高分辨率呼吸测定法，使用基于腔室和板式呼吸计评估细胞和组织中的生物能量学

线粒体通过氧化磷酸化提供细胞能量，有助于细胞内几乎所有过程。因此，线粒体功能障碍与多种疾病有关。该技术的主要优点是通过氧气消耗实时测量线粒体生物能量，从而准确评估总细胞能量代谢。

高分辨率呼吸测定法可以直接评估氧化磷酸化系统中的缺陷，从而可能为原发性线粒体疾病和与许多疾病相关的继发性线粒体功能障碍提供诊断线索。演示该程序的将是我实验室的博士生Ryan Awadhpersad。首先，通过在37摄氏度下在2.1毫升线粒体呼吸介质中运行呼吸计超过45分钟来执行氧气校准，如果基线变化在每秒四微摩尔以内，则继续进行。

在高糖DMEM中培养HEK293细胞，并在37摄氏度下以5%二氧化碳的培养箱中补充10%热活化的FBS，GlutaMAX，非必需氨基酸，丙酮酸钠和尿苷。在实验当天，收集并计数细胞，并在2.5毫升呼吸培养基中重悬250万个细胞。为了评估常规呼吸，向腔室中加入2.3毫升温呼吸培养基细胞悬浮液。

在37摄氏度和700 RPM的搅拌速度下运行腔室。等待至少三分钟，让介质脱气，然后通过旋转运动扭转塞子来关闭腔室。接下来，将多余的液体吸出塞子的顶部。

10分钟后，获得稳定的氧通量信号以记录常规或状态I呼吸。为了在完整细胞中进行OXPHOS分析，加入两微升0.01毫摩尔寡霉素，最终浓度为10纳米摩尔。通过以 0.2 微升步长添加 0.6 微升，从两毫摩尔储液中滴定 FCCP，直到未观察到呼吸增加且呼吸最大程度地分离。

接下来，加入一微升一毫摩尔鱼藤酮，最终浓度为0.5微摩尔。然后，加入两微升每毫升一毫克的抗霉素储备液，最终浓度为每毫升一微克。通过提起柱塞将腔室重新氧化至相同的氧气水平，约150微摩尔。

然后，加入五微升0.8摩尔抗坏血酸，最终浓度为两毫摩尔。然后，立即加入五微升0.2摩尔TMPD，最终浓度为0.5毫摩尔，并评估复杂的静脉活性。当TMPD达到峰值氧通量时，加入5微升或4摩尔叠氮化物，最终浓度为10毫摩尔。

然后，继续运行至少五分钟，以测定TMPD的自动氧化，以进行复杂的IV碱基水平计算。运行后，从每个腔室收集一毫升样品悬浮液，对于透化细胞，以1， 000 G离心，对于组织裂解物，以20， 000 G离心。然后，弃去上清液并将沉淀在零下80摄氏度冷冻，以进行进一步的下游分析。

首先，根据单个细胞系的生长速率接种细胞。将稀释的寡霉素，FCCP，鱼藤酮和抗霉素在三微升的测定培养基中，最终浓度分别为1.5微摩尔，1.125微摩尔和一微摩尔。随后，将它们填充到单独的端口中。

观察进样口，确保样品均匀上样。打开基于微孔板的系统和计算机，并在37摄氏度下平衡至少三个小时。在基于微孔板的测定当天，验证细胞培养板的汇合度，细胞的形态，并确保背景孔是空的。

然后，从每个孔中除去除20微升培养基之外的所有培养基。然后，用90微升的测定培养基洗涤每个孔，并加入100微升的测定培养基，使最终体积达到120微升。接下来，将板在37摄氏度下在没有二氧化碳的培养箱中孵育60分钟。

从培养箱中取出板后，取下盖子并将微孔板放入插槽中。单击"继续"开始运行。运行完成后，取出板并除去剩余的测定介质，而不会干扰细胞。

然后，将整个板在零下80摄氏度冷冻。在进行洋地黄素通透和呼吸实验后，记录了野生型HEK293细胞和HEK293细胞的原氧消耗痕迹，其中CRISPR介导的基因敲除导致多种OXPHOS缺乏。获得覆盖的细胞输入归一化耗氧迹线。

CRISPR敲除1显示呼吸受损，CRISPR敲除2在归一化为细胞数量时与野生型相比没有呼吸。量化蛋白质量，并将呼吸值归一化为蛋白质量，以确定呼吸状态的绝对值和相应的通量控制比。在CRISPR敲除2中发现OXPHOS缺乏症的细胞外酸化率增加，这表明通过增加糖酵解来补偿HEK293细胞中的线粒体氧化磷酸化缺乏症。

此外，在寡霉素，FCCP和鱼藤酮存在下测定呼吸值，并将获得的值归一化为蛋白质量。研究了野生型HEK293细胞和HEK293细胞的蛋白质归一化耗氧痕迹，其中CRISPR介导的线粒体翻译缺乏导致多种OXPHOS缺乏症。获得湿重组织正常化小鼠小脑和小鼠比目鱼肌的耗氧痕迹。

比目鱼肌表现出比小脑高三倍的OXPHOS和呼吸能力。使用基于腔室的呼吸测定法，快速工作非常重要，因为线粒体功能会在您收集样品的那一刻下降，而使用基于板的呼吸测定法，获得最佳的播种密度以最大限度地减少变异性至关重要。对于进一步的分析，蛋白质定量或免疫印迹是可能的。

这可以确定线粒体呼吸功能的改变是由于OXPHOS复合物的丰度还是线粒体的量。早在一个世纪前，人们就发现癌细胞除了线粒体OXPHOS之外，还进行厌氧糖酵解。这强调了测定线粒体生物能量学的必要性。

在这里，我们展示了两种被认为是当今黄金标准的呼吸计。