完整澄清器官中克 氏锥虫感染细胞、休眠无鞭毛虫和 T 细胞的定量 3D 成像

该技术提供了整个透明器官的更完整的3D图像，并且可用于定量，不仅是复制，而且是休眠寄生虫和免疫因子细胞。这项技术使我们能够确定寄生虫、免疫细胞和感染引起的组织损伤的特殊关联。表位免疫染色和DNA标记也与该技术相当。

该方案有效地用于评估恰加斯病小鼠模型的治疗结果。在较长的治疗期内，较高个体剂量的治疗频率较低，可消除复制寄生虫和休眠寄生虫。展示该程序的将是Rick Tarleton实验室的研究技术人员Caleb Hawkins。

按照手稿中所述对受感染小鼠的器官实施安乐死、解剖和固定后，将单个器官浸入 10 毫升 50% 水稀释的 CUBIC-L 中，在室温下在 50 毫升锥形管中轻轻摇晃过夜避光。第二天，用10毫升100%CUBIC-L替换50%CUBIC-L，并在37摄氏度下孵育六天，同时将管子平放在摇床培养箱上。在此潜伏期结束时，组织应几乎完全透明。

用PBS在37摄氏度下清洗透明器官两次，持续两小时，轻轻摇晃。每次洗涤时，将组织转移到新的 50 毫升锥形管中以去除 Triton X-100。对于DNA染色，将市售核酸染料以1:2，500稀释在5毫升染色缓冲液中。

然后，将组织浸入含有核染料溶液的15毫升锥形管中，并在37摄氏度下孵育，以站立姿势轻轻旋转五天。用15毫升3D核染色洗涤缓冲液在室温下洗涤组织三次，轻轻摇动两小时。计算所需的一抗和二抗量。

在琥珀色的两毫升管中混合一抗和二抗，并在 37 摄氏度下孵育 1.5 小时。对于缓冲液更换，将7.5毫升2x HV1 3D免疫染色缓冲液与7.5毫升双蒸水混合。将组织样品浸入缓冲液中，并在32摄氏度下孵育1.5小时，在水平位置的15毫升锥形管中轻轻摇动。

从缓冲液交换介质中收集组织样品，并将其浸入抗体染色溶液中。在32摄氏度下单独孵育组织一周，以远离光线的站立位置轻轻摇动试管。将组织样品移至四摄氏度，并以站立姿势孵育。

将HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液冷却至4摄氏度后，用15毫升缓冲液在4摄氏度下洗涤样品两次，每次在水平位置轻轻摇晃。在HV1 3D免疫染色洗涤缓冲液中将福尔马林稀释至1%，并将样品在4摄氏度下浸入8毫升溶液中24小时，轻轻摇动。现在，将样品在新鲜的1%福尔马林溶液中在37摄氏度下孵育一小时，并在25摄氏度下在15毫升PBS中洗涤两小时。

将透明器官浸入含有5毫升50%水稀释的CUBIC-R +溶液的50毫升锥形管中，在室温下轻轻摇动。用五毫升100%CUBIC-R +代替，轻轻摇动孵育两天。使用Kimwipes干燥组织，然后将它们转移到六孔培养板中的5毫升封片溶液中，并在室温下孵育。

使用凝胶强力胶将组织粘附在显微镜样品架上。将样品浸入装有120毫升镶片溶液的显微镜石英比色皿中。将它们横向成像到它们的纵轴上，并粘附心脏，顶点和主动脉水平对齐。

与心室相比，3D重建的克氏锥虫感染心脏在心房中显示出更高比例的感染细胞。可以在心脏中识别休眠寄生虫，如3D放大插图所示。表达ZsGreen1的T细胞以及克氏锥虫感染的细胞在感染克氏锥虫的CD8报告小鼠的骨骼肌中可视化。

3D重建图像的3D放大识别了感染细胞区域中的T细胞。通过共聚焦显微镜观察宿主感染细胞中T细胞的界面。在免疫缺陷小鼠的心脏中，检测到感染了两种不同菌株的克氏锥虫的宿主细胞，并且切片组织显示不同组织深度的心房中存在丰富的寄生虫感染细胞。

克氏锥虫感染和清除心脏脉管系统的免疫检测揭示了心脏的复杂脉管系统。在心房中可以观察到寄生虫感染的细胞。骨骼肌的核染色显示细胞核在tdTomato寄生虫很少或检测不到的区域积聚。

用针对RFP和GFP的抗体增强tdTomato和GFP寄生虫报告标记物，以及整个清除的骨骼肌导致强烈的荧光。所以关键点是立方缓冲液中的孵育时间、DNA染料中的稀释和孵育时间、抗体中的孵育时间以及折射率匹配溶液中的孵育时间。使用额外的染色，使用特异性抗体染料和快速反应，可以显着增加该技术的潜力，允许检测完整器官中的多个细胞，过程和结构。

我们现在有一种更好，更完整的方法来探索负责杀死寄生虫的免疫细胞，寄生虫长期存在的组织以及特定药物在组织中的分布。