Name: investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series at JoVE.com

这项工作得到了国家卫生研究院授予GM118085的支持，部分得到了罗伯特·韦尔奇基金会的支持（授予R-1811R.M.H.）。

1. 在缺乏活动力的菌株中分离抑制突变体
注:使用此方法作为广泛的"捕获所有"，以确定动能缺陷的一般性质。
<ol><li>软加板准备 注:软阿加，也被称为运动或游泳的阿加，是一个低百分比的阿加（+0.2-0.35%w/v），长期用于检测化疗31，32。<ol>
<li>在 2 L 圆形底烧瓶中加入 3 克 bacto-agar（0.3% w/v） 和 20 克 LB。在烧瓶中加入 1 L 的 ddH2O（双蒸馏水），然后使用搅拌棒和磁搅拌板均匀地混合悬架。</li>
		<li>高压灭菌 20 分钟，121 °C。</li>
		<li>使用上面的杆/板，让温和的搅拌冷却。当温度达到约 50 °C 时，将 25 mL 倒入无菌的 Petri 盘（100 mm x 15 mm），并允许熔融的 agar 将盖子固定至少 1 小时，用于 16 小时内。</li>
	</ol></li>
	<li>抑制突变体的文化准备、接种和隔离 注: 大肠杆菌 在营养丰富的介质中心接种，用软醋凝固，在当地消耗营养物质，从而产生它们遵循的营养梯度。当它们向外移动时，定义的"环"出现（图1A），这与细菌对特定的化学作用有关。化疗系统或旗杆菌电机结构部件的缺陷可能会损害此检测中的性能。通常，具有活动优势的突变体在筛选过程中出现，并且可以看到从单点或环外围的多个点出现，从它们"燃烧"出来的地方（图1C）。人们会注意到，游泳前部最外侧的边缘很容易与未殖民的处女软阿加形成对比。<ol>
<li>在 5 mL 的伦诺克斯兄弟 （LB; 10 g/L 试剂酮， 5 克/升酵母提取物， 和 5 克/升 NaCl， 材料表） 在 30 °C 水平摇晃 （220 r.p.m.第二天，亚文化（1:100稀释）在新鲜LB，在相同的条件下增长到指数阶段（OD600 的0.6）。</li>
		<li>使用移液器将 6 μL 的培养物接种到软醋板 （1.1） 的中心，将装载的无菌尖端推入 Agar 以轻轻排出其内容。转移到30°C并孵育（图1B），直到运动"火焰"明显，从接种点或运动环的外围发出，通常在24-36小时（图1C）。 注:在动感分析中，在突变隔离物旁边接种野生菌株进行比较。这种野生型菌株将显示出典型的同心化学环（图1A），并在8-10小时内填充板。</li>
		<li>使用无菌线环将细胞从"火焰"区域和条纹中提升，将单个菌落纯化到 LB 硬阿加板上（如上所示，用 15 克/升的 bacto-agar 凝固）。</li>
		<li>使用无菌线环从条纹板中挑选单个菌落，并通过单个菌落的条纹重新净化，以确保隔离"纯"菌落隔离。</li>
	</ol></li>
	<li>抑制突变体的确认和特征
	<ol>
<li>确认孤立的抑制突变体已恢复活力。准备软加板（1.1），以及感兴趣的菌株（如1.2.1），包括野生类型和开始的"缺乏活力"菌株进行比较。</li>
		<li>在 30 °C 下接种板（如 1.2.2），在 8-10 小时孵育。</li>
		<li>记录最外环（圆的边缘）的直径，并比较确定哪些隔离物已显著恢复活力。 注:建议在整个实验过程中拍摄板材。为了获得最佳效果，请使用"光桶"设备30，其中数码相机安装在光源上方，以便更好地照明，以测量游泳殖民地的直径，并将其与未殖民化的偶发体区分开来。</li>
		<li>经验证的受试者可根据需要与 WGS 隔离，从而获得足够的"序列覆盖"，从而积极识别恢复野生类型功能的突变。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 通过细胞系绳量化旗杆菌运动行为
注意:当正常运行翻滚行为（化学轴）出现受损时，使用此方法。
<ol><li>
文化准备和旗杆切口
	<ol>
<li>准备第 1.2.1 步中描述的兴趣应变的指数阶段文化。</li>
		<li>以 2，000 x g 离心方式将 10 mL 细胞颗粒 10 mL，在 3 分钟内再悬浮在 10 mL 的过滤灭菌运动缓冲器 （MB） 中: 10 mM 磷酸钾缓冲器 [0.0935 M K2HPO4， 0.0065 M KH2PO4， pH 7.0]， 0.1 mM EDTA [pH 7.0]， 10 mM NaCl， 75 mM KCl）. 注:MB支持 活性， 但不支持细菌生长</li>
		<li>重复步骤 2.1.2 两次，然后在 1 mL 的 MB 中重新暂停最后颗粒。</li>
		<li>将电池悬架转移到 1 mL 注射器中，并将 23G 针头连接到末端。组装相同的注射器/针具，并通过6英寸的聚乙烯管（内径0.58毫米）将两者连接在一起，紧紧地套在每根针尖上。</li>
		<li>通过轻轻地将细胞悬架从一个注射器来回传递到其他 50 倍，每 10 次通过之间暂停 1 分钟，从而剪切旗杆（它们很脆弱，很容易断裂）。</li>
		<li>将切变电池以 2，000 x g 离心 3 分钟，最后卷为 500 μL MB。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
幻灯片制备和细胞系绳
	<ol>
<li>通过将 18 mm x 18 mm 的盖片堆叠在 3 英寸 x 1 英寸 x 1 毫米玻璃显微镜滑动上，通过双面胶带（图 S1）分离，准备细胞固定室。</li>
		<li>通过应用到腔室顶部，用 0.01% （w/v） 多赖氨酸溶液冲洗腔室。将底部边缘（覆盖唇与显微镜滑动一起冲洗）倾斜到任务雨刷器（纸巾）上，以帮助通过腔室绘制溶液（图 S1）。然后在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>使用第 2.2.2 步中描述的 40 μL MB 清洗腔室三次</li>
		<li>将 40 μL 的剪切细胞悬架（上图所示）添加到腔室顶部，并在室温下孵育 10 分钟，使细胞附着在盖唇上。</li>
		<li>轻轻冲洗腔室与 40 μL 的 MB 在 2.2.3 中删除未连接的细胞。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
细胞旋转记录和量化
	<ol>
<li>将装有系绳细胞的显微镜滑梯转移到显微镜阶段。</li>
		<li>使用相对比显微镜和100倍目标，扫描人口，寻找固定到位的细胞，并在单轴上旋转，即在固定点上平稳旋转，而不是以细胞进出聚焦的角度呈现（视频1）。</li>
		<li>使用商用显微镜和相关摄像机。打开相关软件，确保感兴趣的单元格处于对焦状态，并单击 视频采集 以录制一分钟的单元格旋转（每秒 10 帧或更高）。</li>
		<li>从视频播放中，量化每分钟完整旋转次数和细胞改变方向（切换频率）的次数。 注:旋转速度和切换频率可能太快，无法用眼睛测量，因此建议使用视频软件提供慢/精细播放，或采用自动化软件系统来量化旋转模式33。另一种选择是使用甲基纤维素（或类似剂）增加MB的粘度，以帮助减缓和解决更快的细菌的旋转，或在使用帧速率低的相机时进行补偿。</li>
		<li>重复步骤 2.3.2 与生物复制，以编制感兴趣的人口的表示。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 在过境分析中准备成群
注意:使用此方法评估突变或条件对群体活力的影响。沼泽-阿加是指通常高于软阿加的百分比的阿加。在软阿加（0.3%）中，细胞在亚加体内单独游泳。在群加（0.5%及以上）中，细胞在表面上作为一组移动。虽然蜂群板必须在这里详细使用，但游泳板的保质期更长，并且可能使用数天。我们的个人喜好是在1-2天内使用。
<ol><li>
准备群阿加
	<ol>
<li>在 2 L 圆形底烧瓶中加入 5 克 Eiken agar（0.5% w/v） 和 20 克 LB。在烧瓶中加入 1 L 的 ddH2O，然后使用搅拌棒和磁搅拌板均匀地混合悬架。</li>
		<li>高压灭菌 20 分钟，121 °C。</li>
		<li>允许用温和的搅拌冷却，以避免使用上面的杆/板的任何气泡。当大约 50 °C 时，添加过滤消毒葡萄糖，最终浓度为 0.5%。</li>
		<li>将 25 mL 倒入无菌的 Petri 菜肴（100 mm x 15 mm），并允许在室温下设置至少 14 小时且不超过 20 小时。不要存储供将来使用。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蜂盘的接种和孵化
	<ol>
<li>通过在 agar 顶部发现 6 μL 的中指数文化（如 1.2 中准备）接种。</li>
		<li>将盖子关闭 5-10 分钟，当接种管干燥到阿加表面时更换。</li>
		<li>在 30 °C 下孵育 8 小时。通过移除盖子来避免检查群进度的诱惑，因为这将有助于干燥的阿加和受损的蜂群。 注:孵化时间可能因应变表型而异。一些孤立的突变可能会阻碍成群的能力，需要降低加糖百分比或更长的潜伏期。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
准备过境检测板 注:此检测使用改良的培养皿，其中塑料隔（边）创建两个腔室，而不是一个腔室（图 2A）。每个腔室可以独立于其他房间准备，在"连接"两个房间之前，为蜂群提供不同的条件。根据实验设计，第一个腔室（指定左）可以准备与游泳的阿加（0.3%w/v）或群阿加（0.5%w/v），从那里细菌可以越过边界迁移到右室含有蜂群阿加+/-任何必要的补充或挑战（例如，抗生素）。对任何一种阿加的迁移通常通过记录细菌殖民化（边缘到边缘）从原始接种点的最宽直径来测量/比较。<ol>
<li>如果需要，准备 1.1 中描述的游泳阿加。</li>
		<li>准备3.1中描述的群加。</li>
		<li>将 +30 mL 的蜂群阿加（如果需要，需要补充）倒入双隔间 Petri 盘（100 mm x 15 mm）的右室，使其与腔室之间的塑料分隔器平起平落，但不会溢出到左侧（图 2B）。</li>
		<li>在阿加变硬后，用+30ml的游泳或蜂群的阿加填充左室，再次到与塑料隔线接触点（图2C）。在设置之前，使用无菌移液器尖端轻轻地将阿加拖过边界，将两侧连接起来，连接横跨整个鸿沟长度的 +1 毫米高的阿加桥（图 2D）。</li>
		<li>让盘子在室温下干燥（3.1）。 注:创建桥梁的另一种方法是让左室醋干燥，然后沿着塑料分隔器缓慢移液器 +100 μL 熔融群醋，以连接两个腔室 （3.4）。在 30 °C 孵育 12-16 小时之前，或直到蜂群在右腔上取得足够进展，以便比较感兴趣的菌株之前，如上文所述，为左室的盘子接种疫苗（1.2.2）或群（3.2）agar。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

作者没有什么可透露的。

抑制剂突变的分离和定性成功地帮助识别了化疗系统35、36、37以及电机机械本身38、39、40的关键部件。在使用第1号议定书时，必须包括多个独立复制，以确保隔离大量可能的突变，以弥补活动性损失。通过将培养体划入一条线而不是一个点来增加细菌的数量，可以提高产生抑制剂41的机率。同一突变的分离（由DNA测序确定）多次增加对其真实性的信心。WGS 将始终揭示基因组中存在其他突变。因此，重要的是通过将所识别的突变（在可能的情况下）转回原始缺乏活力的背景来验证结果。抑制突变方法的根源在于通过二次突变恢复功能，因此该方法的局限性是，如果删除了关键结构基因，即支撑整个途径或结构的基因，则可能没有补偿的余地。尽管是一种老方法，但我们最近的工作34证明了它在阐明有助于细菌活性的新途径方面继续有效。
对于电机输出的量化，细胞系绳方法仍然是一个普遍访问的工具，只需要一个显微镜与相机附件。细胞系绳已经用于各种细菌物种，包括沙门氏菌42，伪多莫纳斯43，链球菌44和罗多细菌33。协议的成功在很大程度上取决于细胞的适当剪切和附着。剪切过于剧烈或省略剪切之间（2.1.5）之间的停顿往往会促进灯丝的不一致或不完整的剪切，导致非运动细胞或细胞系在偏斜轴上。尽管许多研究小组（包括我们的）通过了更高分辨率的珠子检测，但该协议的持久相关性依然存在。珠子检测的主要局限性来自于珠子需要粘附感兴趣的细菌的丝状物。这项技术大大受益于大肠杆菌的研究，该研究发现了一种"粘性"旗蛋白等位基因，从而促进粘性45。粘性变种在细胞束缚分析中也更胜一筹。大多数被标记的细菌尚未获得这种变种。情况进一步复杂化，一些生物拥有多种旗蛋白46，在Vibrio sp.的情况下，也拥有一个模膜护套47。细胞系绳也可以使用特定物种的抗弗拉格林抗体或工程表位标签的抗体进行。
虽然细菌在进入液体介质后可以立即游泳，但蜂群并不是这样，因为细胞必须首先进入蜂群状态。表面接触触发细胞启动群48，49，50，51所需的生理变化，导致滞后阶段和高细胞密度的积累。生理变化包括大肠杆菌16中的化疗系统改造，以及其他细菌13、14、21的细胞拉长和/或恶性膨胀等适应。鉴于启动蜂群所需的生理变化，我们提醒大家注意一些研究，这些研究试图模仿群的某些方面，例如高密度或增加细胞长度，只是通过集中浮子细胞培养来增加密度，和/或使用抗生素来诱导细胞拉长，从而抑制细胞分裂52，53。如果使用细胞拉长作为标记，我们也提醒说，与浮子细胞相比，沙门氏菌或大肠杆菌54中群细胞的平均长度只有小幅增加。沼泽检测比游泳检测更难确定。变量包括用于凝固介质的阿加的商业来源（特殊的Eiken agar是大肠杆菌成群必需的，而更标准的Difco agar支持蜂拥所有其他细菌），使用丰富的和最小的介质（大肠杆菌和沙门氏菌需要葡萄糖补充），和最关键的环境湿度2，13，14，21。其中，保持最佳湿度可能是最令人沮丧的。[莫拉莱斯-索托和同事55证明了在选择的有机体（伪多莫纳斯航空）中蜂群的出色、有条不紊的优化。沼泽媒体必须足够潮湿，以促进蜂拥而至，但不要那么潮湿，允许被动传播/滑动，这很容易被误认为是主动蜂群56。因此，在显微镜下检查群群以确认与这种集体活动相关的不同运动模式至关重要（视频2）。温度也是优化蜂群测定的重要考虑因素。例如，更高的温度（例如 37 °C）会比 30 °C 的温度更早干燥板材。 使用具有湿度控制的孵化器（+70-80%） 可以帮助缓解这些问题，包括可能影响内部建筑温度和湿度的季节性变化。一旦成功建立，协议3提供了一个强大的方法来调查蜂群细菌最有趣的方面之一，提高抗生素的耐药性17。此处描述的所有协议都可以应用于新的生物体，以识别指定和控制旗杆体介质的动能的路径。

细菌在其生态利基中利用许多附属物进行运动和分散。弗拉盖拉驱动的动能是其中最快的，促进有利地区响应环境信号的殖民化，并大大有助于一些物种2，3的致病能力。旗菌可以单独在散装液体中游泳，或集体聚集在半固体表面4。细胞外旗手附着在膜内，由嵌入膜的旋转电机驱动，该电机利用离子梯度的功率产生扭矩，导致旋转 1、2、4、5、6、7、8。在大肠杆菌中，电机以恒定的扭矩9运行，电机输出可以按旋转速度和转子在逆时针 （CCW） 和顺时针 （CW） 方向之间的切换进行分类。CCW 旋转促进形成一个连贯的旗杆束，推动细胞向前（运行），而旋转方向 （CW） 的瞬时开关导致束部分或完全拆解10，细胞重新定位其游泳方向（翻滚）。大肠杆菌通常运行一秒钟，跌落十分之一秒。转子或"翻滚偏置"的切换频率由化疗信号系统控制，其中转子切除器检测外部化学信号并通过磷化物将其传输到旗杆电机，以延长运行以响应吸引物，或抑制它们以响应有毒化学物质11，12。游泳运动在0.3%的软性啤酒中测定。
在蜂拥而至时，细菌在半固体表面作为密集的集体导航，细菌群在连续旋转运动中流淌2、13、14、15。大肠杆菌群表现出化学感官生理变化（较低的翻滚偏差），更高的速度，和更高的耐受性抗菌细胞在散装液体中游动16，17。沼泽人部署的策略，以帮助运动，包括表面活性剂生产，恶性通货膨胀，和细胞拉长2。沼泽为细菌提供了在生态和临床环境中的竞争优势18，19，20。有两类蜂群细菌:温带蜂群，它只能聚集在媒体凝固与0.5-0.8%的阿加，和强大的蜂群，它可以导航通过更高的阿加浓度21。
存在各种分析来询问游泳的活力及其规定。当受到突变或环境条件的损害时，活动本身为识别功能增益抑制剂突变提供了强有力的选择。这些抑制剂可以是原始突变的真正还原剂，也可以是伪反变剂，其中第二个突变会恢复功能。这种突变体可以通过全基因组测序（WGS）来识别。不偏不倚的抑制器选择的替代方案是偏颇的靶向突变策略（例如 PCR 突变）。这些方法往往揭示了动能装置的功能或环境调节。如果目标是研究运动功能，那么用软糖测量的野生型运动性的恢复不一定意味着野生型运动输出的恢复。细胞系绳检测，其中细胞通过单个旗杆连接到玻璃表面，随后对细胞体的旋转进行监测，可以作为评估运动行为的初始选择。虽然现在可以采用更复杂的方法来监控电机性能，但所需的高速摄像头设置和用于运动分析的软件包限制了其广泛使用 22、23、24、25。细胞系绳检测仅要求剪切旗杆，允许将短丝附着在玻璃滑梯上，然后录下细胞体的旋转。虽然记录的电机速度在本次测定中较低，因为细胞体对旗手施加了高负荷，但此测定还是有助于对化学反应 26、27、28、29 进行有价值的见解，并且仍然是下面讨论的有效调查工具。
沼泽的活力给研究人员带来了一系列不同的挑战。功能抑制器的选择只在产生大量表面活性剂的群中有效，并且容易地蜂拥而至。表面活性剂非生产者，如大肠杆菌是挑剔的选择，在阿加的选择，媒体组成和湿度的环境2，13，14，21。一旦蜂群条件建立，过境分析17是一个有用的方法来询问群导航新的/苛刻条件的能力。虽然下面提出的协议与大肠杆菌有关，但它们很容易适应其他物种的应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken agar</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>Essential for E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td>410955000</td><td></td></tr><tr><td>LB (Lennox) Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine Solution (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials and Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>Or equivalent software for microscope used</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>Frosted microscope slides 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 microscope</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>Any upright or inverted phase microscope can be used</td></tr><tr><td>Petri dishes (100 mm diameter)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>For soft-agar assays</td></tr><tr><td>Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td>9908265</td><td></td></tr><tr><td>Round Petri Dish with 2 Compartments</td><td>VWR</td><td>89200-944</td><td>For border-crossing assays</td></tr><tr><td>Safety Hypodermic Needles (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringe - 1 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>Task/Tissue wipes</td><td>Fisher scientific</td><td>06-666</td><td>Or equivalent single use tissue wipes</td></tr><tr><td>VWR micro cover-glass 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 camera</td><td>Olympus</td><td>XM10</td><td>Or equivalent microscope camera</td></tr></tbody></table>

investigating flagella-driven motility in escherichia coli by applying three established techniques in a series

活力对许多细菌物种的生存和成功至关重要。存在许多方法来利用动感来理解信号通路，阐明旗手部件的功能和组装，并检查和理解运动模式。在这里，我们演示了其中三种方法的组合。软性阿加的活力是最古老的，为分离体弱化菌株中的功能增益抑制剂突变提供了强有力的选择，通过第二次突变恢复活力。细胞系绳技术首先用于演示旗手电机的旋转性质，可用于评估信号效应器对电机速度的影响及其切换旋转方向的能力。"越境"检测是最新的，游泳细菌可以准备过渡到集体移动成群。综合起来，这些协议代表了一种系统而有力的方法，用于识别运动机械的部件，并描述它们在游泳和蜂拥而至的不同方面的作用。它们可以很容易地适应研究其他细菌物种的动能。

我们实验室34的最新研究详细介绍了大肠杆菌株中伪还原体的分离，其活动性因信号分子c-di-GMP的高水平而受损。这种菌株（JP1442）有两种突变:yhjH和+ycgR。YhjH是大肠杆菌中降解c-di-GMP的最活性磷二酯酶。缺乏 Yhjh 会导致 c - di - gmp 水平升高和抑制动能。Ycgr 是 c - di - gmp 效应器。在与 c-di-GMP 的复合体中，YcgR 与旗杆转子结合，首先诱导 CCW 电机旋转，然后降低电机速度。细胞系绳和珠子测定表明，运动行为恢复正常的双突变体，但软阿加的活力没有34。因此，我们部署了协议的第 1 步，以隔离双突变体中的伪反向耀斑（图 1C）。WGS（HiSeq 4000平台，PE 2 x 150设置34）映射到rsB的大部分突变，它编码的反应调节器/适配蛋白，通常指示LpXP蛋白酶瞄准σ S降解34。其中一种还原体，显示接近野生类型的动感（AW405，比较图1A，D），用于产生具有代表性的结果，第2步和第3步的协议部分，用作控制其双突变父（图1B）和同源野生型菌株（图1A）。
对于协议部分的第 2 步，对视频捕获进行了分析，以计算每分钟旋转（每 360° 完全旋转）和 CW偏差（时间电机在 CW 方向旋转或翻滚偏置的分数）。与野生类型相比，yhjH每分钟显示的旋转更少，CW 偏置率较低（图 3）。yhjH +ycgR双突变体及其抑制剂均显示运动行为类似于野生类型，先前的分析支持了上述工作34中详细介绍的高分辨率"珠子"检测结果。
对于协议部分的第3步，过境检测（图2）用于比较野生类型和抑制器隔离的能力，先是成群结队，然后越过边界，在加糖上成群结队地补充卡纳霉素。结果表明，两种菌株在相同的时间到达边界（未显示数据），表明从相同的接种点蜂拥而至的比率相似。然而，在右侧（抗生素）室的交叉是轻微的，但持续大于抑制器在20μg/mL卡纳霉素（图4）。两种菌株之间的差异更明显，为40μg/mL卡纳霉素。这些数据共同表明，在2006年，恢复软糖板（图1D）的活力的rsB突变，在蜂拥而至期间对抑制菌株的抗生素耐药性产生负面影响（图4）。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61364/61364fig01.jpg"> 图1:软性气动性测定和抑制器耀斑的出现。 板包含 LB 凝固与 0.3% w/v agar. 大肠杆菌 菌株在每个板的中心接种，在30°C孵育为8小时，C，这是孵育为16小时（A）野生型 大肠杆菌 （AW405）。（B） 缺乏运动性变体∆yhjH ∆ycgR （JP1442）。（C） 与 B 一样，孵化时间较长。箭指向在不断扩大的游泳殖民地的外围环上出现的移动速度更快的"火焰"。（D） 从 C 中的耀斑中分离出来的抑制器。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/61364fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61364/61364fig02.jpg"> 图2:用于设置过境板检测的示意图。 （A） 将 30 mL 的蜂群阿加（使用所需的抗生素）倒入分隔的培养皿的右室，直到与塑料分隔器平起平去，并允许用盖子封闭。（B） 用 30 mL 的游泳填充左室，或将水彩团填充到塑料分隔器顶部的接触点。（C） 使用无菌移液器尖端轻轻地将熔融的群状水准拖过边界，从而将两侧与一座 1 毫米高的阿加桥连接起来，并允许盖上盖子。（D） 允许板在室温下进一步干燥过夜，然后用所需的应变给左室接种疫苗，并在 30 °C 下孵育<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/61364fig02large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61364/61364fig03.jpg"> 图3:通过细胞系绳技术测量的各种菌株的运动特性。 野生型 （AW405），∆yhjH （VN133），∆ycgR ∆yhjH （JP1442），其抑制器 （JP1836） 生长在 LB 在 30 °C 到中指数阶段之前系绳。（A） 每分钟旋转（完成 360° 转弯），和（B） CW偏置 （时间电机在 CW 方向旋转的分数）。平均值的标准偏差（±）。在每个菌株中观察到20个系绳细胞60秒。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/61364fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61364/61364fig04.jpg"> 图4:过境分析。 野生大 肠杆菌 （AW405）和抑制突变体（JP1836）的中指数相培养物在含有群介质的分隔板左侧的指示位置（*）接种，并在30°C下孵育。 他们在相当的时候到达了边界。板块再孵育6小时，在此期间，蜂群越过右室，在室内，媒体补充了卡纳霉素（Kan;数字表示μg/mL）。板块代表三种生物复制品，每个复制品在三重体中进行。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/61364fig04large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充图1:为细胞系绳准备室幻灯片。 （A） 在（B） 之前放下两块双面胶带 ， 用剃须刀刀片修剪多余的胶带。（C） 剥去顶层，在（D）将盖唇贴上并轻轻按压到位置（由 [ 指示]）之前露出粘合剂，确保所有空气被推出盖唇和下面的胶带之间的界面。（E） 负载样品（如图所示，带有DNA加载染料 +30% v/v 甘油， 0.25% w/v 溴酚蓝色，0.25% w/v 二甲苯氰醇添加到创建通道（箭头）的顶部，而（F）渴望清洁的组织任务擦拭，以帮助绘制溶液通过腔室，因为组织吸收液体（箭头）在通道中，并绘制它通过。 <a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/61364supfig01.jpg" target="_blank">请点击这里下载此图。</a>
视频1:系绳大肠杆菌细胞的旋转。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/Video_1.m4v" target="_blank">请点击这里下载此视频。</a>
视频2:一个活跃的大肠杆菌群在60倍放大倍数下拍摄，展示了其在移动前边缘后的旋转运动特征。<a href="https://cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61364/Video_2.m4v" target="_blank">请点击这里下载此视频。</a>

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Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

许多细菌使用旗菌驱动的活力来导航他们的环境，并单独和集体殖民有利的环境。这里展示的是使用三种既定的方法，利用动感作为选择工具，以确定有助于游泳和蜂拥而至的活力的组件/路径。

通过在系列中应用三种既定技术，调查大 肠杆菌 的弗拉盖拉驱动的动性

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

7.5K 次观看.  The University of Texas at Austin. 许多细菌使用旗菌驱动的活力来导航他们的环境，并单独和集体殖民有利的环境。这里展示的是使用三种既定的方法，利用动感作为选择工具，以确定有助于游泳和蜂拥而至的活力的组件/路径。

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Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method allows for tuning the speeds in situ without the need to manufacture new samples to reach different desired speeds. Moreover, this method enables the dynamic control of speed. Cycling the temperature leads the fluids to flow fast and slow, periodically. This controllability is based on the Arrhenius characteristic of the kinesin-microtubule reaction, demonstrating a controlled mean flow speed range of 4&#8211;8 &#181;m/s. The presented method will open the door to the design of microfluidic devices where the flow rates in the channel are locally tunable without the need for a valve.

The goal of this protocol is to use temperature to control the flow speeds of three-dimensional active fluids. The advantage of this method not only allows for regulating flow speeds in situ but also enables dynamic control, such as periodically tuning flow speeds up and down.

使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速

We present a method for using temperature to tune the flow speeds of kinesin-driven, microtubule-based three-dimensional (3D) active fluids. This method ...

科研

工程学

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

一个微流体装置量化细菌趋稳定的浓度梯度

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

生物学

Quantifying Bacterial Surface Swarming Motility on Inducer Gradient Plates

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of induced swarming motility, specific concentration&#160;of an inducer may not be able to report events occurring within the optimal concentration range to elicit the desired responses from a species. Semisolid plates containing multiple concentrations are commonly used to investigate the response within an inducer concentration range. However, separate semisolid plates increase variations in medium viscosity and moisture content within each plate due to nonuniform solidification time.
This paper describes a one-step method to simultaneously test surface swarming motility on a single gradient plate, where the isometrically arranged test wells allow the simultaneous acquisition of multiconcentration responses. In the present work, the surface swarming of Escherichia coli K12 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 were evaluated in response to a concentration gradient of inducers such as resveratrol and arabinose. Periodically, the swarm morphologies were imaged using an imaging system to capture the entire surface swarming process.
The quantitative measurement of the swarm morphologies was acquired using ImageJ software, providing analyzable information of the swarm area. This paper presents a simple gradient swarm plate method that provides qualitative and quantitative information about the inducers&#39; effects on surface swarming, which can be extended to study the effects of other inducers on a broader range of motile bacterial species.

Here, we describe the use of inducer gradient plates to evaluate bacterial swarming motility while simultaneously obtaining multiple concentration responses.

量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动

Bacterial swarming motility is a common microbiological phenotype that bacterial communities use to migrate over semisolid surfaces. In investigations of ...

生物化学

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

抽动运动功能的可视化和表征的角色的<em&gt; PilG</em&gt;在<em&gt;叶缘焦枯病菌</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

免疫与感染

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

生物工程

在水凝胶基质中生物打印细菌，用于研究运动和生长

3D Printing Bacteria to Study Motility and Growth in Complex 3D Porous Media

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. However, the majority of previous work has focused on studies of cells in bulk liquids or at flat surfaces, which do not fully recapitulate the complexity of many natural bacterial habitats. Here, this gap in knowledge is addressed by describing the development of a method to 3D-print dense colonies of bacteria into jammed granular hydrogel matrices. These matrices have tunable pore sizes and mechanical properties; they physically confine the cells, thus supporting them in 3D. They are optically transparent, allowing for direct visualization of bacterial spreading through their surroundings using imaging. As a proof of this principle, here, the capability of this protocol is demonstrated by 3D printing and imaging non-motile and motile Vibro cholerae, as well as non-motile Escherichia coli, in jammed granular hydrogel matrices with varying interstitial pore sizes.

作者聚焦:研究 3D 水凝胶基质中的细菌生长

This protocol describes a procedure for three-dimensional (3D) printing of bacterial colonies to study their motility and growth in complex 3D porous hydrogel matrices that are more akin to their natural habitats than conventional liquid cultures or Petri dishes.

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

Bacteria are ubiquitous in complex three-dimensional (3D) porous environments, such as biological tissues and gels, and subsurface soils and sediments. ...

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans constitute a strain-specific barcode. The associated glycans show higher diversity in sugar composition and structure than those of eukaryotes and are important in bacterial-host recognition processes and interaction with the environment. In pathogenic bacteria, glycoproteins have been involved in different stages of the infectious process, and glycan modifications can interfere with specific functions of glycoproteins. However, despite the advances made in the understanding of glycan composition, structure, and biosynthesis pathways, understanding of the role of glycoproteins in pathogenicity or interaction with the environment remains very limited. Furthermore, in some bacteria, the enzymes required for protein glycosylation are shared with other polysaccharide biosynthetic pathways, such as lipopolysaccharide and capsule biosynthetic pathways. The functional importance of glycosylation has been elucidated in several bacteria through mutation of specific genes thought to be involved in the glycosylation process and the study of its impact on the expression of the target glycoprotein and the modifying glycan. Mesophilic Aeromonas have a single and O-glycosylated polar flagellum. Flagellar glycans show diversity in carbohydrate composition and chain length between Aeromonas strains. However, all strains analyzed to date show a pseudaminic acid derivative as the linking sugar that modifies serine or threonine residues. The pseudaminic acid derivative is required for polar flagella assembly, and its loss has an impact on adhesion, biofilm formation, and colonization. The protocol detailed in this article describes how the construction of null mutants can be used to understand the involvement of genes or genome regions containing putative glycosyltransferases in the biosynthesis of a flagellar glycan. This includes the potential to understand the function of the glycosyltransferases involved and the role of the glycan. This will be achieved by comparing the glycan deficient mutant to the wild-type strain.

Here, we describe the construction of null mutants of Aeromonas in specific glycosyltransferases or regions containing glycosyltransferases, the motility assays, and flagella purification performed to establish the involvement and function of their encoded enzymes in the biosynthesis of a glycan, as well as the role of this glycan in bacterial pathogenesis.

产生空突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动中的作用

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

准备，成像和定量的细菌表面运动性测定

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

通过在系列中应用三种既定技术，调查大肠杆菌的弗拉盖拉驱动的动性

摘要

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此视频中的章节

使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速

一个微流体装置量化细菌趋稳定的浓度梯度

量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动

抽动运动功能的可视化和表征的角色的

用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

产生空突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动中的作用

准备，成像和定量的细菌表面运动性测定

通过在系列中应用三种既定技术，调查大 肠杆菌 的弗拉盖拉驱动的动性

摘要

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使用温度控制基于微管的3D活性流体的流速

一个微流体装置量化细菌趋稳定的浓度梯度

量化诱导剂梯度板上细菌表面聚集运动

抽动运动功能的可视化和表征的角色的

用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

3D打印细菌研究复杂3D多孔介质中的运动和生长

产生空突变体以阐明细菌糖基转移酶在细菌运动中的作用

准备，成像和定量的细菌表面运动性测定

通过在系列中应用三种既定技术，调查大肠杆菌的弗拉盖拉驱动的动性