使用等离子体纳米镊子监测单个未修饰蛋白质的构象动力学

本研究旨在实时了解单分子水平的无标记蛋白质，特别关注使用当前技术难以研究或与疾病相关的蛋白质。等离子体镊子最近证明了它们在与小分子结合时监测构象动力学、检查分解动力学和阐明单分子水平自由能景观的能力。目前，尚无成熟的蛋白质表征技术能够研究无标记的单分子蛋白质构象动力学。

等离子体镊子被认为有可能填补该领域的这一利基市场。这种独特的优势有助于我们研究蛋白质的构象变化与其生物学功能之间的关系以及对疾病发展的影响。未来的研究将集中在内在无序蛋白和膜蛋白上，因为其中许多与阿尔茨海默病、帕金森病和各种癌症等多种疾病有关。

首先，使用直镊子将 PEG-硫醇涂层样品放入 3D 打印的流通池中，确保金层朝上。撕下透明 PET 塑料双面胶带盖的一侧。小心地将胶带贴在样品和流通池上，确保流通池中的纳米结构和进/出孔保持裸露状态。

使用圆镊轻轻按压胶带的边缘，以确保其粘附在流通池和样品上。撕下胶带的另一侧，轻轻地将玻璃盖玻片放在样品上。使用圆形镊子按压盖玻片的边缘以确保其粘附。

该工艺在流通池内形成一个高度为 50 微米、体积为 3.5 微升的液体通道。使用小移液器吸头，将等量的溶液 A 和复制硅胶的溶液 B 以一比一的比例混合到显微镜载玻片上，或由制造商指定。用混合复制的硅胶填充盖玻片和流通池之间的间隙，轻轻将其推到盖玻片下方。

将流通池倒置，小心地在孔的内壁周围涂抹复制的硅胶。轻轻地将硅胶移动到样品熔融石英底面的可见边缘上，让样品干燥，金层朝上，直到复制的硅胶完全凝固。验证所有组件均已正确连接后，在计算机上加载微流体系统 UI。

单击 MUX 分配器和电线旁边的播放图标，它们分别通过 1 个旋转阀和 3 个 2 通阀控制 12 个，以打开相应的接口。要绕过三通二通阀，请打开电线的端口 1。要将流通池安装到等离子体镊中，请将入口管和出口管连接到流通池的相应部分。

将流通池放在干净的纸巾上，金层朝上。以约 0.3 mL/min 的高流速将缓冲液注入流通池。检查液体是否在流通池内的样品上移动，并且外部或底部是否看不到液体。

将 1 到 2 滴浸油滴在 100X 物镜上。将流通池放入等离子体 Nanotweezers 载物台中，金层朝下。使用磁铁上的金属夹固定流通池，并锁定载物台以将其固定到位。

打开白色光源。打开相机软件并调整曝光时间和增益，直到纳米结构变得可见。以相对较高的功率打开激光器，并手动调整 Z 轴，直到看到激光点。

打开压电控制器，并为通信端口和最大电压选择适当的设置。将 X、Y 和 Z 轴值设置为最大电压的一半，以便在所有方向上更好地对齐舞台。使用主载物台 X、Y 和 Z 轴控制旋钮将激光光斑与双纳米孔或 DNH 结构之一对齐。

确保雪崩光电二极管或 APD 已打开。轻轻地将外壳关闭到等离子体镊子上。打开与 APD 录制相关的软件，例如自制的 LabVIEW UI。编辑文件名并将截止频率设置为 1 千赫兹。

然后指定保存文件的所需文件路径。关闭白色光源，然后重新打开激光。将激光功率设置到适当的水平后，使用压电控制调整 X、Y 和 Z 轴，直到 APD 信号尽可能高。

避免 APD 饱和，并且迹线的标准偏差最小。接下来，关闭激光器以延长纳米结构的使用寿命。运行注射泵控制单元和分配器 UI 以设置阀并提取所需量的蛋白质。

使用微流体 UI，以类似于提款速率的流速注入蛋白质溶液。继续以此速率输注，直到蛋白质溶液到达流动池。然后将流速设置为适当的值以进行捕获，并等待跟踪稳定。

验证注射泵上的体积和时间是否与预期值匹配。要记录 APD 信号数据，请根据需要使用压电控制器 UI 调整 X、Y 和 Z 轴。在观察到传输和标准偏差的较大变化时，记下发生这种情况的时间，以便将来进行数据排序。如果需要在实验过程中释放蛋白质，请关闭激光器约 5 秒钟，然后重新打开。

迹线的传输变化应较大，标准偏差应显著降低，表明已返回到基线状态。实验完成后，关闭激光器。从三轴载物台上拆通池并断开微流体系统管道。

将流通池放在干净的纸巾上，金层朝上。使用手术刀小心地剪下玻璃盖玻片下方的胶水，然后轻轻将其提起并丢弃。将流通池保持一定角度，使金层仍然朝上，并使用圆镊小心地去除流通池底部的胶水，以释放样品。

使用直镊子拿起样品并用异丙醇彻底冲洗。使用气枪干燥样品。对铁蛋白分子的原位铁负载进行的一项代表性实验表明，使用等离子体镊子作为研究蛋白质构象动力学的工具。

当被困在 PBS 溶液中时，Apoferritin 的传输轨迹保持稳定，表明没有明显的构象变化。暴露于亚铁溶液后，痕量标准差的波动增加，表明与铁负载相关的动态结构变化。铁暴露 20 分钟后，传输轨迹稳定，表明 apoferritin 转变为其全型。

概率密度函数图表明，铁负载时电压分布发生变化，进一步支持了从脱铁蛋白到全铁蛋白的构象转变。