从成年、幼年、幼虫和胚胎斑马鱼中分离心脏和血管平滑肌细胞以进行电生理研究

使用膜片钳电生理学研究天然离子通道特性需要访问急性分离的细胞。该协议描述了在不同年龄从斑马鱼访问单个心血管肌细胞的方法。该方案稳健、简单、易于重现，并以相对较高的产量和活力从天然状态下的斑马鱼中分离心血管肌细胞。

首先，将鱼转移到部分充满灌注缓冲液的大培养皿中，并将其置于解剖显微镜下。用非惯用手握住鱼，腹侧朝向解剖镜。用惯用手的细镊子轻轻撕开鱼的胸肌和鳍，露出心血管组织，包括心房、心室和球动脉。

轻轻拉动动脉球和腹主动脉相交尖端的球动脉。通过捏住镊子小心地将球动脉与主动脉分开，将心房的尖端定位到会聚的多个静脉分支中。然后，将心房的尖端从静脉窦上拔出，将心血管组织与身体其他部位隔离开来。

要解剖心肌细胞，请将心房和心室从心血管组织中拔出。使用细镊子轻轻撕裂心室以排出多余的血液，当心脏组织从鲜红色变为浅鲑鱼色时，可以确保这一点。将分离的心房和心室汇集到含有灌注缓冲液的单独 1.5 毫升离心管中。

用750微升消化缓冲液替换管中的灌注缓冲液。将试管放在37摄氏度和每分钟800转的热摇床上。允许消化组织，直到它们变成半透明。

通过在台式微型离心机中以2， 000倍G轻轻旋转组织三到五秒钟来结束消化，并用750微升停止缓冲液替换上清液消化缓冲液。用 500 至 750 微升灌注缓冲液轻轻替换停止缓冲液，并使用火焰抛光的巴斯德移液管研磨组织 30 次以分散细胞。然后，轻轻研磨心室。

为了均匀采样，轻轻地上下移液细胞几次以重新悬浮，然后加入一滴细胞进行相应的研究。从心血管组织中取出成人球动脉，并将五个球状动脉汇集到含有 S1 缓冲液的 1.5 毫升离心管中。用 400 微升 S2 缓冲液替换 S1，并在 37 摄氏度和每分钟 800 转的恒温摇床上让木瓜蛋白酶消化球动脉球，持续 20 分钟。

让部分消化的球状动脉稳定一分钟，并用500微升含有胶原酶的S3缓冲液替换S2上清液。在37摄氏度和每分钟800转的恒温摇床上消化组织三到五分钟。通过在台式微型离心机中以2， 000倍G轻轻旋转组织三到五秒钟来结束消化，并用500微升S1替换S3上清液。轻轻研磨沉淀组织以分散血管平滑肌细胞。

将分散的血管平滑肌细胞板铺在适当大小的玻璃盖玻片上。将盖玻片在室温下保持 30 分钟，以便细胞附着，并在接下来的 6 小时内使用它们。麻醉胚胎。

然后，通过将胚胎转移到五毫升离心管中来浓缩胚胎，然后去除多余的培养基。用三毫升冷灌注缓冲液清洗胚胎两次，然后将其重悬于两毫升灌注缓冲液中。使用胚胎心脏隔离装置，将一毫升胚胎吸入针头中，并立即将它们排出回管中。

将破碎的胚胎通过放置在漏斗中的100微米细胞过滤器筛。将过滤后的心脏收集在另一个五毫升离心管中。充分混合滤液，将一毫升等分试样分离到 1.5 毫升离心管中。

将所有管在台式微型离心机上离心五秒钟，然后弃去上清液。使用一毫升灌注缓冲液对管中的颗粒进行连续重悬。轻轻上下移液心脏两次，然后加入一滴进行相应研究 对于从动脉球分离的细胞，通过tagln:EGFP表达确认血管平滑肌细胞。

此处显示了分离心肌细胞中ATP敏感钾通道活性记录的代表性痕迹。在从胚胎心脏切除的贴片中获得成功的单通道记录。心室肌细胞表现出稳定的超极化膜电位，并通过贴片移液器注入电流来刺激动作电位。

心房肌细胞表现出自发动作电位放电。此处总结了动作电位属性。在心肌细胞解离过程中更换缓冲液时，应注意消化组织不受干扰。

组织碎裂只能通过移液器研磨完成。在球茎组织的胶原消化过程中，每分钟检查一次漂浮、扩张和半透明的组织。一旦组织破碎明显，就停止消化。

一旦细胞被分离出来，它们可以存活数小时，并使用膜片钳技术用于电生理分析。例如，这使我们能够证明这些斑马鱼组织中ATP敏感的钾通道与哺乳动物中的钾通道基本相同。