此协议可用于确定表示 NF-kappa-B 荧光酶处理机的单元格中 NF-kappa-B 激活的变化。此技术的主要优点是，它允许高吞吐量筛选导致 NF-kappa-B 激活变化的因素或条件。NF-kappa-B 是各种细胞过程的转录因子。
NF-kappa-B 的一个众所周知的功能是诱导各种细胞因子和化疗素的表达来诱导炎症反应。我们的实验室对由病原体沙门氏菌引起的NF-kappa-B的诱导特别感兴趣。在这里，我们使用与NF-kappa-B荧光酶记者质粒稳定地转染的 HeLa 细胞系。
其他细菌，甚至病毒或化合物，可用于此细胞系研究NF-kappa-B的激活。如果您可以在该细胞系中引入这样的 NF-kappa-B 荧光酶研究者质粒，也可以使用其他细胞系。首次这样做的人可能有问题，正确使用无菌技术，这是细胞培养和细菌工作所需的。
细胞刺激前一天，去除 HeLa 57A 细胞的生长培养培养，这些培养培养已发展到约 75% 的汇合。用一毫升0.05%的三辛EDTA清洗细胞。用另一毫升的尝试性EDTA代替，将烧瓶转移到37摄氏度的培养箱中5分钟。
细胞从烧瓶分离后，将它们悬浮在生长介质的10毫升中。将10微升的细胞悬浮液与10微升的 Trypan 蓝色，移液器上下混合，并将10微升转移到细胞计数器幻灯片。使用细胞计数器对悬浮细胞进行计数，并使用生长介质将细胞稀释至最终浓度为 2.5 倍，每毫升 50 毫升的 5 个细胞。
将 250 微升的电池悬浮液转移到 48 井板的每个井中。定期封顶并转动锥形管，以确保均匀的细胞悬浮液。轻轻敲击一侧的板，确保电池在井中均匀分布。
在5%的二氧化碳培养箱中将电池转移到37摄氏度，让细胞在一夜之间附着并生长。将沙门氏菌冷冻库存到 LB 阿加盘上， 以产生单一菌落。将板转移到37摄氏度的培养箱，并允许过夜生长。
第二天，在无菌细菌培养管中加入三毫升LB，并在介质中加入适当的抗生素。使用无菌接种循环，从条纹细菌培养物中选取单个菌落，然后触摸环到 LB 介质。接种后盖住管子并丢弃回路。
将管子放在37摄氏度和180 RPM的摇晃培养箱中，然后让细菌在一夜之间生长。早晨，从孵化器中检索隔夜细菌培养物。通过添加三毫升新鲜 LB 和抗生素，为亚栽培准备管子。
将30微升的隔夜细菌培养剂转移到新鲜准备的介质中。将管子放在37摄氏度的摇晃培养箱中，放置3小时。经过三个小时的孵育，将一毫升无菌LB汤转移到塑料盒中，作为空白。
将 900 微升 LB 转移到用于样品分析的其他铜质中。将 100 微升细菌亚培养剂转移到含有 900 微升 LB 的培养盒中，并上下移液器多次混合。对每次细菌悬浮重复。
打开分光光度计，测量波长为 600 纳米的细菌培养物的光学密度。将空白放在分光光度计中。记下方向。
合上盖子，按分光光度计上的空白按钮，获得背景吸收。将空白的 cuvette 替换为同一方向的样品 cuvette，然后按读。记录这些样本的 OD600 值。
将值乘以 10 以考虑稀释系数。将悬浮液稀释 1 至 10 的 cuvette 并测量吸光度，该值应提供大约 0.1 的值，该值大致对应于每毫升 9 CFU 的 1 倍 10。在一个新的管子中，将稀释的亚栽培的适当体积添加到新鲜LB中，以达到每毫升8CFU的悬浮量1倍至8CFU，用作孵化剂。
通过将 50 微升细菌悬浮液转移到含有 450 微升无菌 PBS 的管中，准备对阴离子的连续稀释，直到每毫升进行约 100 CFU 的最终稀释。将两个最低稀释液（每毫升100和1000 CFU）的100微升转移到两个LB加糖板，并用细胞扩散器将悬浮液与单菌落扩散开来。这些板转移到37摄氏度的孵化器，并在一夜之间孵育。
第二天，计算菌落并计算初始孵化菌的细菌浓度，以确定实际的孵化浓度。在同一天，根据每个井的感染条件标记板盖，每个条件以三次三合一方式完成。将10微升的注射剂加入适当的油井，在未受感染的控制井中加入10微升的无菌LB。
要同步感染时间，请将板放在桌面离心机中，并在 500 次 G 下旋转五分钟，确保板得到平衡。然后，将受感染的细胞转移到37摄氏度的5%二氧化碳培养箱中一小时。将含有一个等同细胞培养培养素的15毫升圆锥管放在37摄氏度的水浴中，供下一步使用。
感染一小时后，从水浴中取出含有细胞培养的15毫升圆锥管，然后用70%乙醇擦拭外部。将组织培养板从培养箱转移到生物安全柜。使用无菌提示从油井中吸气介质，并更换 250 微升新鲜、温暖的细胞培养介质。
将板返回 5%二氧化碳培养箱，温度为 37 摄氏度，再多加热 4 小时。之后，从二氧化碳培养箱中取出板，从井中吸出介质。对于荧光素酶分析，向井中加入100微升1X细胞解液缓冲液。
将板转移到负80摄氏度的冰柜中，孵育至少30分钟，以确保高效的细胞解解。然后，将含有冷冻细胞的板在长凳上解冻，并根据制造商的建议准备荧光素酶基板试剂。允许荧光素酶基板试剂与室温均衡。
接下来，打开板读卡器并打开相应的读卡器程序。将机器设置为测量发光。将每个细胞的 10 微升来化样到不透明的 96 井板的井中。
使用多通道移液器，将 50 微升的荧光素酶测定试剂添加到不透明板的每个井中。轻轻敲击侧面的板，以混合孔，并确保底部表面覆盖着液体。将板放在板读卡器中并启动读数。
将发光值复制到电子表格程序中并绘制结果。该协议侧重于使用 NF-kappa-B 依赖性荧光酶报告器激活转录因子 NF-kappa-B，该报告器被稳定地转染到一行 HeLa 细胞中。此图显示了感染沙门氏菌病菌株的 HeLA 57A 细胞中 NF-kappa-B 依赖性荧光酶活化和 IL6 基因表达的代表性实验。
感染野生型SL1344菌株诱导在RLU和IL6表达强烈的荧光素酶信号，这是减少在细胞感染的siPB sopE2三重突变体，并减少到控制水平与sipA sopB sopE2 sopE四重突变体。进行串行稀释和电镀时，请密切注意。这将确保您的菌株具有一致的疫苗。
在确定导致NF-kappa-B活化和mRNA表达下游变化的因素后，西方印迹技术可用于识别蛋白质表达的变化。该协议使我们的实验室不仅能够评估沙门氏菌引起的NF-kappa-B活化，还能够评估与NF-kappa-B活化有关的其他化合物和蛋白质。沙门氏菌是一种人类病原体。
处理这些细菌时，使用适当的 PPE。
