我们的环境中含有大量的EDC化学品，主要是雌激素物质。属于该组的物质的化学多样性使其测试变得困难，因为检测需要不同的方法。根据化学结构，很难确定一种物质是否真的能够作为雌激素工作。
此外，这些物质永远不会以纯形式存在于环境中，因此它们的影响也可能受到其他化合物的影响。这个问题可以通过效果辩证法来解决，如使用生物监测器，生物基器生物体，显示雌激素效应。众所周知，某些基因对生物体中的雌激素有敏感反应。
通过分子方法检测基因产品也可以在蛋白质或mRNA水平上，但通常涉及动物的牺牲。动物保护法越来越严格，对替代测试系统的需求也越来越大。交叉遗传技术代表了这一发展的可能性，随着荧光蛋白的发现，生物标志物的产生方式已经铺平。
通过这种激活的雌激素敏感基因的帮助可以在体内测试。在这段视频中，一种使用vtg:1mcherry转基因斑马鱼胚胎的可能方法正在展示中，用于在两种化合物的帮助下测试雌激素物质。该协议可以作为研究不同化学或环境样品对生物标志物胚胎的雌激素效应的背景。
实验中使用的斑马鱼线是一条维泰洛根因记者转基因斑马鱼线。该线是使用 Tol2 Transposon 系统创建的。用于开发使用的转基因结构具有长天然维泰洛根因-1启动子序列，具有大量的ERI边。
性成熟女性荧光信号的表达是连续的。然而，在雄性胚胎中，它只出现雌激素物质的行为或存在，因此后者更适合测试。该线的胚胎的灵敏度和可用性已经在几个雌激素化合物以及环境样品上进行了测试。
所有活的动物实验都按照匈牙利《动物福利法》进行，所有研究在动物达到自由喂养阶段之前完成。用系统水填充交配罐，并设置鱼在收获鸡蛋之前交配。将雄鱼和雌鱼放入鱼缸中，并在分压器的帮助下将它们分开。
当第二天早上灯打开时，从储罐上拆下分压器。每 15 到 20 分钟检查一次交配罐中的鸡蛋。使用茶过滤器或密密麻麻的细网收集所有胚胎，并将它们与 E3 缓冲液或透明系统水组合成一个大的培养皿。
将胚胎放在设定为25.5摄氏度的培养箱中。一到一个半小时后，在解剖显微镜下用塑料转移移液器取出并丢弃未受精的或分不充分的鸡蛋。将选定的胚胎放在处理容器中，例如在培养皿或组织培养板中，这些培养板已经标记并填充了不同浓度的测试物质。
在25.5摄氏度下孵育胚胎，直到实验结束。如有必要，请刷新测试溶液以保持治疗浓度。更换测试溶液时要小心，以免损坏胚胎。
事先准备 4% 的冰毒与 ms 222。将五天大的幼虫放入每个处理组五厘米的培养皿中，并配以塑料移液器。用塑料移液器从幼虫中去除处理溶液，然后用两毫升0.02%ms 222麻醉液填充培养皿。
用 4% 的冰毒 222 填充特别设计的 10 厘米 Petri 盘的每个正方形。将麻醉的幼虫转移到两个方块中的一个用一点水。从第一个方块，将幼虫转移到第二个方块。
在第二个正方形中，旋转并定向幼虫到其左侧，然后轻轻地按到底部，用微加载器移液器尖端切割到两厘米。为了评估表示者的信号，在相同的视图和设置中对胚胎进行图像图像。将培养皿放在显微镜的舞台上。
聚焦胚胎的肝脏，并使用相关软件捕捉明亮的场图像。将显微镜切换到 mCherry 过滤器，并使用相关软件在荧光灯下拍摄肝脏的荧光图像。重复前两个步骤，直到捕获实验中的所有胚胎。
打开 ImageJ，然后通过拖放图像或单击"文件打开"来上传要分析的荧光图像。单击"图像、颜色、分割通道"，根据 RGB 颜色图表拆分由荧光滤镜制作的图像。使用红色通道图像频谱。
关闭其他通道。在图像中指定一个大小类似的椭圆区域，这样完整的信号不会干扰评估。使用椭圆形工具尽可能准确地在高亮的肝脏区域上绘制椭圆。
如果信号弱，使用光微图像，荧光图像的亮场对，以确定肝脏的位置。单击"分析"，"测量"确定信号强度和影响区域的大小。集成密度值由图表中的软件列自动计算。
继续分析，重复前面的步骤，直到分析治疗组中所有胚胎的所有荧光图像。保存数据，然后分析集成密度值。在实验中，生物标志物斑马鱼系的雌激素敏感胚胎被处理为0.5和8微莫浓度的α-和β-泽拉莱诺，或ZOL，受精长达5天。
我们调查了在实验结束时，由于物质，鱼的肝脏中是否出现荧光信号，以及这两种物质的雌激素是否存在差异。根据荧光图像和综合密度值对结果进行了评价。在α-ZOL的情况下，在最高测试浓度下，所有个体死亡。
因此，在这种情况下，荧光信号无法检查。在较低的浓度下，可以在胚胎的肝脏中观察到强烈的荧光信号。荧光信号的强度和照明区域的大小没有显著差异。
综合密度值和治疗之间也没有显著差异。在β-ZOL治疗期间没有死亡率。该物质诱导所有治疗浓度中的转基因活性。
荧光信号强度的增加，以及荧光图像中发光区域的大小，随着浓度的增加而观察到。通过检查 beta-ZOL 的集成值，还可以发现此更改。最低和最高处理浓度之间的平均综合密度值几乎翻倍。
然而，在β-ZOL的情况下，我们并没有发现单个浓度的集成密度值之间有显著差异。通过检查从两种物质的相同处理浓度中获得的集成密度值，可以说，α-ZOL在每种情况下都给出了比β-ZOL更高的综合密度平均值，这与荧光图像中观察到的信号强度之间的差异是一致的。这种差异在所有浓度上都有显著差异。
使用生物农药作用雌激素效应在毒理学研究中一直在蔓延。几种显示雌激素效应的转基因线也来自斑马鱼，其中vtg:1mCherry被用于我们的研究。此处描述的方法说明了测试这条线的胚胎的可能方案，以便允许在纯制剂的情况下在体内检测雌激素活性。
必须指出，就胚胎而言，转基因的表达，类似于内源性维泰源素的产生，表现出较大的分散性，在设计实验时应考虑到个体敏感性的差异。确定治疗浓度的一个重要方面是胚胎细胞，包括肝细胞，可能因高浓度的剧毒物质而受损，这可能导致葡萄激素诱导下降。因此，测试应在浓度低于L-C 10时进行。
根据计划的测试终结点和要测试的样本，可以在许多点中更改此协议。它可以通过其他测试方法完成，例如分子方法。因此，我们希望使用vtg:1mCherry线将作为雌激素测试的模型出现，也可以成为标准化测试方法的模型。
