改进小RNA-seq:减少偏差，更好地检测2'-O-甲基RNA

小RNA调节许多生物过程。因此，必须开发敏感和公正的方法来检测它们。我们的协议协议为实现这个目标提供了前进的步骤。

我们的协议比传统的小型RNA库侵占方法具有更少的偏置问题，重要的是它允许对两个爪或中下RNA进行更灵敏的检测。如植物微RNA。根据标准方案提取总RNA后。

在 200 伏特下预运行 15%TBE 尿素凝胶 15 分钟。在5至15微升体积中混合5至20微克总RNA，在200微升管中混合同等体积的甲酰胺加载染料。在65摄氏度下5分钟后，在带加热盖的热循环器中，立即将管子放在冰上，将管子装载，并在凝胶上取样，并在它们之间至少带一条通道。

然后以 200 伏电压运行凝胶，直到布罗莫酚迁移了凝胶长度的三分之二。要加载RNA，首先用21个量表针刺穿无核酸酶底部0.5毫升微离心管，然后将穿刺管放在无核酸酶无圆底部两毫升微型离心管中。接下来，在室温下用核酸凝胶污渍在水中孵育凝胶十至十五分钟，然后再在转光器上观察凝胶。

切出17至29个核苷酸梯带之间的样品RNA，将凝胶片转移到被刺穿的管中。以最大速度在微型离心机中旋转凝胶两分钟，并取出现在应该为空的 0.5 毫升管。在碎凝胶中加入300微升无核酸酶0.3摩尔氯化钠，并在室温下将管子放在旋转器上至少两个小时。

在孵化结束时，将碎凝胶片悬浮液转移到旋转柱上，并在微型离心机中以最大速度离心两分钟。对于未基接的三个主要适配器消除，彻底混合十微升无核酸酶与提取的RNA样品，并加入六微升的三摩尔醋酸钠与混合。在样品中加入40微升磁纯珠，60微升异丙醇，彻底混合。

并在室温下孵育悬浮液五分钟。在孵化结束时，将样品放在磁性机架上，直到溶液变得清晰。去除透明上清剂，在珠子中加入180微升新鲜准备好的80%乙醇。

30 秒后，取出乙醇并短暂旋转管。清除管底上可能收集的任何残留液体，让珠子干燥两分钟，然后将样品重新悬浮在 22 微升的 10 毫摩尔三升中。两分钟后，将样品磁化，直到溶液看起来清晰。

接下来，在一个新的管子中，将20微升的透明上清物与6个三摩尔醋酸钠的微升混合，并加入40微升磁珠和60微升100%异丙醇。在室温下五分钟后，将样品磁化，直到溶液看起来清晰，然后取出上清液。用180微升新鲜制备的80%乙醇处理样品30秒，然后取出从样品中旋转的乙醇，并去除管底积聚的任何残留液体。

让珠子干燥两分钟后，在10微升无核酸水中重新悬浮两分钟，然后对样品进行磁化，直到溶液变得清晰。然后，将9微升上流液转移到新管中，并在样品中加入1个T4RNA连结酶缓冲液的微升，以及1个微升水。对于凝胶纯化，在原生6%TBE凝胶上运行5、10和20微升PCR产品约一小时。

在水中用核酸凝胶染色孵育完成的凝胶十至十五分钟，并在转光器上查看凝胶，以便提取 150 基对库带。由于很难隔离代表他们的 150 基对带，因此这些是我们的库，因为存在紧密迁移的侧产品，您需要非常小心地切割凝胶。然后像刚刚演示的分离RNA。

对于原始序列文件修改，请下载在排序运行期间生成的 fastq 序列文件，并可根据需要使用 bcl2fastq2 进行预制。使用 cutodapt 删除适配器序列，并使用演示的命令。使用 seqtk，如前所述，删除序列读取中的终端随机核苷酸。

然后按指示使用 awk 命令丢弃小于 10 个核苷酸的序列。要映射修剪的序列，请打开 miRBase 并下载成熟的 fa 文件。使用指示命令将 U 残留物替换为 T 残留物，以生成数据库中来自各种生物体的所有微 RNA 的完整列表。

选择感兴趣的生物体的微型RNA序列，并指示命令，并使用bowtie2将读取映射到文件，不允许不匹配。使用该工具将序列读取与数据库对齐，要求读取完全映射到数据库的微 RNA，并如前所述存在任何不匹配。然后使用 命令丢弃未对齐的读取。

如所证明，在将越来越多的PCR放大库加载到凝胶上后，可以提取与预期尺寸对应的产品。洗脱后，净化库可以在毛细管凝胶电泳芯片上检查。除了预期的150个碱基对产品，以及130个与适配器二元相对应的碱对品种的比例增加外，通常观察到PCR产品加载量增加。

当使用试剂盒或其他试剂的试剂从合成小型RNA组合中构建库时，也获得类似的结果。为了进行比较，显示了以前发布的相同小RNA混合物的结果。此处显示了协议 TS5 的性能与用于检测人类未修改的标准 TS 协议和两个主要 O-methal 改性植物微RNA的比较。

还测试了在人体样品中检测出两个主要O-methal改性piRNA。正如观察的，TS5在检测两个主要 O-methal RNA 方面比 TS 好得多，但对于未修改的RNA则不强。在不同的日期为每个示例准备复制库。

通常，同时制作的复制之间几乎没有差异，或者不同日期准备的图书馆之间可能存在很大差异。