我们的方法使用主机范围选择和荧光标记，在各种细胞类型中高效无缝地生成重组病毒。该技术将同源重组的速度与瞬态显性选择的无疤痕性质相结合。此外，我们托管范围选择，以消除化学诱发变化的可能性。
这种方法还可用于修改瓦奇尼亚病毒或其他痘病毒，以表达异种基因，例如，生成疫苗。如果您仅使用荧光选择执行此协议，则必须确保筛选的病毒足以检测相对罕见的不 PKR 选择性压力的重组剂。此方法依赖于荧光标记的增益和丢失，以成功选择已获得重组盒的病毒，并检测具有无疤痕重组的病毒。
为了生成重组载体，首先将17微升DNase无水、每个底面的1.2微升、5x PCR反应缓冲液的5微升、模板DNA和0.5微升DNA聚合酶添加到每安培的PCR管中。添加额外的无德纳塞水，使每个管的最终体积达到50微升。将管子放入热循环器中。
在98摄氏度下熔化DNA30秒，然后使用25轮三步PCR协议。要可视化 1%agarose 凝胶上的扩增产品，请向每个井中加入 10 微升每个 DNA 产品和 2 微升的加载缓冲液。以每厘米八伏运行凝胶一小时。
在运行结束时，使用脱氧核糖核酸凝胶提取套件，根据制造商的协议凝胶净化每个安培。用 50 微升的 DNase 无水和立即离心从柱上挖出安普利森。要使克隆载体线性化，首先在37摄氏度下将1微克的载体、17微升的DNase无水、2微升的反应缓冲液和1微升的EcoRI添加到管中，进行一小时的孵育。
在孵育结束时，将线性化载体10微升的DNase自由水和10微升的DNA组装主混合物添加到每个分离的安培体中。在孵化结束时，添加0.2个picomoles。在50摄氏度下孵育样品一小时。在孵化结束时，根据标准协议，用两个微升的组装产品将化学合格的大肠杆菌进行转化。
板 100 微升转化细胞到 LB agarose 板上， 每毫升安他西林补充 100 微克。在37摄氏度下过夜孵育后，选择分离良好的菌落在Luria肉汤中接种，并在37摄氏度和每分钟225转的一夜之间每毫升安霉素100微克补充。第二天早上，使用质粒微型组件套件来隔离质粒。
并在分光光度计上检查DNA的浓度和纯度。对于重组病毒生成，感染一个合适的细胞的汇合单层与病毒重新组合在一个六井板中的一个感染的多重。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育受感染的细胞一小时。
在孵化结束时，用新鲜的DMEM更换每一个井中的上经剂，并按照制造商的协议使用市售的转染试剂。向每一井添加三微克的重组向量。将板放在培养箱中，额外放置 48 小时。
在将每个转染条件的细胞汇集到单独的 1.5 毫升管中之前。然后冷冻三次池细胞，然后以50%的振幅对所得的乳酸盐进行15秒的声波化。接下来，连续10倍稀释声波化的利沙酸盐，从10至第一至10至第六浓度新鲜DMEM，并添加1毫升每稀释到蛋白质激酶R能力细胞系的个别汇合井。
将细胞放在细胞培养箱中一小时，然后用新鲜培养基取代上位，将细胞返回到细胞培养箱。24 至 48 小时后，通过荧光显微镜识别重组病毒。由于mCherry-E3L融合基因的整合，重组病毒的斑块表达红荧光。
斑块在野生型RK13细胞上三次净化重组病毒。经过三轮斑块纯化后，用斑块的序列稀释菌斑菌感染RK13+E3L+K3L细胞。要识别折叠的病毒，使用配备GFP和RFP滤波块的适当成像系统进行荧光显微镜。
然后斑块纯绿色VC-R4，或无色E3L斑块在RK13+E3L+K3L细胞上三次。确保没有斑块发红。感染细胞与至少100个斑块形成单位，以增加你识别无色斑块的机会。
在极少数情况下，可能需要多轮感染。蛋白质激酶R RK13细胞中的红色荧光斑块是mCherry-E3L病毒表达的指标。在RK13+E3L+K3L细胞中只表达eGFP的无色斑块或斑块证实了mCherry-E3L选择标记的崩溃。
重组病毒VC-R4，缺乏两种蛋白质激酶R拮抗剂不能在蛋白激酶R能力RK13细胞中复制，而表观的病毒VP872，表示E3L是复制能力。为了确认这种无法在RK13细胞中复制，仅是由于E3L的丢失，增强型GP被VC-R4病毒中的E3L所取代。它使用相同的选择协议生成相关病毒。
有趣的是，在制造这种病毒时，在选择RK13+E3L+K3L细胞之前，在选择通常需要选择无疤痕重组剂时，会识别到与mCherry-E3L选择标记折叠一致的无色斑块。可能是因为 mCherry-E3L 重组盒和插入 VC-R4 的 E3L 基因之间的扩展序列标识。平均而言，12.6%的后代病毒与转染质粒进行了重组，与先前报告的频率相似。
在这里，无色斑块相对于总斑块的频率RK13+E3L+K3L细胞，表明塌陷率和mCherry-E3L选择标记的丢失发生在大约1.8%的频率。在第一阶段使用PKR功能细胞确保所有含有重组病毒的斑块。在第二阶段使用PKR缺陷细胞，可以检测重组病毒与崩溃mCherry-E3L位点。
这种方法使我们能够快速生成含有外源基因的病毒，例如，疫苗生产提供不同病毒PKR拮抗剂的表达。促进分析不同宿主与PKR的物种特定相互作用。
