在胚胎中，细胞相互作用，交换化学和机械信息。探测这些相互作用的一种有效方法是杀死一些细胞并监测对邻近细胞的影响。我们描述的方法使我们能够准确地消融细胞，即使在胚胎内，也不会损坏邻近组织。
通过将第一激光设置为烧蚀波长为820纳米，并将第二激光设置为mCherry成像波长1，160纳米来准备双光子显微镜。使用光路上的可移动反射镜，将两束激光束对准扫描头的入口和出口，然后测量第一个激光器在820纳米处的最大功率。将功率计放在物镜下方，关闭黑室，并将第一激光功率设置为100%开始在功率计上收集数据，打开激光快门，然后测量输出功率并计算达到300毫瓦所需的激光功率百分比。
将第一个激光器设置为 920 纳米的 GFP 激发波长和 7% 将第二个激光器的功率调整为 15% 激活 PMT 探测器的绿线和红线，并将绿线和红线 PMT 灵敏度设置为 65。将视场调整为 400 x 400 微米，将图像分辨率调整为 512 x 512 像素，并将扫描频率调整为 800 赫兹。选择 3D 延时成像模式，然后创建一个文件夹并激活自动保存以在每次采集后保存数据。
组装加热室并将其设置为28摄氏度。等待至少10分钟，使腔室和目标变暖。在荧光立体显微镜下，以70%的密度鉴定表达GFP的胚胎。
使用塑料巴斯德移液器，将三到四个选定的胚胎转移到琼脂糖包被的培养皿中，并用细镊子小心地将它们去脉。在一个小玻璃小瓶中，加入一毫升含有2%琼脂糖的青霉素 - 链霉素胚胎培养基溶液，并将小瓶置于预热的42摄氏度的干燥块加热器中。使用火抛光玻璃移液器，将去壳的胚转移到小瓶中，注意不要向琼脂糖中添加过多的胚培养基。
从移液器中丢弃剩余的胚胎培养基。将胚胎吸回，并吸出足够的琼脂糖以覆盖玻璃底皿的载玻片。将琼脂糖与胚胎一起吹在培养皿的载玻片上，确保胚胎不会接触空气或培养皿的塑料侧。
然后，用琼脂糖填充载玻片周围的腔室。使用睫毛，定向胚胎，使目标区域位于顶部。五分钟后，当琼脂糖完全凝固时，向载玻片中加入几滴青霉素 - 链霉素胚胎培养基。
将玻璃底盘放在加热室中物镜下方。在关闭腔室之前，将物镜浸入青霉素 - 链霉素胚胎培养基中。移动滑块以设置目镜的光路。
打开荧光灯。找到一个胚胎，并将焦点放在它的表面。关闭荧光灯并将光路设置为PMT，然后再关闭黑室。
开始实时成像并定位轴向中胚层。要获得良好的信号，请调整激光功率。使用红色通道将阶段移动到胚胎的最顶部，并将此位置指定为Z等于零。
选择一分钟的时间步长和两微米的 Z 步长。将第一个切片设置在轴向中胚层上方 15 微米处，将最后一个切片设置在轴向中胚层下方 15 微米处。录制 10 到 15 分钟的消融前电影。
在实时成像中，找到光栅轮廓，然后使用感兴趣的电光调制器区域或EOM-ROI工具，绘制一个跨越光栅宽度的20像素大矩形，并将矩形放在极格的中间。注意要烧蚀的最高和最低平面的轴向位置，确保ROI不会与任何平面上的蛋黄池重叠。将载物台放置在要消融的最低 Z 位置。
将第一个激光波长设置为820纳米，并输入前面计算的功率百分比，以获得300毫瓦的退出功率。将成像频率设置为 200 赫兹，并将第一个激光成像 EOM 设置为零。选择 ROI 处理模式后，关闭 EOM，并将处理设置为在零帧后立即开始。
将成像模式设置为延时摄影并停用自动保存。在"时间步长"中选择"快速模式"后，将处理帧数和帧数调整为与目标深度相对应的值。开始成像。
采集应为黑色，因为在 EOM 处理期间 PMT 的快门关闭。接下来，将舞台上移到下一个Z位置，并同样执行消融。在每个 Z 位置重复此步骤，直到到达 polster 的顶部。
烧蚀过程完成后，将第一激光器设置为920纳米，并调整到先前选择的成像功率。将第一个激光成像EOM设置为100，然后选择全场模式。成像频率应为800赫兹，在实时模式下检查整个堆栈之前，应关闭EOM，以检查每个平面是否已被烧蚀。
确认烧蚀后，选择3D延时作为成像模式。重新激活自动保存，并开始录制消融后短片 40 到 60 分钟。在消融后电影中，检查靶细胞是否有效消融。
由于整个桫椤的消融不应损害胚胎，因此可以在受精后24小时内观察到消融胚胎的正常形态。在激光消融的成功结果中，覆盖的组织不受底层结构消融的影响。太密集的治疗，或太少的治疗，导致激光消融失败。
不成功消融的例子显示，桔体上方的细胞被消融，这从极光体上方焦平面的自发荧光碎片中可见一斑。在另一个无效的尝试中，细胞被漂白但未被消融，低荧光信号仍然显示完整的细胞轮廓。最后，由于激光处理不足，一些细胞甚至没有漂白。
气泡的形成是由于过于强烈的激光处理引起的空化。在成功的消融中，每分钟捕获Z-堆栈40分钟，记录细胞质GFP和核mCherry信号。此外，属于栉水星前半部分的细胞核用洋红色点标记，并随着时间的推移，在消融之前和之后进行跟踪。
作为迁移持久性的衡量标准，研究了消融前后细胞的方向自相关。属于桔梗前部的细胞在消融前表现出持续的运动，在消融后急剧减少，表明集体定向迁移的丧失。正确对准激光器和测量激光功率对于获得可重复的结果至关重要。
检查第一张消融后图像上的消融效率也是关键。我们使用激光消融来质疑细胞 - 细胞相互作用在指导胚胎内细胞迁移中的作用。但该程序可以很容易地适应许多其他问题，其中细胞或组织需要精确消融，可能在生物体深处。
