral-mediated gene delivery. Although efficient, this technique is ...

Mikrofluidisches Gerät zur kontinuierlichen Isolierung extrazellulärer Vesikel aus menschlichem Urin

Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. Nevertheless, the current methodologies for isolating EVs present significant challenges, such as complexity, time consumption, and the need for bulky equipment, which hinders their clinical translation. To address these limitations, we aimed to develop an innovative microfluidic system based on cyclic olefin copolymer-off-stoichiometry thiol-ene (COC-OSTE) for the efficient isolation of EVs from large-volume samples in a continuous manner. By utilizing size and buoyancy-based separation, the technology used in this study achieved a significantly narrower size distribution compared to existing approaches from urine and cell media samples, enabling the targeting of specific EV size fractions in future applications. Our innovative COC-OSTE microfluidic device design, utilizing bifurcated asymmetric flow field-flow fractionation technology, offers a straightforward and continuous EV isolation approach for large-volume samples. Furthermore, the potential for mass manufacturing of this microfluidic device offers scalability and consistency, making it feasible to integrate EV isolation into routine clinical diagnostics and industrial processes, where high consistency and throughput are essential requirements.

Autor im Fokus: Asymmetrische Feldströmungsfraktionierung für die Integration von Bioreaktoren

Extracellular vesicles hold immense promise for biomedical applications, but current isolation methods are time-consuming and impractical for clinical use. In this study, we present a microfluidic device that enables the direct isolation of extracellular vesicles from large volumes of biofluids in a continuous manner with minimal steps.

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Extracellular vesicles (EVs) hold immense potential for various biomedical applications, including diagnostics, drug delivery, and regenerative medicine. ...

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Vorteilhafte Reduzierte Droplet-Oberflächen-Wechselwirkung, um den Transport Bioanalyten in Digitale Mikrofluidik Optimieren

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

High Speed Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Einstufige Isolierung extrazellulärer Vesikel aus großvolumigen Proben mit einem gegabelten mikrofluidischen A4F-Gerät

Microscale Vortex-unterstützte Electroporator für Sequential Molekulare Liefer

Zusammenfassung

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Vorteilhafte Reduzierte Droplet-Oberflächen-Wechselwirkung, um den Transport Bioanalyten in Digitale Mikrofluidik Optimieren

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing und Transfektion mit akustischer Nanodispensing-Technologie

High Speed ​​Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme

Eine höchste Durchsatz mikrofluidischen Plattform für einzellige Genom-Sequenzierung

Ein Tröpfchen mikrofluidischen Ansatz und Mikrosphären-PCR Verstärkung für Single-Stranded DNA-Amplifikate

Eine multilayer mikrofluidische Plattform für die Leitung einer längeren zellfreien Genexpression

Elektroporation von Craniofacial Mesenchym

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

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High Speed Droplet-based Delivery System für Passive Pumping in Mikrofluidiksysteme