Immunprecipitation-basierte Techniken: Reinigung endogener Proteine mit Agarose-Perlen

Quelle: Susannah C. Shissler¹, Tonya J. Webb^1
1 Institut für Mikrobiologie und Immunologie, University of Maryland, Baltimore, MD 21201

Immunpräzipitation (IP, auch bekannt als "Pull-down"-Assay) ist eine weit verbreitete Technik, die Anwendungen in einer Vielzahl von Bereichen hat. Erstmals 1984 konzipiert, wurde es 1988 verfeinert (1, 2). Das grundlegende Ziel der IP ist die Reinigung und Isolierung eines bestimmten Proteins mit einem Antikörper gegen dieses Protein. Das Wort "Immuno" bezieht sich auf die Verwendung eines Antikörpers, während das Wort "Ausfällung" sich auf das Abziehen einer bestimmten Substanz aus einer Lösung bezieht. Das Zielprotein kann endogene oder rekombinant ewanant sein. Die meisten rekombinanten Proteine haben ein Epitop-Tag (d. h. myc oder Flag), das an ihnen angebracht ist, um die nachfolgende Reinigung zu vereinfachen. In der Regel ist es einfacher, rekombinante Protein-IP zu optimieren, da die Antikörper gegen rekombinante Epitop-Tags sehr stark und wirksam sind. Antikörper gegen endogene Proteine haben eine extrem variable Wirksamkeit , was es viel schwieriger macht, diese IPs zu optimieren. Ein notwendiger Schritt nach der Immunpräzipitation ist die Überprüfung der Reinigung. Das isolierte Protein wird mit SDS-PAGE aufgelöst und anschließend durch westliche Flecken auf Reinheit untersucht (Abbildung 1). Eine wichtige Kontrolle ist die Verwendung eines anderen Antikörpers während des Western Blot, um den Abziehdes des richtigen Proteins zu überprüfen. Die Kombination von IP mit nachfolgenden Techniken ist ein leistungsstarkes Analysetool. Das Ziel nach der Reinigung kann die Charakterisierung des Proteins selbst durch NMR, Massenspektrometrie und In-vitro-Assays oder die Analyse der interagierenden Partner des Proteins (z. B. Protein, DNA, RNA) (3, 4, 5) sein.

Abbildung 1: Überblick über das Immunpräzipitungsverfahren. Immunpräzipitation ist die Isolierung eines bestimmten Proteins mit einem Antikörper. Nach der Produktion von Lysat aus Zellen, gibt es zwei wichtige Schritte - Vor-Clearing und ziehen nach unten. Während des Vorklärungsschritts werden die Zelllysate von Proteinen vorgereinigt, die sich nicht spezifisch mit einem Isotyp-Kontrollantikörper an Antikörper binden. Im Pull-Down-Schritt wird das Zielprotein mit einem proteinspezifischen Antikörper nach unten gezogen. Das isolierte Protein wird dann durch Western Blot analysiert. Isotyp-Antikörper und proteinspezifische Antikörper haben die gleiche konstante Domäne, aber unterschiedliche Antigen-Bindungsdomänen. Ein wichtiger Bestandteil dieses Protokolls sind Protein-A/G-Agarose-Perlen, die die konstante Domäne von Antikörpern binden und eine Immunpräzipation des Zielproteins ermöglichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Antikörper sind der Schlüsselbestandteil einer Immunpräzipitation, die sie von anderen Formen der Proteinreinigung (d. h. Nickelaffinitätssäulenreinigung) unterscheidet. Antikörper sind Moleküle von B-Zellen, die bestimmte Proteinepitope erkennen können. Antikörper haben zwei Domänen: Konstante (Fc) und Antigenbindung (Fab) (Abbildung 1). Die konstante Domäne identifiziert den Typ des Antikörpers und diktiert die Funktion in vivo. In der Regel sind die konstanten Domänen von Antikörpern, die für IP verwendet werden, Maus, Ratte oder Kaninchen IgG. Der Antigenbindungsanteil des Antikörpers erkennt ein spezifisches Epitop eines bestimmten Proteins. Antikörper können Epitope an gefalteten Proteinen erkennen, die möglicherweise nicht existieren, wenn das Protein denaturiert ist und umgekehrt. Daher hängt die Verfügbarkeit des Epitops von der Proteinfaltung ab - die Identifizierung eines wichtigen Faktors, der bei der Wahl von Antikörpern und Bedingungen für IP zu berücksichtigen ist.

Sowohl prokaryotische als auch eukaryotische Systeme haben Antikörper-bindende Proteine. In eukaryotischen Systemen, der Zweck ist Immunschutz vor Bakterien, während in prokaryotischen Systemen, der Zweck ist der Schutz vor dem Immunsystem. Antikörperbindende Proteine beeinflussen die IP-Methodik auf zwei Arten. Erstens gibt es einen notwendigen Vorklärungsschritt (Abbildung 1), um das Lysat von Proteinen zu befreien, die Antikörper binden - wodurch die unspezifische Bindung im Endprodukt reduziert wird. In diesem Schritt wird ein Isotyp-Antikörper verwendet, der die gleiche konstante Domäne wie eine andere Antikörperbindungsdomäne als Ihr proteinspezifischer Antikörper hat. Bakterielle Antikörper-bindende Proteine sind die zweite Schlüsselkomponente dieser Methode. Nachdem der proteinspezifische Antikörper das Zielprotein bindet, muss der Antikörper: Proteinkomplex heruntergezogen werden (Abbildung 1). Proteine A, G und L sind bakterielle Proteine, die die konstante Domäne von Antikörpern binden. Während Bakterien dies verwenden, um das Immunsystem zu untergraben, Forscher haben dieses System für eine einfache Antikörperreinigung kooptiert, und es wird sowohl während der Vor-Clearing-und Pull-down-Schritte verwendet. Diese Proteine haben unterschiedliche Bindungsaffinitäten für verschiedene Arten und verschiedene konstante Domänensubtypen - ein weiterer Faktor, der bei der Auswahl der Bedingungen für IP zu berücksichtigen ist. Viele Unternehmen verkaufen Protein A/G-markierte Agaroseperlen (Abbildung 1), vorgefertigte Spinsäulen oder Harze, um Säulen herzustellen. Im Allgemeinen werden Perlen und Spinsäulen für kleinere Probengrößen verwendet, während Harze für die Massenreinigung verwendet werden.

In dieser Übungsübung zeigen wir, wie das endogene Protein c-myc aus primären murinen Thymosyten mit Protein A/G Plus Agaroseperlen auf basisiger Immunpräzipitationstechnik gereinigt werden kann. Das Protokoll beginnt mit der Zelllysatzubereitung und endet mit der Überprüfung des erfolgreichen Protein-Pull-Downs mittels Western-Blot-Analyse.

1. Immunpräzipitation mit Protein A/G PLUS Agarose Perlen

Zelllysat-Vorbereitung

1. Zentrifugieren Sie 10⁸ Thymose in einer Mikrozentrifuge bei 13.000 U/min für 3 min und entfernen Sie den Überstand.
   Hinweis: Die Zellzahl variiert je nach Expressionsniveau des gewünschten Proteins und dem gewählten Zelltyp.
2. Setzen Sie die Zellen in 500 L Lysepuffer RIPA mit PMSF wieder aus.
3. Unterbrechen Sie Zellen mit ein paar schnellen Impulsen mit einem Wirbel und dann das Lysat ein paar Mal mit einer 25 G Nadel an einer Spritze befestigt aspirieren.
   Hinweis: Vermeiden Sie blasen. Verwenden Sie eine größere Nadel, z. B. eine 21G-Nadel für größere Zelltypen.
4. Die Zelle 10 min auf Eis lysieren.
5. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 13.000 U/min für 15 min bei 4°C.
6. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches, beschriftetes Mikrozentrifugenrohr.

Pre-Clearing

7. Fügen Sie dem Lysat 20 L Protein A/G PLUS Agarose-Perlen und 1 g eines Isotyp-Kontrollantikörpers (hier verwendet der IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper der Maus) hinzu.
   Hinweis: Die Wahl des verwendeten Isotyp-Antikörpers hängt von dem proteinspezifischen Antikörper ab, der später im Pull-Down-Schritt verwendet wird.
8. Die Lysatmischung auf einem Zentrifugenrotator im Kühlraum (4°C) 30 min inkubieren.
9. Zentrifugieren Sie die Probe bei 3200 U/min für 30 s bei 4°C.
10. Übertragen Sie den vorgereinigten Überstand in ein frisches, beschriftetes, 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr. Entsorgen Sie das Pellet.

Proteinkonzentrationsbestimmung

11. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration der Zelle lysiert, indem Sie einen Bradford Assay durchführen.
12. Aliquot 1000 L Bradford Reagenz in 7 Mikrozentrifugenröhren.
13. Fügen Sie die folgenden Mengen des BSA-Proteinstandards (2 mg/ml) in 6 der Röhrchen ein (Tabelle 1).

Tabelle 1: BSA-Proteinstandardmengen

14. In der^7. Röhre 1 l des vorgereinigten Lysats hinzufügen.
    Hinweis: Um sicherzustellen, dass die Probenkonzentration im Assay-Detektionsbereich liegt, bereiten und analysieren Sie auch eine 1:2- oder 1:5-Lysatverdünnung.
15. Legen Sie 200 l aus jedem der 7 Rohre in einzelne Brunnen einer flachen, 96-Well-Platte, die jede Probe in dreifacher Ausfertigung wiederholt.
16. Leseplatte auf einem Plattenleser bei 595 nm.
17. Generieren Sie die Standardkurve in Excel und berechnen Sie die Proteinkonzentration des vorgereinigten Lysats.

herunterziehen

18. Beschriften Sie zwei frische 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre - eine als "Kontrolle" und andere als "Test", die in diesem Beispiel c-myc ist.
19. Legen Sie 500 g vorgereinigtes Lysat in jedes dieser Rohre.
    Hinweis: Die hier verwendete Proteinmenge hängt von der Menge des zu reinigenden Proteins ab.
20. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen für jedes Rohr mit einem Lysepuffer bis zu 500 l.
21. Fügen Sie dem Testgruppenröhrchen 2 g Anti-C-Myk-Antikörper und dem IgG1-Isotyp-Kontrollantikörper mit 2 g der Maus einen Antikörper zur Kontrollgruppe hinzu.
    Hinweis: Die Menge des Antikörpers hängt von der Wirksamkeit des Antikörpers und der Menge des Zielproteins ab.
22. Inkubieren Sie die Rohre auf einem Rotator im Kühlraum (4°C) für 2 h.
23. Fügen Sie 20 L Protein A/G PLUS Agarose Perlen zu jeder Tube hinzu.
    Hinweis: Es ist ratsam, Pipettenspitzen mit abgeschnittenem Ende zu verwenden, um Schäden an den Perlen zu vermeiden.
24. Über Nacht auf einem Rotator im Kühlraum (4°C) inkubieren.
    Hinweis: Je nach Zielprotein und Antikörperwirksamkeit kann dieser Schritt von 1 h bis über Nacht variieren.
25. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 U/min, damit bei 30 s 4°C die Perlen heruntergezogen werden.
26. Aspirieren Sie den Überstand aus jeder Röhre.
    Hinweis: Das Zielprotein ist nun an die Perlen gebunden.
27. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 l 1X Dulbecco s PBS.
28. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 3200 U/min für bei 30 s 4°C.
    Hinweis: Für strengeres Waschen verwenden Sie strengere Puffer wie RIPA.
29. Aspirieren Sie den Puffer aus jedem Rohr. Entfernen Sie mit Gel-Ladespitzen den Restpuffer von den Perlen und halten Sie die Perlen auf Eis, um das Protein zu entschärfen.
    Hinweis: In diesem Beispiel wird das Protein in SDS-PAGE-Laufpuffer eluiert, indem die Perlen für die Western-Blot-Analyse gekocht werden. Dieser Ansatz eignet sich zur Überprüfung von IP-Ergebnissen oder zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Für andere nachgelagerte Anwendungen, wie die Reinigung von Proteinen für die strukturelle oder enzymatische Analyse, werden anspruchsvollere Systeme wie Epitop-Tags (Flag-Tag oder myc-tag) verwendet, um die Elution des Antikörpers mit dem Protein von Interesse zu vermeiden.

2. IP-Verifizierung durch Western Blot-Analyse

SDS-PAGE Elektrophorese:

1. Re-suspend Perlen in 20 L SDS-PAGE-Ladefarbstoff mit dem -Mercapto-Ethonol.
2. Die Proben bei 95 °C 5 min kochen.
3. Zentrifugieren Sie die Perlen bei 13.000 U/min für 10 s bei Raumtemperatur.
4. Mit Gel-Ladespitzen die aus den Perlen gewonnenen Proben sorgfältig pfeifen und in Brunnen mit 4-15% Gradienten-SDS-PAGE-Gel laden.
5. Laden Sie zusätzlich zu den Proben eine Fahrspur mit einer Proteinleiter sowie eine Fahrspur mit dem vorgereinigten Lysat als Ladekontrolle.
6. Laufen Sie bei 100 V, bis die Farbe vorne den Boden des Gels erreicht (ca. 1h).

Western Blot Analyse:

7. Machen Sie Western Blot Sandwich, um sicherzustellen, dass PVDF Membran zwischen Gel und roter Kathode ist.
8. Transfer für 1 h bei 100 V.
9. Legen Sie die Membran in 5 ml Sperrpuffer bei Raumtemperatur für 1 h auf eine Wippe bei niedriger Einstellung, um die unspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren.
   Hinweis: Die Mengen an Blockierpuffern, primärer Antikörper, sekundärer Antikörper und Waschungen müssen möglicherweise für größere Blots erhöht werden.
10. Inkubieren Sie den Blot mit 5 ml Anti-C-Myc-Antikörper im Sperrpuffer über Nacht bei 4°C auf Rocker bei niedriger Einstellung.
    Hinweis: Der hier verwendete Antikörper sollte sich von dem im Pull-Down-Schritt verwendeten unterscheiden.
11. Waschen Sie den Fleck 3-6 mal mit 5 ml TBST mit jeder Wäsche von 5 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei niedriger Einstellung.
12. Inkubieren Sie den Blot mit HRP-getaggten Anti-Kaninchen-Lichtketten-Sekundärantikörper im Sperrpuffer, für 1 h bei Raumtemperatur auf Derawippe bei niedriger Einstellung.
    Hinweis: Die Wahl des sekundären Antikörpers hängt von primären Antikörpern ab, die für den Western Blot verwendet werden. Zusätzlich wird im Protokoll eine leichte Kettenspezifische Sekundäre verwendet, da das Zielprotein im Molekulargewicht nahe an der schweren Kette des Antikörpers liegt. Wenn das Zielprotein nahe 50kDa ist, verwenden Sie eine leichte Kette spezifische sekundäre. Wenn das Zielprotein nahe 25kDa ist, verwenden und schwere Kette spezifische sekundäre.
13. Waschen Sie den Fleck 3-6 mal mit 5 ml TBST mit jeder Wäsche von 5 min bei Raumtemperatur auf einer Wippe bei niedriger Einstellung.
14. Entfernen Sie Flüssigkeit aus Fleck und Tupfer Rand von Fleck auf Labortücher, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
15. Bedecken Sie Blot mit 1x chemiluminescent Detektionreagenz' und inkubieren für 1 min.
    Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in schneller Folge durchgeführt werden, da das Detektionsreagenz leicht und zeitempfindlich ist.
16. Dab Rand des Flecks auf Labortücher, um überschüssige detektionreagenz zu entfernen.
17. Platzieren Sie den Fleck auf der Bildfläche des Imager-Fachs.
    Hinweis: Chemilumineszierende Flecken können auch mit Film visualisiert werden.
18. Bild mit dem 'Chemiluminescent Program', um mehrere Zeitpunkte von 10 s bis 5 min zu erfassen.
    Hinweis: Die optimale Zeit kann sich je nach Proteinmenge und Der Qualität des Antikörpers ändern.
19. Wählen Sie ein Bild mit optimaler Bandsichtbarkeit aus, und exportieren Sie es dann.
20. Bevor Sie den Fleck bewegen, machen Sie ein Bild des Flecks mit dem Imager, um die Position der Leiter zu erfassen. Exportieren Sie dann auch dieses Bild.
21. Mit einer Folienvorbereitungssoftware (z. B. PowerPoint) richten Sie die Bänder und Leiterbilder so aus, dass sie ein einzelnes Bild bilden.

Die Ergebnisse des oben beschriebenen Verfahrens sind in Abbildung 2 dargestellt. Von links nach rechts enthalten die Bahnen die Kontrollgruppe (Isotyp), die Testgruppe (c-myc), das vorgereinigte Lysat (Lysat) und die Molekulargewichtsleiter (Leiter). Die 25 und 75 kDa Leiterbänder sind markiert. Die beiden markanten Bänder bei 25 kDa und 50 kDa sind die leichte und schwere Kette des Bindungsantikörpers bzw. sind unspezifisch für die IP oder die Proben. c-myc Protein, das um 67kDa auf Western Blots läuft und in der Regel direkt unterhalb des 75 kDa Leiterbandes sichtbar ist. In diesem Blot ist das c-myc-Band in der zweiten Spur sichtbar, fehlt aber in der ersten Spur, was darauf hinweist, dass der IP-Antikörper c-myc erfolgreich heruntergezogen hat. Es gibt kein sichtbares Band in der vorgereinigten Lysat-Spur, was darauf hindeutet, dass dieses Protein niedrige endogene Expressionswerte hat.

Abbildung 2: Ergebnisse einer Western Blot-Analyse, die zur Beurteilung der Reinigung von c-myc durch Immunpräzipitation verwendet wird. Ein Band bei 67 kDa, entsprechend c-myc, ist in der Anti-c-myc-Spur sichtbar, nicht aber in der Isotype-Steuerspur. Beachten Sie, dass die c-myc-Ebenen nicht hoch genug waren, um in der Lysat-Spur visualisiert zu werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Kurz gesagt, Immunpräzipitation ist die Isolierung eines bestimmten Proteins mit einem Antikörper. In diesem Beispiel wurden die Ergebnisse der Immunpräzipation von Western Blot analysiert, um die Reinheit zu bewerten. Das isolierte Protein könnte in einer Reihe von Anwendungen danach verwendet werden, einschließlich: NMR für die Proteinstruktur, Massenspektrometrie für die Aminosäuresequenz oder In-vitro-Assays zur enzymatischen Charakterisierung. IPs können auch die interagierenden Partner von Proteinen charakterisieren. Zum Beispiel könnten dna oder RNA nach Isolation zur Sequenzierung isoliert werden. Co-Immunpräzipitationen bewerten Protein-Protein-Wechselwirkungen. Wenn das Zielprotein während einer IP nach unten gezogen wird, können auch interagierende Proteine nach unten gezogen werden. Diese interagierenden Partner können durch Massenspektrometrie und Western Blot beurteilt werden. Immunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zum Studium der Proteinbiologie.

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