小鼠后肢坏死模型中脚垫脉管系统的高分辨率三维成像

该协议介绍了如何使用质量抑制剂和股动脉凝血来创建小鼠足垫坏疽模型。然后，DiI 灌注可实现足垫脉管系统的高分辨率可视化。该模型具有临床相关性，可用于临床前药物测试和研究肢体缺血。

血管系统的高分辨率可视化为评估新生血管形成提供了一种技术上方便的方法。该足垫坏疽模型在外周动脉疾病和严重肢体缺血的临床前研究中具有重要应用。DiI灌注是研究动物模型新生血管形成的有用工具。

演示该程序的将是外科住院医师Antoine Ribieras和我实验室的研究助理Yulexi Ortiz。首先，在使用前立即向10毫升工作稀释剂溶液中加入200微升DiI储备溶液，制成DiI工作溶液。用手摇匀以充分混合。

串联两个或三个三向旋塞阀和一个 25 号蝶针。准备10毫升注射器，其中4毫升PBS，10毫升DiI溶液和10毫升10%中性缓冲福尔马林。将带有福尔马林的注射器连接到近端流入口，并注入溶液以冲洗管路中的空气。

然后转动旋塞阀以关闭端口。重复相同的过程，将注射器与DiI连接，然后PBS分别连接到中间和远端流入口。安乐死后，将动物置于吸水垫上的仰卧位，并用针头固定腋窝和下肢。

使用剪刀，做一个横向切口打开腹腔，然后暴露并分割左右隔膜以进入胸腔。将胸骨两侧的胸壁从下肋骨切到第一肋骨或第二肋骨。使用止血器抓住胸骨的下端，并将其反射到动物的头部，以暴露胸腔。

识别左心室，其颜色比右心室浅。用钝钳轻轻抓住心脏，将蝴蝶针插入左心室。使用剪刀或18号针刺穿右心房，让血液和灌注溶液返回心脏引流。

用PBS打开注射器的端口，以每分钟一到两毫升的速度手动注射两到四毫升，持续一到两分钟，以冲洗血管系统中的血液。通过观察右心房出血确保成功灌注。注射后，关闭PBS注射器的端口。

用DiI打开注射器的端口，以每分钟1至2毫升的速度注射5至10毫升，持续5分钟。注射后，关闭DiI注射器的端口并等待两分钟，以便在注射固定剂之前掺入染料。用福尔马林打开注射器的端口，以每分钟1至2毫升的速度注射5至10毫升，持续5分钟。

注射后，从左心室取出针头。使用沉重的剪刀，使脚踝处的胫骨脱臼，将左右脚与小腿完全分开。将收获的脚放入装有一到两毫升10%福尔马林溶液的12孔板中。

用铝箔纸包裹盘子，在四摄氏度下储存过夜。第二天，将12孔板中的固定溶液替换为每孔一到两毫升PBS。用手术刀在足底和足背部分做一个纵向切口。

然后使用齿镊子和小止血器，小心地从脚和手指上取下所有皮肤，不要损坏下面的软组织。要安装组织，请将脚分别放在两个玻璃显微镜载玻片之间，两端折叠有泡沫活检垫。使用两个小活页夹将载玻片的两端压缩在一起。

或者，将脚垫放回装有1至2毫升PBS的12孔板中。用铝箔覆盖后，将其储存在四摄氏度下，以保持荧光长达一个月。打开成像系统，启动采集软件，然后使用低放大倍率或低数值孔径物镜拍摄图像。

单击"是"以激活阶段对话框。在配置选项卡中激活 561 纳米激光器。在主屏幕上，通过单击可见按钮激活可见光束路径。

通过单击相应的活动复选框，将探测器设置为570至600纳米范围。选择采集选项卡中的磁贴扫描图标，然后设置所需的分辨率。将干燥的贴装组织样品置于显微镜载玻片之间，并将组织聚焦。

导航到示例的一角。在磁贴扫描菜单下，单击标记位置按钮。导航到对面的角落，然后单击标记位置按钮，再次设置扫描边界。

要设置 Z 轴的深度，请单击实时按钮。导航到样本的中心，然后使用 z 轴旋钮滚动到样本的底部。在 Z 堆栈菜单下的采集选项卡中，单击开始按钮。

滚动到示例的顶部，然后单击结束按钮。单击 z 步长大小并设置为所需值。然后单击"开始"开始图像采集。

该图显示了手术后一周可以从该模型中预期的组织损失变化，FABER评分记录在每张图像的右下角。重建显微镜图像显示，非结扎对照足垫的血管解剖结构正常，术后 5 天结扎后肢脚垫的灌注严重减少。手术后20天，足垫灌注已明显改善，但未达到非结扎控制的程度。

该视频显示，然后使用动画功能创建了表面渲染。冲洗灌注组件中的所有气泡。如果肺在灌注过程中扩张并变成粉红色，则针头已穿透右心室，应略微缩回。

肢体组织可用于免疫染色，以评估肌肉坏死、组织再生、血管密度以及祖细胞和其他组织修复细胞的募集。该小鼠坏疽模型中的DiI灌注技术已用于基因和细胞疗法的研究。该研究旨在改善严重肢体缺血患者肢体的灌注。