小鼠脑实质小动脉内皮的分离及功能分析

这种方法将更好地了解实质小动脉内皮的功能，其直接将脑内血流与整个大脑神经元和神经胶质活动的燃料联系起来。与小动脉内皮相比，一个明显的技术优势是增强了单个脑内皮细胞及其各自细胞器之间的形态学尺寸以及钙和电信号传导的分辨率。最初，脑内皮的分离和检查将非常具有挑战性。

但是，可以通过大量的练习以及耐心和奉献精神来掌握这种技术。在烧杯或培养皿中用冷解剖溶液清洗分离的大脑，以从大脑表面去除残留的血液。将腹侧脑侧朝上放在含有冷解剖溶液的腔室中，以隔离实质小动脉。

为了分离实质小动脉，在含有超过50厘米深的木炭注入硅聚合物涂层的培养皿中，用钢针在冷解剖溶液中固定隔离的大脑。在MCA周围用锋利且对齐的解剖剪刀从两个半球切割一个矩形的脑组织，同时确保组织段的上部经过威利斯圆的分支点。将脑组织固定在培养皿中，MCA用钢针朝上。

小心地在针脚附近做一个浅切口，并用小镊子取出pia，从一端轻轻剥离到另一端。用针在培养皿中小心地用从MCA分支的实质小动脉固定孤立的软脑膜，并小心地解剖实质小动脉。切断任何剩余的远端分支，并确保小动脉清洁，没有组织附着。

使用这种干净完整的小动脉进行酶消化。或者，根据需要将每个小动脉切成两块进行酶消化，以制备内皮管。对于小动脉段的部分消化，将完整的小动脉段放入含有木瓜蛋白酶，二硫代赤藓糖醇，胶原酶和弹性蛋白酶的10毫升玻璃管中，放入一毫升解离溶液中。

在34摄氏度下孵育小动脉段10至12分钟。为了分离小动脉内皮管，将与微型注射器注射器连接在腔室中的解离溶液中，并将其放置在靠近消化血管段一端的一端。在泵控制器上将速率设置为每秒 1 到 3 纳升的范围内，以便进行轻柔的研磨。

在保持100X至200X放大倍率的同时，将小动脉段撤回移液管中，然后注射以解离外切和平滑肌细胞。对血管段进行研磨，直到所有平滑肌细胞解离，只有内皮细胞保持完整管状。使用微机械手，用硼硅酸盐玻璃固定移液管中玻璃盖玻片上的内皮管的每一端 要测量内皮膜电位，同时通过4X物镜观察，小心地将尖锐的电极尖端正好定位在小动脉内皮管的细胞上方，用微机械手进入流动的生理盐溶液中。

逐渐将放大倍率增至400X，并根据需要重新定位电极尖端。使用微机械手，轻轻地将尖锐电极的尖端插入内皮管的一个细胞中，然后开始使用静电计记录VM。一旦内皮静息VM在零下30至零下40毫伏范围内稳定，根据实验目标应用所需的药理学药物。

在37摄氏度下用质膜或所需细胞器的荧光跟踪器加载内皮管15至30分钟。用新鲜的超融合生理盐溶液洗涤细胞，并在显微镜下以相应染料的激发波长对活细胞进行成像。通过测量细胞内钙和膜电位来评估内皮功能，以响应药理学药物MTA，一种有效的嘌呤能受体激动剂在37摄氏度。

在应用一个微摩尔MTA时，细胞内钙浓度随着伴随的超极化而迅速增加。此外，用荧光跟踪仪在37摄氏度下孵育完整的内皮，以进行可视化以检查细胞形态。活内皮细胞成像显示质膜和细胞核共染色。

将质膜与内质网荧光染色一起染色，从而在质膜附近明显重叠的ER区域显示为橙色。实验者在解剖和隔离过程中应小心，以避免对小动脉的损伤，因为受损的小动脉肯定不会产生完整的内皮管。手术后，细胞可用于具有荧光抗体的固定免疫组织化学或细胞器和膜脂质的活细胞染色。

该技术将产生新的信息，用于在生理学的基本水平上理解脑血流的潜在机制，并选择向病理学的过渡以进行治疗。