恒流中原发性人类内皮细胞的肺炎球菌感染

使用这种内皮细胞培养系统，使血液流动中的情况能够同化。在这种情况下，我们可以分析细菌感染过程，也包括识别细菌载体和细胞载体参与这个过程。这项技术为探索细菌感染对血管完整性的影响铺平了道路，也包括对形态形成机制、炎症反应和免疫调节的影响。

这种技术需要一些特殊的处理内皮细胞，因此视觉描述比仅仅口头解释更好。此方法提供了与内皮细胞分化、伤口愈合、肿瘤发生和血管生成相关的其他几个研究领域的见解。其中一个关键步骤是标准化细胞培养以及准确处理原发内皮细胞。

这种技术需要一些特殊的细胞培养处理，不能仅仅通过口头解释来清楚。首先，使用干净的长凳在无菌环境中工作。使用移液器将 2% 无菌过滤的猪凝胶 PBS 溶液的 100 微升注入温度平衡通道滑轨的单一储液罐中。

将明胶涂层通道滑道滑盘放在薄聚苯乙烯或发泡胶板上，用一毫升 Luer 注射器防止滑动温度下降，将每毫升 HUVEC 悬架的 4 倍至第 5 个 5 微升添加到幻灯片中，以播种和培养 HUVEC。在37摄氏度和5%的二氧化碳下，用HUVEC孵育通道滑梯60分钟。之后，用 60 微升 ECGMS 介质填充通道滑轨两端的每个介质储液罐。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下再孵育一小时。接下来，要调整微流体泵，首先将平衡灌注装置连接到泵单元，填充13.6毫升的ECGMS介质，然后启动泵控制软件。在流体单元设置的菜单中，使用向下滚动窗口选择适当的灌注集和室滑梯类型。

在软件中选择每平方厘米 0.007 dyne 秒，用于中等粘度。在孵化器外，将装满干燥二氧化硅珠的玻璃瓶连接到气压管。在软件菜单中选择流量参数，将压力设置为 40 毫巴，然后通过启动连续介质，用液体介质冲洗泵管。

我们使用亚氟增长的 HUVEC 确保电池紧密连接，并专注于将气泡从系统中吸出，以及为泵系统使用独立的电源。点击油管连接以清除气泡，并确保泵系统中没有气泡循环。要连接通道滑轨，请停止泵控制软件中的流量循环，通过夹在 Luer 连接附近的管来保持中流量和灌注管。

连接通道滑轨，避免气泡。在泵控制软件高级选项卡中，使用软件工具循环创建者对所需的剪切应力循环进行流量培养编程。规划流转的剪切应力水平，并开始长期灌注。

从每平方厘米5个迪恩开始，相当于每分钟5.44毫升的流速，持续30分钟，然后以每平方厘米10迪恩的剪切应力，对应于每分钟10.85毫升的流速。控制平衡储液罐泵送。将带连接通道滑道的流体单元在 37 摄氏度和 5% 的二氧化碳下放在培养箱中。

启动显微镜软件控制，通过选择适当的过滤器设置，调整荧光显微监测的原理设置。要进行显微可视化，请将流体单元放入 37 摄氏度的加热室中。将通道幻灯片放在预谋显微镜的舞台上。

在注射组胺和细菌对流循环之前，控制细胞形态和HUVEC层的完整性。保持流设置。通过注射口将100毫摩尔组胺溶液的136微升注入灌注管中循环的ECGMS介质，诱导VVF从内皮活的帕拉德体释放。

对于多聚 VWF 字符串的免疫荧光检测，将 20 微克 VWF 特异性 FITC 结合抗体注入 200 微升 PBS 的体积中，注入循环的 13.6 升 ECGMS 介质中。要量化在 HUVEC 细胞表面生成的 VWF 串上的肺炎球菌附着，使用注射端口将每毫升 RFP 的 1.35 倍 10 至第八 CFU 注射，以最大体积一毫升表示肺炎球菌。选择 63X 油浸膜用于显微镜放大，并调整显微镜软件中的荧光滤光片设置到 RFP 通道，使用 540 纳米检测过滤器检测 RFP 表达肺炎球菌。

为了量化对 VWF 字符串的细菌附着，请创建至少 30 个代表性字段视图的 Z 堆栈的快照，每个视图包含大约 10 个形态完好无损的 HUVEC，并计算肺炎球菌的数量。在免疫荧光染色前进行固定后对细菌的附着进行评估，停止流动，从泵库中去除10毫升的ECGMS介质，并加入10毫升PBS，并辅以5%的甲醛，然后按照手稿进行。在该协议中，主要实验步骤从原发内皮细胞的预培养开始，以亚致化细胞培养瓶。

然后将细胞播种到明胶涂层的通道幻灯片中。细菌生长在农业板上，随后在复杂的液体中到中原相中培养。对于微流体细胞培养，带内皮细胞的通道滑道连接到泵系统的流体单元的灌注管，并承受细胞分化的恒定流动。

VWF 弦的生成是由组胺注射引起的，其剪切应力为每平方厘米 10 dyne 秒，并使用 FITC 标记的 VWF 特异性抗体通过免疫荧光检测进行微观监测。在将红色荧光蛋白注入循环介质后，在450纳米的荧光发射中，将肺炎球菌附着在VVF串上，实时显微地可视化。使用PFA固定细胞后，差分免疫荧光染色提供特定感染时间点的细菌附着的可视化效果。

此程序最重要的步骤是通过调整生理剪切应力水平并避免极端的泵压波动，确保幻灯片表面的紧密电池附件。除了微观可视化外，该技术还可用于研究新型抗感染药物的药理作用，并分析血管感染过程的长期后果。该泵系统通过气压对细菌病原体进行吸气，以防止通过气溶胶传播。

建议遵循生物安全预防措施。