基于阻抗的癌细胞迁移和入侵的实时测量

使用该协议，细胞迁移和入侵可以在实时条件下揭开，使细胞动力学在基因功能和药物的损失或增益下能够确定。与其他方法不同，无需染色、机械细胞损伤或荧光标记。最重要的是，实时细胞动力学可以有效地确定。

当 U-118MG 细胞系培养达到 70 至 80% 汇合时，用 PBS 清洗细胞，然后再用两毫升 0.5% 的 trypsin-EDTA 处理细胞。在37摄氏度下30秒后，停止与10毫升新鲜培养剂的反应，将分离的细胞转移到15毫升锥形管中。计数后，通过离心收集细胞，并在6倍10至第五个细胞中重新暂停，每个条件浓度在适当的新鲜介质体积。

将六乘10至第五细胞转移到每个条件的一个微离心管中，并在每个管中加入800微升Dulbecco的PBS。离心后，将每个颗粒重新在60微升的再增缓冲液R和6微摩尔的siRNA中重新分配。在电波每个电池悬架的 10 微升等同与三个 10 毫秒 1，350 伏脉冲电波之前，用轻轻的敲击混合每个管。

每次治疗后，将每个条件的电分细胞汇集在新鲜培养培养的五毫升等分中。然后将细胞种子化为两个35毫米培养皿，并在细胞培养培养箱中放置三天。在实时细胞分析前五到六个小时，将实时细胞分析系统放入细胞培养箱。

要建立入侵测定，使用反向移液剂将50微升DMEM，每毫升细胞外基质凝胶0.1微克，放入细胞入侵板的上腔的每个井中。电镀后，立即从每井中取出30微升的细胞外基质溶液，将板放入细胞培养箱4小时。为了建立阻抗测量程序，在测量前六小时，用低血清介质替换所有电分细胞培养物中的介质。

在相关阻抗测量软件中的"布局"选项卡下，为每个生物条件选择四重井。在"计划"选项卡下，以一分钟间隔设置一次基线测量扫描步骤，并设置第二步以测量实际实验各个支架中的单元阻抗。在细胞阻抗测量开始前一小时，加入160微升的介质，辅以10%的胎儿牛血清作为化疗物进入细胞入侵和迁移板的下腔。

要测量入侵，组装包含细胞外基质凝胶涂层孔的上腔。要测量迁移，请使用上室中的未涂层孔。对于任一类型的实验，在上腔室中用 50 微升低血清介质填充孔，然后将腔室放入系统的底座中。

单击软件中的"消息"选项卡，确定控制单元是否识别所有油井。如果消息按预期显示，则底座中的板已准备就绪，可以进行实验。然后将完全包装的板放入细胞培养箱中，在实时细胞分析系统摇篮中放置一个小时，使板适应细胞培养条件。

当板是平衡的，收获胶质母细胞细胞，如证明，并重新从每个条件细胞在8倍10至第五细胞每800微升低血清中浓度。此外，在两毫升培养基中留出三倍至第五细胞，在 35 毫米的培养皿中播种，用于下游西方印迹分析。要测量迁移前的基线读数，在适应结束时，请单击"底座开始"按钮。

获得基线测量后，将迁移和入侵板从各自的底座转移到生物安全柜中。反向移液器 100 微升细胞成四联上室井，每个生物条件在适当的孔的细胞入侵和迁移板，如在摇篮的控制单元编程。播种后，将板在室温下放在生物安全柜中 30 分钟，使细胞均匀地沉淀在板底上，然后再将板转移到各自的底座上。

单击底座"开始"按钮开始测量电池阻抗。若要在实验期间或之后以时间相关的方式将单元格阻抗的变化可视化为单元格索引，请打开"数据分析"选项卡。要单独或单独可视化每个相应条件的数据和/或标准差，请单击平均值和标准偏差的选项框。

要将单元格索引数据导出到电子表格文件，请将光标放在数据分析窗口的中间并右键单击。在显示的对话框中，选择将数据复制到列表格式选项，然后将数据粘贴到打开的电子表格中。要释放实验，请单击每个底座中的"释放"按钮。

Crk 适配器蛋白击倒将 Crk1 和 Crk2 蛋白质水平分别降低 85% 和 86%，而不诱导 Crk 样蛋白水平。Crk 样蛋白的敲击使 Crk 样蛋白表达减少 85%，Crk1 和 Crk2 蛋白质水平略有降低。将 siRNA 组合将 Crk1、Crk2 和 Crk 样表达式减少 80% 以上，而 Vinculin 和 alpha-Tubulin 表达式均不受 Crk 或 Crk 样敲击的任何组合的影响。

人类脑胶质母细胞瘤细胞沿着梯度迁移，以回应高血清浓度达到13小时最大迁移水平。在 Crk 击倒细胞中，虽然迁移最初被推迟，但细胞继续迁移到 23 小时。Crk 样敲击显著减少细胞迁移，胶质母细胞瘤细胞系完全失去其迁移能力，在敲击 Crk 和 Crk 样时，Crk 和 Crk 样在癌细胞迁移中起到重要的重叠作用。

然而，当细胞入侵监测数天，Crk击倒细胞达到类似的最大水平细胞入侵相比，控制胶质母细胞瘤细胞在60小时与克克样细胞部分恢复其入侵能力90小时和双克克-克克细胞显示在40小时后入侵能力下降。研究结果明确支持了在实验的整个期间对细胞入侵进行分析的建议。播种正确的细胞数量和避免气泡，同时记录细胞外基质进行入侵测定和播种细胞是本实验成功的关键点。

遵循类似的程序，但使用电子板，细胞粘附和细胞增殖动力学可以确定。